一种细胞色素P450单加氧酶突变体及其在羟化甲基吡嗪化合物中的应用

本发明涉及酶工程，尤其是指一种细胞色素p450单加氧酶突变体及其在羟化甲基吡嗪类化合物中的应用。

背景技术：

1、羟化反应是一种重要的c-h活化反应，具有较高的原子经济性，可以实现从惰性c-h合成具有更高附加值的羟基化合物。细胞色素p450单加氧酶(p450)被誉为自然界的万能催化剂，能高效、高选择性地催化种类繁多地具有复杂骨架有机化合物地氧化反应。近年来，利用p450单加氧酶催化c-h键活化的研究越来越多。

2、吡嗪作为一类芳香化合物，很难通过亲电取代引入新的官能团。当吡嗪分子含有甲基侧链时，甲基上的氢原子的活性显著提高，有助于增强该类分子在药物、材料等领域中的应用。例如2，5-二甲基吡嗪(dmp)作为一种高附加值烷基吡嗪化合物，在食品和制药领域具有重要的应用价值。作为一种重要的医药中间体，其甲基可以被羟基化生成5-甲基吡嗪-2-甲醇，通过进一步羧化反应可以合成5-甲基吡嗪-2-羧酸。产物5-甲基吡嗪-2-羧酸(mpca)是一种米白色固体结晶，在医药工业领域有着广泛的用途，主要用于合成第二代磺脲类降血糖药物格列吡嗪、新型抗高血压药物阿西莫司以及抗结核药物5-甲基吡嗪-2-羧酸甲酯等药物。

3、目前合成5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法有化学合成法和生物催化法两种。化学法主要有分子间环合法、吡嗪侧链多步合成法、直接氧化法和电化学法这四条合成路线，但它们都存在反应条件要求高、生产成本大、产物收率低、污染环境等问题。而生物催化法具有环境友好、催化效率高、合成工艺简单等绿色生物制造的典型特征，已发展成为医药化工领域替代或拓展传统化学合成的首要选择，发展前景巨大。

4、2012年，郑裕国等从土壤中筛选到一株恶臭假单胞菌，以对二甲苯为唯一的碳源和诱导剂，利用该菌株进行5-甲基吡嗪-2-羧酸的生物制备，经过补料发酵产率可达到75.6％，产物浓度为20.41g/l，周期长达22天。2017年，丰婧等公开了一种酶法生产5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法，所述的酶为醛脱氢酶或醛脱氢酶的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白，以5-甲基-2-吡嗪醛为反应底物，催化反应12h，得到产物5-甲基吡嗪-2-羧酸的最终浓度为17.02mm。该方法无需外源添加对细胞有毒害作用的二甲苯进行诱导培养，使反应过程更加简便，传质速率快。2020年，顾刘燕等通过克隆来源于恶臭假单胞菌(atcc 33015)的四段基因xylm、xyla、xylb和xylc，在大肠杆菌e.coli中构建5-甲基吡嗪-2-羧酸的全细胞催化路径，其中xylm和xyla编码xmo，xylb和xylc分别编码badh和bldh。通过调节不同基因的拷贝数来调控各组分蛋白的表达量，实现反应过程的优化，最终产量达到11.6g/l。同年，曹艳丽等通过利用bacillus subtilis 168外源表达不同微生物种属来源的l-苏氨酸脱氢酶挑选出2，5-dmp高产菌株。在此基础上构建了一株高产2，5-dmp的基因工程菌株，该菌株以l-苏氨酸为发酵底物，发酵24h后2，5-dmp的产量高达616.04mg/l。

5、综上，生物催化法的现有技术多是以2，5-二甲基吡嗪为起始底物，由二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶、苯甲醛脱氢酶三步催化后合成5-甲基吡嗪-2-羧酸。然而，目前已知的二甲苯单加氧酶均为膜蛋白，其催化活力严重依赖磷脂，且存在产能低、生产成本高、周期长等缺陷。

6、因此，生产工艺简单、绿色、环保且高效的5-甲基吡嗪-2-羧酸的生产方法亟待开发。

技术实现思路

1、为解决现有技术缺陷，本发明提供了一种细胞色素p450单加氧酶突变体及其在羟化甲基吡嗪类化合物中的应用，实现了细胞色素p450单加氧酶对其催化活力从无到有的突破。

2、本发明通过以下技术方案实现：

3、本发明第一个目的是提供一种细胞色素p450单加氧酶突变体，所述细胞色素p450单加氧酶突变体的氨基酸序列如seq id no.2所示。

4、本发明第二个目的是提供一种编码所述的细胞色素p450单加氧酶突变体的基因，核苷酸序列如seq id no.1所示。

5、本发明第三个目的是提供一种携带所述基因的表达载体。表达载体可通过本领域常规方法将上述细胞色素p450单加氧酶突变体基因克隆到各种表达载体上构建而成。所述的表达载体较佳地包括本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，所述载体优选地为pet28a质粒。

6、本发明第四个目的是提供一种表达所述的细胞色素p450单加氧酶突变体的重组菌。重组菌是通过将上述表达载体转化至宿主细胞中制备得到。宿主细胞为本领域常规的宿主细胞，只要能满足重组表达载体可稳定的自行复制，并且其所携带的细胞色素p450单加氧酶突变体基因可被有效表达即可。所述宿主细胞优选为大肠杆菌，更优选地为：大肠埃希氏菌e.coli bl21(de3)或大肠埃希氏菌e.coli dh5α。

7、本发明第五个目的是提供所述的细胞色素p450单加氧酶突变体在羟化甲基吡嗪类化合物中的应用，所述应用的方法包括以下步骤：

8、在缓冲液中，以甲基吡嗪类化合物为底物，以所述细胞色素p450单加氧酶突变体为催化剂进行羟化反应生成相应的醇类物质。

9、在本发明的一个实施例中，所述甲基吡嗪类化合物选自2-甲基吡嗪、2，3-二甲基吡嗪、2，5-二甲基吡嗪和2，6-二甲基吡嗪中的一种或多种。

10、在本发明的一个实施例中，所述甲基吡嗪类化合物的添加量为10mmol/l～100mmol/l。

11、在本发明的一个实施例中，所述缓冲液的ph值为7.5-8.5，优选为8.0。

12、在本发明的一个实施例中，所述羟化反应是在葡萄糖脱氢酶和nadp+存在的条件下进行。

13、所述nadp+的添加量为0.1mmol/l～1mmol/l；所述葡萄糖脱氢酶的添加量为0.1g/l～2g/l。

14、在本发明的一个实施例中，所述羟化反应的温度为25℃～30℃；所述羟化反应的时间为6h～24h。

15、在本发明的一个实施例中，所述的细胞色素p450单加氧酶突变体的添加形式为含有细胞色素p450单加氧酶突变体的粗酶液；所述细胞色素p450单加氧酶突变体的添加量为1ku/l～10ku/l。

16、本发明至少具有以下优点：

17、本发明提供了一种细胞色素p450单加氧酶突变体及其在羟化甲基吡嗪类化合物中的应用。本发明提供的细胞色素p450单加氧酶突变体l76s/a83e对甲基吡嗪类化合物表现出羟化活力，反应转化率大于等于95％，实现了野生型p450对其催化活力从无到有的突破。因此，本发明所述的细胞色素p450单加氧酶及其基因具有很好的工业应用开发前景。

技术特征：

1.一种细胞色素p450单加氧酶突变体，其特征在于，所述细胞色素p450单加氧酶突变体的氨基酸序列如seq id no.2所示。

2.一种编码权利要求1所述的细胞色素p450单加氧酶突变体的基因。

3.一种携带权利要求2所述基因的表达载体。

4.一种表达权利要求1所述的细胞色素p450单加氧酶突变体的重组菌。

5.权利要求1所述的细胞色素p450单加氧酶突变体在羟化甲基吡嗪类化合物中的应用，其特征在于，所述应用的方法包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述甲基吡嗪类化合物选自2-甲基吡嗪、2，3-二甲基吡嗪、2，5-二甲基吡嗪和2，6-二甲基吡嗪中的一种或多种。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述甲基吡嗪类化合物的添加量为10mmol/l～100mmol/l。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述羟化反应是在葡萄糖脱氢酶和nadp+存在的条件下进行。

9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述羟化反应的温度为25℃～30℃；所述羟化反应的时间为6h～24h。

10.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的细胞色素p450单加氧酶突变体的添加形式为含有细胞色素p450单加氧酶突变体的粗酶液；所述细胞色素p450单加氧酶突变体的添加量为1ku/l～10ku/l。

技术总结本发明涉及一种细胞色素P450单加氧酶突变体及其在羟化甲基吡嗪类化合物中的应用，属于酶工程技术领域。本发明提供的细胞色素P450单加氧酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明提供的细胞色素P450单加氧酶突变体L76S/A83E对甲基吡嗪类底物表现出羟化活力，反应转化率大于等于95％，实现了细胞色素P450单加氧酶对其催化活力从无到有的突破。因此，本发明所述的细胞色素P450单加氧酶及其基因具有很好的工业应用开发前景。技术研发人员：许国超,李钰雯,倪晔,李赟高,郭宏明受保护的技术使用者：江南大学技术研发日：技术公布日：2024/6/18