代谢性脂肪性肝病多基因检测试剂盒及遗传风险评估系统

本发明涉及基因组学和预防医学领域，具体涉及一种代谢性脂肪性肝病多基因遗传风险评分及其应用。

背景技术：

1、非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,nafld)已成为中国乃至全球的重要健康问题之一。据报道，中国成年人肝脏脂肪变性和进展期肝脏纤维化的患病率分别为44.39％和2.85％(gastroenterology 2023；165:1025-1040)，发病率达到47.3/1000人年(lancet gastroenterology&hepatology 2022；7:851-861)。代谢性脂肪性肝病(metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease,masld)是nafld的新命名法，强调代谢心血管危险因素在脂肪性肝病中的作用。masld与进展期肝脏纤维化、肝硬化、肝细胞癌以及全因和心血管疾病死亡风险升高存在关联(journal of hepatology2021；75:1284-1291)。

2、masld是由遗传和环境因素共同引起的复杂疾病。现有全基因组关联研究(genome-wide association study,gwas)已确定几十个与masld相关的遗传易感基因，以及数百个与masld相关表型有关的遗传基因，包括体质指数(body mass index,bmi)、2型糖尿病(type2diabetes,t2d)、血压(blood pressure,bp)、总胆固醇(total cholesterol,tc)、甘油三酯(triglycerides,tg)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoproteincholesterol,ldl-c)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,ldl-c)等。基于单一表型遗传变异计算得到的多基因遗传风险评分(polygenetic riskscore,prs)预测疾病遗传风险的精度往往存在不足。近年来，多基因遗传风险综合评分(meta-polygenetic risk score,metaprs)在传统prs的基础上，通过有效整合疾病多个亚表型prs，能够进一步提高遗传风险的预测精度、改善风险分层，已在冠心病和缺血性脑卒中等心血管疾病中得到了较好的应用(european heart journal 2022；43:1702-1711；neurology 2021；97:619-628)，但在其他疾病中的研究应用仍有限。脂肪肝是机体代谢紊乱(如胰岛素抵抗)在肝脏的表现，因此，通过整合masld相关表型遗传变异，构建masld多基因遗传风险综合评分，有望改善masld的风险分层，并确定可能从生活方式干预中获益最大化的个体。

3、然而，几乎所有现有masld遗传风险评分都是基于欧洲人群构建，且其在欧洲人群中对masld的风险预测能力有限，未能观察到其在健康生活方式与masld发病的保护性关联中的效应修饰作用(metabolism 2023；146:155643)。此外，由于遗传变异频率、效应和连锁不平衡的种族差异，欧洲人群中开发的prs在非欧洲人群中的应用具有局限性。因此，亟需在东亚人群中开发masld的metaprs，并在一般人群队列中严格评估其遗传风险预测价值，以改善masld的风险分层，指导精准预防。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种masld基因检测试剂盒、一种masld风险评估系统、以及一种masld遗传风险评估方法，以实现快速、准确、低成本的大规模masld及其相关肝纤维化的遗传风险评估与高风险人群筛查。

2、本发明目的通过以下技术方案来实现：

3、本发明的第一方面，提供了一种masld基因检测试剂盒。本试剂盒可同时对masld相关的90个单核苷酸多态性位点(snp)进行检测分型，包括肝脂肪化及其相关代谢表型的snp位点(其中部分snp位点涉及多种代谢表型)，如下所示：

4、肝脂肪化相关单核苷酸多态性位点：rs10500212、rs12077210、rs1337101、rs17216588、rs17598226、rs3747207、rs429358、rs56094641、rs58542926、rs7029757、rs73001065、rs738408、rs738409、rs8107974、rs9922619；

5、体质指数相关单核苷酸多态性位点：rs10083803、rs1019240、rs10269783、rs10438964、rs1048932、rs10824218、rs11001963、rs11134999、rs11223204、rs114964326、rs11628702、rs117435593、rs11881883、rs12094437、rs12375196、rs12692738、rs13002767、rs139887373、rs1421085、rs1433980、rs1459843、rs148535477、rs1870931、rs1947043、rs2016469、rs2233598、rs2307111、rs2404324、rs2425841、rs2547033、rs28394227、rs28482847、rs2861685、rs350832、rs3751837、rs3957285、rs429358、rs4477562、rs4516268、rs4625852、rs4877313、rs51195、rs512921、rs55853915、rs56360953、rs61791109、rs6597653、rs6751993、rs6843852、rs7132908、rs71495049、rs7161194、rs72838588、rs796915、rs8011566、rs8029980、rs869400、rs9299、rs9579775、rs9630985；

6、2型糖尿病相关单核苷酸多态性位点：rs10512861、rs10513801、rs11205760、rs11257655、rs12463617、rs12597579、rs1558902、rs174546、rs17843797、rs261967、rs2820443、rs4757391、rs58542926、rs6093446、rs663129、rs738409、rs769449、rs9299、rs9568867；

7、血压相关单核苷酸多态性位点：rs1558902、rs174546、rs9568867；

8、低密度脂蛋白胆固醇相关单核苷酸多态性位点：rs174546；

9、高密度脂蛋白胆固醇相关单核苷酸多态性位点：rs10513801、rs11205760、rs11257655、rs12463617、rs12597579、rs1421085、rs17843797、rs261967、rs2820443、rs58542926、rs6093446、rs663129、rs738409、rs9568867；

10、总胆固醇相关单核苷酸多态性位点：rs738409；

11、总甘油三酯相关单核苷酸多态性位点：rs11257655、rs12463617、rs174546、rs2820443、rs58542926、rs6093446、rs663129、rs738409、rs9568867。

12、该试剂盒还包括用于扩增90个snp位点的90对pcr扩增引物对以及用于鉴定90个snp位点的90条延伸引物，序列具体如下表1和表2所示，扩增引物序列方向均为5’端至3’端，涉及的snp位置信息来自人类参考基因组hg37，rs编码来自db156。

13、表1

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17、表2

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21、

22、所述试剂盒采用飞行时间质谱仪进行检测。首先利用扩增引物(见表1)通过多重pcr在一个体系内同时扩增目标序列，然后加入snp序列特异延伸引物(见表2)，在snp位点上，延伸1个碱基。将制备的样品分析物与芯片基质共结晶后在质谱仪的真空管经强激光激发，核酸分子解吸附为单电荷离子，电场中离子飞行时间与离子质量成反比，通过检测核酸分子在真空管中的飞行时间而获得样品分析物的精确分子量，从而检测出snp位点信息。

23、本发明的第二方面，提供一种masld遗传风险评估系统和方法。所述masld遗传风险评估系统包括：采集模块，用于采集研究对象的dna样本，可以包括采集dna样本的器械或设备；检测模块，用于对dna样本的masld相关的90个snp位点进行检测分型，可以包括如上所述的masld基因检测试剂盒和质谱设备；评估模块，包括计算机或其他计算设备，用于运行一种基于多基因风险评分的masld遗传风险评估模型，根据检测模块获得的研究对象的基因分型，计算masld多基因遗传风险综合评分metaprs，确定遗传风险等级。

24、进一步的，上述masld遗传风险评估系统还包括健康指导模块，用于评估减重等多种健康生活方式对masld遗传风险的抵消作用，根据研究对象的masld遗传风险等级不同，给予精准预防指导。

25、根据本发明的一个优选方案，所述masld遗传风险评估模型，基于一般人群队列及全基因组关联分析、多基因风险评分及弹性网状logistic回归分析方法，构建适合各人群masld风险预测的最优模型；整合所述90个snp位点的危险等位基因信息和权重来对masld遗传风险进行预测和量化打分。

26、本发明适合于中国人群的masld遗传风险预测模型所包含的特征id、模型权重、危险等位基因信息如具体实施方式中表6所示(涉及的snp位置参考hg37，rs编号来自db156)。

27、使用该masld遗传风险预测模型时，严格根据危险等位基因在基因型中的剂量个数进行编码。例如，rs10500212，正常等位基因为c，危险等位基因为t，基因型cc编码为0，基因型ct编码为1，基因型tt编码为2。

28、根据本发明的一个优选方案，所采用的masld遗传风险等级划分体系通过对masld遗传风险评估模型得到的风险评分进行分组。

29、风险等级分组：以队列人群所有个体metaprs的20％和80％百分位数为切点，划分个体masld遗传风险为低、中、高危人群：等级1：低遗传风险，prs分值<2.36；等级2：中遗传风险，prs分值2.36-2.82；等级3：高遗传风险，prs分值≥2.82。从等级1到等级3，表示masld遗传风险逐渐升高，与低遗传风险者比较，中、高遗传风险者发生masld的比值比分别为1.50(95％置信区间：1.36，1.66)、1.99(95％置信区间：1.75，2.26)。

30、根据本发明的第三方面，提供一种masld遗传风险评估方法，包括以下步骤：

31、s1：采集研究对象的dna样本；

32、s2：对所述dna样本的上述masld相关的90个snp位点进行基因分型；

33、s3：构建一种基于metaprs的masld遗传风险评估模型和遗传风险等级分级系统，使用所述模型和系统，计算研究对象masld的遗传风险评分和遗传风险等级；

34、s4：依据不同遗传风险与生活方式的交互效应，使用masld风险等级划分体系，根据测试者不同的遗传风险等级，分别给予健康指导建议。

35、步骤s3中，所述masld遗传风险评估模型的构建包括以下步骤：

36、s31：获取研究对象的基线数据(社会人口学特征、行为生活方式、个人和家族疾病史等)；

37、s32：获取研究对象基因分型数据；

38、s33：进行超声检测诊断肝脂肪化和肝纤维化，进行临床指标检测判断代谢表型特征；

39、s34：对收集到的基线数据、基因分型数据、肝脏表型、代谢特征表型数据进行分析，构建基于metaprs的masld遗传风险评估模型。

40、s35：根据最优的prs模型确定受试者不同遗传风险等级，评估健康干预抵消遗传风险的效应，提供健康指导建议。

41、本发明的发明点在于构建了适用于中国成年人的masld遗传风险评分的系统和方法，提供了一种masld基因检测试剂盒，成本较低、准确度较高，可用于大规模人群筛查。本发明的技术方案在具体实践中：(1)建立成年人队列研究：以标准操作程序对17,972名45-95岁社区人群开展流行病学调查，包括问卷调查、体格检查和血生化检测，采集符合标准的血液样本，建立流行病学调查数据库和生物样本库；(2)肝脏与代谢表型的判定：判定masld为在诊断肝脂肪变性情况下同时存在以下至少一个心血管代谢危险因素：①bmi≥23kg/m2或腰围(waist circumference,wc)>94/80cm(男性/女性)；②空腹血糖≥5.6mmol/l或t2d或服用降糖药；③bp≥130/85mmhg或服用降压药；④血浆tg≥1.70mmol/l或服用降脂药；⑤血浆hdl-c≤1.0/1.3mmol/l(男性/女性)或服用降脂药；(3)snp位点的选择：搜索查阅全球肝脏脂肪化及有关代谢表型的gwas研究文献，对已发表的大型gwas meta分析中达到全基因组显著性(p<5×10-8)且与masld关联p值<0.05的150个位点进行基因型检测；(4)基因分型检测：使用针对中国汉族人群定制设计的芯片(affymetrixckb array)进行基因分型；(5)构建metaprs：根据gwas结果数据中提取得到的snp效应值计算得到各亚表型prs后，在数据集中利用弹性网状logistic回归模型获得各个亚表型prs的最佳权重，并进一步将其转化为snp水平的权重，最终以个体携带的危险等位基因数乘以权重之和计算得到masld的metaprs，分析与masld风险是否相关。发现metaprs与masld及masld伴随肝脏纤维化风险显著相关，metaprs每增加1个标准差，对应疾病比值比(odds ratio,or)及其95％置信区间(confidence interval,ci)分别为1.09(1.06，1.13)和1.15(1.08，1.22)。(6)分析健康生活方式对不同遗传风险的抵消效应：对metaprs做进一步分析，metaprs≤2.36为低遗传风险，2.36<metaprs<2.82为中遗传风险，metaprs≥2.68为高遗传风险。在调整地区(10个地区)、性别、年龄、11个遗传主成分、芯片类型后，在低遗传风险者中，相较于坚持很不健康生活方式者，坚持中等健康生活方式和理想健康生活方式者患masld的比值比分别为0.51(0.42，0.62)、0.28(0.18，0.42)，患masld伴肝纤维化的比值比分别为0.43(0.29，0.64)、0.07(0.02，0.31)；在中遗传风险者中，相较于坚持很不健康生活方式者，坚持中等健康生活方式和理想健康生活方式者患masld的比值比分别为0.55(0.48，0.62)、0.22(0.19，0.27)，患masld伴肝纤维化的比值比分别为0.40(0.32，0.50)、0.13(0.09，0.19)；在高遗传风险者中，相较于坚持很不健康生活方式者，坚持中等健康生活方式和理想健康生活方式者患masld的比值比分别为0.54(0.39，0.77)、0.18(0.12，0.27)，患masld伴肝纤维化的比值比分别为0.39(0.21，0.70)、0.11(0.05，0.22)。metaprs与健康生活方式存在显著的交互作用，坚持理想健康生活方式对masld的保护作用在高遗传风险者中最强。

42、本发明的有益效果：

43、本发明提供了适用于我国成年人masld遗传风险评估的系统和方法，提供了一种masld基因检测试剂盒，其优越性在于：

44、本发明基于随访近20年的中国慢性病前瞻性研究第三次重复调查建立的成年人队列。(1)以标准操作程序收集了符合研究对象标准、完成流行病学调查信息、临床信息和血液样本，并对肝脏与代谢表型进行了全面评价，诊断标准符合临床指南。(2)对全球gwas报道的肝脏脂肪化及有关代谢表型的snp按照一定标准(大型gwas meta分析中达到全基因组显著性，即p<5×10-8；与masld关联p值<0.05)，最终选择了90个位点进行基因型检测、分析。(3)利用弹性网状logistic回归模型训练得到各个亚表型prs的最佳权重，综合各个亚表型计算得到与我国人群masld风险高度相关的metaprs。(4)进一步分析了metaprs与不同程度健康生活方式，对masld风险的交互效应，为不同遗传风险等级人群提供分类干预健康指导。

45、在本发明的具体实施方案中，本发明基于中国慢性病前瞻性研究(chinakadoorie biobank,ckb)进行了研究分析。ckb项目于2004-2008年在全国5个城市和5个农村地区招募研究对象，共有512,725名年龄在30-79岁的研究对象签署知情同意书并完成了基线调查，包括问卷调查、体格测量和血标本采集。2020年8月-2021年12月进行了第三次随访重复调查。本发明分别涉及参加基线调查的17,972名研究对象和第三次重复调查的17,759名研究对象。本发明基于90种masld相关基因变异构建了适合东亚人群的masld多基因遗传风险综合评分，并且评估了其与masld及其伴随肝脏纤维化的关系。结果显示，随着metaprs的升高，masld及其伴随肝脏纤维化风险相应升高；评分每升高一个标准差，对应masld及其伴随肝脏纤维化风险的比值比(odds ratio,or)及其95％置信区间(confidenceinterval,ci)分别为1.09(1.06，1.13)和1.15(1.08，1.22)。在验证人群中，metaprs每增加一个标准差，masld和masld伴随肝脏纤维化的or分别为1.18(1.11，1.25)和1.22(1.12，1.33)。进一步调整包括心血管疾病家族史在内的临床危险因素，metaprs与masld患病的or值仅有稍许降低，表明本发明的metaprs可独立于传统临床心血管危险因素之外用于评估masld风险。这项研究的结果具有重要的临床意义。

46、综上所述，本发明发现masld的metaprs与masld及其伴随肝脏纤维化风险呈正相关。当前研究使用90种与masld性状相关的显著遗传变异构建了prs，并通过大样本人群队列数据，全面评估了metaprs与masld风险的关联。结果表明，masld多基因遗传风险综合评分可以预测masld及其伴随肝脏纤维化风险的高低，多基因遗传风险较低个体中的masld及其伴随肝脏纤维化的风险更低，而遗传风险较高个体中的masld及其伴随肝脏纤维化的风险更高。本发明进一步分析了不同程度健康生活方式对不同masld遗传风险的交互效应，为精准开展健康指导提供了有力的科学证据，在masld一级预防方面具有重要的应用前景。