一种放线菌次级代谢产物及其制备方法与应用与流程

(一)本发明涉及微生物，具体涉及一种放线菌次级代谢产物及其制备方法与应用。

背景技术：

0、(二)背景技术

1、天然产物由于其结构新颖、生理活性广泛等特点，一直是药物研发的重要来源。在过去的几十年里，绝大多数抗感染、抗癌和抗菌药物都源于动物、植物、微生物所产生的天然产物及其衍生物。目前，从微生物的次级代谢产物中分离得到了抗氧化、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗炎等具备较强生物活性的天然产物，而其中大多数天然产物的结构都是新颖的，证明了微生物在天然产物发现中具有重要作用，虽然植物中天然产物大量获取时可依靠原材料的积累，受生长周期等影响，但微生物天然产物可通过发酵来累积，也可通过菌株改造来提高产量，且微生物天然产物具有结构多样、选择性和作用方式多样、效力高等优势，被广泛应用于食品工业和医药等领域。

2、链霉菌属作为细菌次级代谢产物的主要来源之一，一直以来被许多研究者作为重点研究对象。近几十年来，越来越多的抗生素被从链霉菌中发现，但随着从链霉菌中分离的活性化合物数量不断累积，重复天然产物的分离使得从链霉菌中发现新颖天然产物变的越来越困难。kutzneria(库兹涅尔氏)菌属作为稀有放线菌属的一种，也有较高的次级代谢潜力。到目前为止，kutzneria菌属仅有11个菌株被报道，然而近几十年来，已经有许多kutzneria菌属产生的具有生物活性的代谢物被鉴定出来，包括一些初级(酚类、邻苯二甲酸酯、脂肪酸甲酯等)和次级代谢物(缩酚肽和大环内酯等)。

技术实现思路

0、(三)技术实现要素：

1、本发明目的是提供一种放线菌次级代谢产物及其制备方法与应用，所述次级代谢产物结构新颖，具有优良的抗菌或抗氧化活性，为制备抗菌剂或抗氧化剂提供新的选择。

2、本发明采用的技术方案是：

3、本发明提供一种放线菌次级代谢产物，所述放线菌次级代谢产物为下列结构所示的化合物1或化合物2：

4、

5、本发明还提供一种放线菌次级代谢产物的制备方法，所述制备方法按如下步骤进行：

6、(1)将放线菌经发酵获得的上清液，用大孔树脂xad 16n吸附后上样层析柱，用甲醇洗脱，收集流出液减压浓缩，得到发酵浸膏；

7、(2)将发酵浸膏用甲醇溶解后，上样反相吸附树脂mci层析柱，用体积比90:10-0:100的水-甲醇梯度洗脱，洗脱速度均为10ml/min，每个梯度洗脱2个柱体积，收集每个梯度的流出液，得到十个馏分，记为fa～fj，其中水-甲醇的体积比为40：60洗脱的流出液为馏分ff；

8、(3)馏分ff上样羟丙基葡聚糖凝胶sephadex lh-20层析柱，采用体积比1:1的二氯甲烷-甲醇等度洗脱，洗脱速度1.5ml/min，洗脱2个柱体积，每40ml流出液收集一次，共收集5个亚馏分，其中第80-120ml流出液记为亚馏分ff3；

9、(4)将亚馏分ff3上样半制备hplc色谱柱，用体积浓度35％的甲醇水溶液洗脱，流速为3.0ml/min，收集保留时间为12.5-15min的组分，获得亚馏分ff3b，保留时间为17.5-20min获得亚馏分ff3c；

10、(5)将亚馏分ff3c上样半制备hplc色谱柱，用体积浓度20％的乙腈水溶液洗脱，流速为3ml/min，收集保留时间为10-11min的组分，减压浓缩至干，获得化合物1；

11、(6)将亚馏分ff3b上样半制备hplc色谱柱，用体积浓度20％的乙腈水溶液洗脱，流速为3ml/min，收集保留时间为24-25min的组分，减压浓缩至干，获得化合物2。

12、进一步，步骤(1)放线菌优选为白色库茨涅尔氏菌(k.albida)jcm 3240。

13、进一步，步骤(1)上清液按如下步骤制备：将放线菌(优选k.albida jcm 3240)冻干粉稀释涂布于gsm(gym streptomyces medium)平板培养基，于30℃恒温培养箱中进行活化，活化后接种于gsm液体培养基中，30℃、180rpm震荡培养至od600在0.4-0.6之间，所得培养物作为种子液；将种子液以体积浓度0.1％接种至gsm液体培养基，30℃、180rpm震荡培养3天后，加入终浓度2mm诱导剂七水氯化镧，30℃、180rpm培养7天；将发酵液25℃、4000rpm离心20min，收集上清液。所述gsm液体培养基组成：4.0g/l葡萄糖，4.0g/l酵母提取物，10.0g/l麦芽提取物，2.0g/l碳酸钙，溶剂为水，121℃下高压蒸汽灭菌20min，冷却后使用。gsm平板培养基组成是在gsm液体培养基中添加15-20g/l琼脂。所述诱导剂七水氯化镧先用水配置26g/l的溶液，然后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌后使用。

14、进一步，步骤(1)发酵浸膏按如下步骤制备：上清液用大孔树脂xad 16n吸附后，用甲醇洗脱，洗脱速度5ml/min，洗脱3个柱体积，收集全部流出液减压浓缩至无液体流出，得到发酵浸膏；所述上清液体积以大孔树脂xad 16n质量计1-3l/g。

15、进一步，步骤(2)用体积比90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100的水-甲醇梯度洗脱。

16、进一步，步骤(4)-(6)所述半制备hplc色谱柱均采用agilent eclipse xdb-c18，9.4×250mm，粒径5μm。

17、本发明还提供一种所述放线菌次级代谢产物在制备抗菌剂中的应用，所述抗菌剂包括耐枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、耻垢分枝杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌剂。所述放线菌次级代谢产物为化合物1。

18、本发明还提供一种所述放线菌次级代谢产物在制备抗氧化剂中的应用，所述抗氧化剂包括abts自由基清除剂，所述放线菌次级代谢产物为化合物2。

19、与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

20、(1)本发明提供的放线菌次级代谢产物由k.albida菌株通过特定的发酵条件分离获得；由于不同的发酵培养基和培养条件会对产生的生物活性次级代谢产物产生显著的影响，本发明通过筛选合适的菌株，优化培养条件，提高了所产生的生物活性次级代谢产物的多样性，从而获得结构新颖的高活性化合物。所述放线菌次级代谢产物制备方法简单、高效，成本低廉，所得产物纯度高。

21、(2)本发明所得生物活性次级代谢产物具有显著的抗菌、抗氧化活性。其中，化合物1具有抗枯草芽孢杆菌，粪肠球菌，耻垢分枝杆菌，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的活性，具备开发为抗菌佐剂的潜力；化合物2具有抗氧化活性，具备开发为抗氧化剂的潜力。

技术特征：

1.一种放线菌次级代谢产物，其特征在于，所述放线菌次级代谢产物为下列结构所示的化合物1或化合物2：

2.一种权利要求1所述放线菌次级代谢产物的制备方法，其特征在于，所述制备方法按如下步骤进行：

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)放线菌为白色库茨涅尔氏菌(k.albida)jcm 3240。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)上清液按如下步骤制备：将放线菌冻干粉稀释涂布于gsm平板培养基，于30℃恒温培养箱中进行活化，活化后接种于gsm液体培养基中，30℃、180rpm震荡培养至od600在0.4-0.6之间，所得培养物作为种子液；将种子液以体积浓度0.1％接种至gsm液体培养基，30℃、180rpm震荡培养3天后，加入终浓度2mm诱导剂七水氯化镧，30℃、180rpm培养7天；将发酵液25℃、4000rpm离心20min，收集上清液；所述gsm液体培养基组成：4.0g/l葡萄糖，4.0g/l酵母提取物，10.0g/l麦芽提取物，2.0g/l碳酸钙，溶剂为水；gsm平板培养基组成是在gsm液体培养基中添加15-20g/l琼脂。

5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)发酵浸膏按如下步骤制备：上清液用大孔树脂xad 16n吸附后，用甲醇洗脱，洗脱速度5ml/min，洗脱3个柱体积，收集全部流出液减压浓缩至无液体流出，得到发酵浸膏；所述上清液体积以大孔树脂xad 16n质量计1-3l/g。

6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)-(6)所述半制备hplc色谱柱均采用agilent eclipse xdb-c18，9.4×250mm，粒径5μm。

7.一种权利要求1所述放线菌次级代谢产物在制备抗菌剂中的应用，其特征在于，所述放线菌次级代谢产物为化合物1。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抗菌剂包括耐枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、耻垢分枝杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌剂。

9.一种权利要求1所述放线菌次级代谢产物在制备抗氧化剂中的应用，其特征在于，所述放线菌次级代谢产物为化合物2。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述抗氧化剂包括abts自由基清除剂。

技术总结本发明公开了一种放线菌次级代谢产物及其制备方法与应用，本发明提供的放线菌次级代谢产物结构新颖、制备方法简单、高效，成本低廉，所得产物纯度高。所得次级代谢产物具有显著的抗菌、抗氧化活性。其中，化合物1具有抗枯草芽孢杆菌，粪肠球菌，耻垢分枝杆菌，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的活性，具备开发为抗菌佐剂的潜力；化合物2具有抗氧化活性，具备开发为抗氧化剂的潜力。技术研发人员：魏斌,董炳城,王鸿,宣琦,俞文超受保护的技术使用者：杭州市滨江区浙工大网络空间安全创新研究院技术研发日：技术公布日：2024/6/18