一种可降解氨基甲酸乙酯的酯酶、表达载体、工程菌及其应用

本发明涉及重组蛋白，尤其涉及一种可降解氨基甲酸乙酯的酯酶、表达载体、工程菌及应用。

背景技术：

1、氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate或urethane,简称ec)，是一种具有遗传毒性及较强致癌性的物质(可以引起肺肿瘤、淋巴癌、肝癌、皮肤癌等)，广泛存在于多种发酵食品(如酱油、食醋、泡菜)和酒精饮料(如黄酒、白酒、葡萄酒等、日本清酒、白兰地)中。人体摄取氨基甲酸乙酯主要是通过饮用酒精饮料和食物。氨基甲酸乙酯已成为影响人类健康的一个不可忽视的因素。采取有效方法消除发酵食品或酒精饮料中的氨基甲酸乙酯迫在眉睫。

2、ec水解酶可直接高效的将ec降解为无毒性的乙醇、氨和二氧化碳，是最有希望彻底解决传统发酵食品及酒精饮料中因ec而存在的食品安全问题的方法。然而目前尚无可有效应用于传统发酵食品及酒精饮料中ec直接降解的酶，主要是目前所发现的ec水解酶均为酰胺酶家族酶类，其生化特性存在重大缺陷：由于尿素与ec分子结构相似，目前所发现的大部分酰胺酶类ec水解酶可同时降解尿素和ec。酒精饮料中尿素(约50mg/l)含量是ec(10-750μg/l)含量的50-1000倍，它们之间巨大的底物竞争导致该类ec水解酶在应用于ec直接降解时效果不佳。因此筛选出不可降解尿素的ec水解酶是解决传统发酵食品及酒精饮料中ec消减瓶颈问题的关键。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提出一种可降解氨基甲酸乙酯的酯酶、表达载体、工程菌及应用，以解决酰胺酶在应用于ec降解时存在的尿素与ec之间底物竞争性问题，为解决发酵食品中ec降解提供新方法。

2、基于上述目的，本发明提供了一种能降解氨基甲酸乙酯的酯酶，所述酯酶的氨基酸序列如seq id no:1所示。该酯酶具有良好的乙醇耐受性。

3、所述酯酶的氨基酸序列是经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸得到的，且编码具有ec降解作用的蛋白质。比如在c端或n端添加或缺失一个或数个氨基酸残基、添加融合标签等，虽然在形式上进行修饰但不改变蛋白的酶活。

4、可选的，编码所述酯酶的基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。

5、可选的，表达该基因的宿主菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、乳酸乳球菌、谷氨酸棒杆菌或酵母菌中的任意一种，其中优选大肠杆菌bl21de3。

6、所述酯酶在本发明的一种实施方式中，是通过全基因合成seq id no:2所示的基因序列，然后将酯酶基因在宿主菌中进行表达而得到的。

7、本发明还提供了含所述可降解氨基甲酸乙酯的酯酶基因的表达载体。

8、本发明还提供了含所述可降解氨基甲酸乙酯的酯酶基因的工程菌。

9、本发明还提供了产所述酯酶工程菌的制备方法，其特征在于包含如下步骤：

10、(1)全基因合成核苷酸序列如seq id no.2所示的酯酶基因est9；(2)将酯酶基因est9连接到载体pet30-a(+)得到重组质粒pet30a-est9；(3)将步骤2获得的重组质粒导入大肠杆菌bl21de3中获得重组大肠杆菌bl21de3(pet30a-est9)，est9基因在重组菌中表达受t7启动子调控；(4)利用重组菌bl21de3(pet30a-est9)发酵生产具有ec水解酶活力的酯酶。

11、所述的表达载体，在本发明的一种实施方式中，可以是市售的质粒、粘粒、噬菌体等经分子生物学技术手段将所述酯酶基因序列连接入而构建而成，其中优选pet30-a(+)。

12、所述重组菌的发酵，可以是：将e.coli bl21de3(pet30a-est9)基因工程菌培养到一定菌体浓度(如od600＝0.6-0.8)，添加诱导剂(如iptg最终浓度为1mm)，培养一定时间(如10-30h)，高效表达可降解ec的酯酶。

13、本发明还提供所述表达载体在降解氨基甲酸乙酯中的应用。

14、本发明还提供所述工程菌在降解氨基甲酸乙酯中的应用。

15、本发明还提供了所述酯酶在发酵食品及酒精饮料中的应用。

16、本发明获得了具有ec降解作用的酯酶，该酶在高浓度乙醇(10％v/v)中仍具有较高的稳定性，使得该酶在应用于传统发酵食品，尤其是低乙醇含量的酒精饮料(如黄酒)中ec降解时具有巨大的潜在应用价值。

17、本发明的有益效果：本发明所获得的酯酶，具有降解氨基甲酸乙酯降解作用，同时在含有高浓度乙醇条件下具有较高的活性，有助于该酶高效的运用于酒精饮料或传统发酵食品中氨基甲酸乙酯的降解。该酶在大肠杆菌中进行表达，重组菌经发酵及细胞破碎后，以ec为底物时酶活达到17.5u/l。该酶经ni-nta亲和层析纯化后，以ec为底物时比酶活力为47.0u/mg。同时酯酶具有较好的乙醇耐受性，在含有10％的乙醇(v/v)条件下，37℃保温1h后依然可以保持37％以上的活性。本发明制备的重组酶为实现传统发酵食品及酒精饮料中ec的消减及ec水解酶的工业化生产奠定基础，具有巨大的经济及社会效益。

技术特征：

1.一种可降解氨基甲酸乙酯的酯酶，其特征在于，所述酯酶的氨基酸序列如seq idno.1所示。

2.根据权利要求1所述可降解氨基甲酸乙酯的酯酶，其特征在于，编码所述酯酶的基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。

3.根据权利要求2所述可降解氨基甲酸乙酯的酯酶，其特征在于，表达所述基因的宿主菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、乳酸乳球菌、谷氨酸棒杆菌或酵母菌中的任意一种。

4.一种含权利要求1所述可降解氨基甲酸乙酯的酯酶基因的表达载体。

5.一种含权利要求1所述可降解氨基甲酸乙酯的酯酶基因的工程菌。

6.权利要求4所述表达载体在降解氨基甲酸乙酯中的应用。

7.权利要求5所述工程菌在降解氨基甲酸乙酯中的应用。

技术总结本发明涉及一种可降解氨基甲酸乙酯的酯酶、表达载体、工程菌及其应用，属于重组蛋白技术领域。该酯酶能够降解氨基甲酸乙酯，同时具有一定的乙醇耐受性。本发明利用大肠杆菌表达系统BL21(DE3)/pET30‑a(+)，成功实现了具有EC水解酶活力的酯酶基因的高效表达及酶蛋白的纯化，纯酶的比酶活力为47.0U/mg。重组酯酶在10％的乙醇中37℃保留1h，以EC为底物时可保留37％以上的酶活力。本发明制备的重组酯酶为未来实现传统发酵食品中EC的消除，实现EC水解酶工业化应用奠定了基础，具有巨大的经济及社会效益。技术研发人员：刘庆涛,朱司宝,钱森和,王天文,汪涵,杨浩,同阿成受保护的技术使用者：安徽工程大学技术研发日：技术公布日：2024/6/18