提质固氮耦合绿色增产ARC微生物菌剂的发酵生产方法

本发明属微生物领域，具体涉及一种提质固氮耦合绿色增产arc微生物菌剂的发酵生产方法。

背景技术：

1、豆科作物主要包括大豆、花生、豌豆、蚕豆、豇豆、苜蓿草等，是人类重要的食物来源与饲料来源。当今世界农业在绿色高质量发展方向上正面临众多的挑战，豆科作物产业发展面临两大共性难题：一是花生、大豆等豆科作物易受剧毒、强致癌性黄曲霉毒素污染，不仅降低质量、损失产量，还严重威胁人民生命健康。以黄曲霉毒素b1为例，其毒性是氰化钾的10倍，被who国际癌症研究机构定为i类致癌物，引发全球人类肝癌占比高达28.2％，新发肝癌病例中我国占到全球接近一半。如何提高豆科作物产品的质量安全和品质水平？一直是豆科农业领域高质量发展热点问题。

2、二是大豆和花生等豆科作物虽有与土壤根瘤菌共生结瘤固氮习性，但自然状态下根瘤数量少，固氮时间短(通常作物生长的第一个月没有结瘤固氮现象，豆科鼓荚期或饱果期时根瘤开始逐渐衰败)、效率低。根瘤菌生物固氮研究已有100多年历史，形成了经典公认的aon理论体系——植物自调控结瘤数量和生长量，并维持总能量守恒，如果要过多的结瘤，那么必然以牺牲植物生长量为代价，现有做法主要是通过筛选和施用适合相应产地环境的优良根瘤菌，在应用上具地域局限性，长期受到aon理论束缚，结瘤固氮效率提升有限，较好的提高约30％左右，难以实现结瘤固氮效率翻番式提升的同时生长量也显著增加(打破aon理论体系)。如何提高花生大豆等豆科作物结瘤固氮效率同样是国际热点前沿难题。

3、针对上述难题，发明人团队历经20多年持续研究，近年来成功研制出提质固氮绿色增产arc微生物菌剂，发明了提质固氮耦合绿色增产arc微生物菌剂的发酵工艺即生产方法，实现了大豆、花生等豆科作物质量提升的同时诱导促进大豆花生高效结瘤固氮效率成倍增产，应用简便、成本低、效益高，具有两固(固氮固碳)、三增(增产增效增安全)、五减(减毒减损减肥减本减碳)的显著特点和巨大应用潜力，已经经过了全国多点大豆、花生、豌豆等豆科作物主产区大田生产试验示范与验证。对推动我国大豆油料产能提升和绿色低碳高效生产具有重大意义。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术存在的不足，提供提质固氮耦合绿色增产arc微生物菌剂的发酵生产方法，其可用于批量生产提质固氮耦合绿色增产arc微生物菌剂，由此生产的提质固氮耦合绿色增产arc微生物菌剂可应用于大豆、花生、豌豆、蚕豆、豇豆等豆科作物生产，实现提质固氮和绿色增产，使用简单，社会和生态效益显著，容易推广应用。

2、为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：

3、本发明一方面提供了提质固氮绿色增产arc微生物菌剂，具有提质固氮和增产作用，使豆科作物产品品质提升，具有调控提高豆科作物根际的根瘤菌丰度、增加豆科作物结瘤数量的作用，含有seq id no.1-4所示的全部4条基因序列。

4、按上述方案，所述的提质固氮绿色增产arc微生物菌剂能够使豆科作物产品品质提升——提高蛋白质、谷氨酸、花生白藜芦醇、大豆异黄酮等营养功能成分中一种或多种的含量。

5、按上述方案，所述的提质固氮绿色增产arc微生物菌剂对花生果腐病、大豆症青、豆科作物白绢病、青枯病、根腐病、菌核病等土传病害中的一种或多种具有减轻作用即防控效果。对花生果腐病、大豆症青、豆科作物白绢病、青枯病、根腐病、菌核病等土传病害中的一种或多种具有危害减轻作用，减轻率可达到至少30％以上，较佳的能达到80％以上。

6、按上述方案，所述的提质固氮绿色增产arc微生物菌剂能够降低花生果表斑点。

7、按上述方案，所述的提质固氮绿色增产arc微生物菌剂显著降低黄曲霉毒素水平，提高质量安全水平。

8、上述提质固氮绿色增产arc微生物菌剂自身不是根瘤菌，但提质固氮绿色增产arc微生物菌剂却能够同时调控提高豆科作物根际的根瘤菌丰度、增加豆科作物结瘤数量，提高单株固氮酶活性。所述的提质固氮绿色增产arc微生物菌剂能够促进花生、大豆等豆科作物早结瘤、延长结瘤固氮时间。所述的提质固氮绿色增产arc微生物菌剂能够提高豆科作物生产的单产水平和总生物量。

9、按上述方案，seq id no.1-4所示的dna序列基因在不同菌株中可能会有一定程度的变异，在变异程度较小，比如不超过10％的碱基变异，优选不超过5％的碱基变异，更优选不超过1％的碱基变异，即同一性90％以上，优选95％以上，更优选99％以上，并具有相应的生物活性功能的情况下，这些称为seq id no.1-4所示的dna序列的功能等价物，含有这些序列等同于含有dna序列1～4的相应序列。微生物菌组合物含有seq id no.1～4所示的dna序列或其功能等价物，并具有提质固氮和增产作用，具有调控提高豆科作物根际的根瘤菌丰度、增加豆科作物结瘤数量的作用的情况下，构成本发明的提质固氮绿色增产arc微生物菌剂。

10、上述dna序列1～4是经过与genbank基因组大数据比对后获得的特异性序列，其与本专利微生物菌剂的作用功能有着直接或间接的相关性，含有上述dna序列1-4的全部基因序列时，具有提质固氮和增产作用，具有调控提高豆科作物根际的根瘤菌丰度、增加豆科作物结瘤数量的作用，构成本发明的提质固氮绿色增产arc微生物菌剂。这些基因在不同菌株中可能会有一定程度的变异，在差异程度较小，比如不超过10％的碱基变异，并能保持相应的生物活性功能的情况下，含有它们等同于含有如seq id no.1-4所示的基因序列。

11、本发明的提质固氮绿色增产arc微生物菌剂为微生物菌组合物，通过微生物菌组合物中的各组配微生物协同作用，发挥提质固氮作用，用于作物生产具有提质固氮和增产作用，具有调控提高豆科作物根际的根瘤菌丰度、增加豆科作物结瘤数量的作用；其自身不是根瘤菌，但能够调控提高豆科作物根际根瘤菌丰度、增加豆科作物结瘤数量，提高单株固氮酶活性；提高豆科作物生产的单产水平和总生物量；能够促进花生、大豆早结瘤、延长结瘤固氮时间，还能够降低花生果表斑点，显著降低黄曲霉毒素水平，提高质量安全水平。

12、上述提质固氮绿色增产arc微生物菌剂可以通过如下方法制备获得，采用组配上述微生物菌剂中的微生物，经发酵途径制备获得。上述发酵途径，可以采用现有技术包括现有文献等记载的已经公开的细菌的常规发酵途径。

13、按上述方案，优选地，所述的提质固氮绿色增产arc微生物菌剂为三种或以上微生物菌的组合。

14、按上述方案，优选地，上述提质固氮耦合绿色增产arc微生物菌剂可以是但不限于如下4株微生物的组合物：保藏编号为cctcc no:m 20231601的侧孢芽孢杆菌、cctcc no:m20231598的解淀粉芽孢杆菌、cctcc no:m 20231595的路德维希肠杆菌、cctcc no:m20231602的胶质芽孢杆菌。

15、侧孢芽孢杆菌，保藏日期为2023年9月4日，保藏编号为cctcc no:m 20231601，分类命名为：brevibacterium lateralis ar1007，保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉，武汉大学。

16、解淀粉芽孢杆菌，保藏日期为2023年9月4日，保藏编号为cctcc no:m 20231598，分类命名为：bacillus amylolyticus ar1004，保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉，武汉大学。

17、路德维希肠杆菌，保藏日期为2023年9月4日，保藏编号为cctcc no:m 20231595，分类命名为：enterobacter ludwigii ar1001，保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉，武汉大学。

18、胶质芽孢杆菌，保藏日期为2023年9月4日，保藏编号为cctcc no:m 20231602，分类命名为：bacillus mucilaginosus ar1008，保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉，武汉大学。

19、按上述方案，优选地，上述提质固氮耦合绿色增产arc微生物菌剂可以是保藏编号为cctcc no:m 20231601的侧孢芽孢杆菌、cctcc no:m 20231598的解淀粉芽孢杆菌、cctccno:m 20231595的路德维希肠杆菌、cctcc no:m 20231602的胶质芽孢杆菌中一株以上的微生物和其他微生物的组合，使得组合后微生物菌剂满足含有如seq id no.1～4所示的核苷酸序列中的全部基因序列或其功能等价物，具有提质固氮耦合作用，具有调控提高豆科作物根际的根瘤菌丰度、增加豆科作物结瘤数量的作用具有提质固氮和增产作用，具有调控提高豆科作物根际的根瘤菌丰度、增加豆科作物结瘤数量的作用，构成本发明的提质固氮绿色增产arc微生物菌剂。

20、按上述方案，上述微生物菌剂中，任意一种菌株在微生物菌剂即混合形成的微生物菌组合物中的活菌数比例大于等于1％。

21、上述提质固氮绿色增产arc微生物菌剂在豆科作物生产上可以有如下用途：用于提升豆科作物产品的品质与安全水平；用于促进豆科作物结瘤固氮；用于提高豆科作物单产水平；用于招募土著根瘤菌，提高豆科作物根根际土壤根瘤菌丰度；促进豆科作物提早结瘤并延长结瘤固氮时间；用于防止豆科作物成熟期脱肥早衰；用于增加豆科作物荚果数量；用于增加豆科作物荚果饱满度，降低瘪荚率；用于促进豆科作物提前开花、提早结荚；用于减轻花生果腐病发生；用于减轻豆科作物青枯病发生；用于减轻豆科作物白粉病发生；用于减轻豆科作物叶斑病发生；用于减轻豆科作物根部线虫病发生；用于减轻豆科作物根腐病发生；用于减轻豆科作物根部线虫病发生；用于减轻豆科作物菌核病发生；用于减轻豆科作物霜霉病发生；用于减轻豆科作物枯萎病发生；用于减轻豆科作物白绢病发生；用于减轻大豆症青发生程度；用于促进豆科作物碳减排，有利于土壤改良；用于促进豆科作物总生物量提高；用于减轻花生果表面斑点，增加商品性；用于促进盐碱地大豆增产；

22、本发明另一方面提供了提质固氮绿色增产arc微生物菌剂的发酵生产方法：依次包括以下步骤：

23、菌株驯化：菌株驯化得到组配提质固氮绿色增产arc微生物菌剂的各个菌株经驯化后的菌液；

24、种子液制备：以组配提质固氮绿色增产arc微生物菌剂的各个菌株经驯化后的菌液制备组配arc微生物菌剂的各个菌株的种子液；

25、发酵生产：由组配提质固氮绿色增产arc微生物菌剂的各个菌株的种子液发酵生产获得组配提质固氮耦合绿色增产arc微生物菌剂的各个菌株的批量发酵液；

26、菌剂组配：将上述组配提质固氮绿色增产arc微生物菌剂的各个菌株的批量发酵液或将发酵生产获得组配提质固氮绿色增产arc微生物菌剂的各个菌株的批量发酵液制备成的菌粉组配得到含有上述菌株的微生物组合物。

27、按上述方案，上述菌株驯化，是指对组配提质固氮耦合绿色增产arc微生物菌剂的各个菌株分别进行驯化，驯化步骤如下：1)将组配提质固氮耦合绿色增产arc微生物菌剂的各个菌株的冻存样品分别接种到含有不低于5％花生粉或豆粉的液体lb培养基中，摇床培养，分别得到上述菌株的零号菌液；2)将上述零号菌液分别划线转接到常规固体lb平板中，置于培养箱培养，获得上述菌株的单菌落；3)从上述lb平板中分别取上述菌株的单菌落，接种到常规细菌液体发酵液中，30～37℃培养15h以上，分别获得上述组配提质固氮耦合绿色增产arc微生物菌剂的各个菌株经驯化后的菌液。

28、按上述方案，驯化步骤中，步骤1)的摇床培养为37℃恒温摇床、转速200r/min条件下振荡培养15h以上；步骤2)的培养为37℃恒温过夜培养。

29、以由保藏编号为cctcc no:mcctcc no:m 20231601的侧孢芽孢杆菌、cctcc no:m20231598的解淀粉芽孢杆菌、cctcc no:m 20231595的路德维希肠杆菌、cctcc no:m20231602的胶质芽孢杆菌组合而成的提质固氮绿色增产arc微生物菌剂为例，驯化步骤如下：1)将上述提质固氮绿色增产arc微生物菌剂的4个组成菌株的冻存样品分别接种到含有不低于5％花生粉或豆粉的液体lb培养中，优选地，37℃恒温摇床、转速200r/min条件下振荡培养15h以上，分别得到上述4个菌株的零号菌液；2)将上述4个零号菌液分别划线转接到常规固体lb平板中，优选地，置于培养箱37℃恒温过夜培养，分别获得上述4个菌株的单菌落；3)从上述lb平板中分别取上述菌株的单菌落，接种到常规细菌液体发酵液中，30～37℃培养15h以上，分别获得上述提质固氮绿色增产arc微生物菌剂4个菌株经驯化后的菌液。

30、按上述方案，上述种子液的制备是：将上述组配提质固氮耦合绿色增产arc微生物菌剂的各个菌株经驯化后的菌液，通过常规种子发酵罐分别进行逐级发酵培养，获得上述组配arc菌剂的各个菌株的种子液。

31、按上述方案，上述发酵生产是：将上述获得的组配提质固氮耦合绿色增产arc微生物菌剂的各个菌株的种子液分别与常规细菌发酵培养基按照体积比1：200～800进行放大发酵生产，温度：30～37℃，罐压：0.03～0.06mpa，起始转速150～300r/min，通气比0.8～1.5v/v·m，发酵15h以上，分别获得组配提质固氮耦合绿色增产arc微生物菌剂的各个菌株的批量发酵液。

32、按上述方案，上述菌粉制备是：采用发酵液喷粉干燥设备，将组配提质固氮耦合绿色增产arc微生物菌剂的各个菌株的批量发酵液分别通过常规喷粉方法，制作成上述arc菌剂4个菌株的菌粉。

33、按上述方案，上述菌剂组配是：将上述组配提质固氮耦合绿色增产arc微生物菌剂的各个菌株的批量发酵液或菌粉按照一定比例混合至均匀，形成含有上述菌株的微生物组合物即提质固氮耦合绿色增产arc微生物菌剂，其可以为液态组合物或者粉状组合物。

34、按上述方案，上述一定比例是指组配提质固氮耦合绿色增产arc微生物菌剂的各个菌株中的任意一种的活菌数比例均不低于1％。

35、按上述方案，上述制备方法还包括剂型制作，所述剂型制作是：将含有组配提质固氮耦合绿色增产arc微生物菌剂的各个菌株的液态组合物即组配提质固氮耦合绿色增产arc微生物菌剂的各个菌株的批量发酵液组配得到的微生物组合物通过添加常规的保护剂，制作成微生物菌剂液体剂型；或者将上述含有组配提质固氮耦合绿色增产arc微生物菌剂的各个菌株的粉状组合物即组配提质固氮耦合绿色增产arc微生物菌剂的各个菌株的批量发酵液制备成的菌粉组配得到的微生物组合物通过添加常规保护剂制作成提质固氮耦合绿色增产arc微生物菌剂粉剂；或者将上述液态组合物或粉状组合物与常规载体混匀后，再通过转鼓造粒等常规手段制作arc微生物菌剂颗粒菌剂。

36、本发明的提质固氮绿色增产arc微生物菌剂发酵工艺可用于提质固氮绿色增产arc微生物菌剂组成菌株的发酵生产、不同剂型提质固氮绿色增产arc微生物菌剂的生产。上述生产的提质固氮绿色增产arc微生物菌剂可以用于大豆、花生等豆科作物生产，一方面能够提升作物品质以及提高作物产品质量安全水平和/或减轻豆科作物病害和/或降低花生果表斑点的危害等，同时能够促进结瘤固氮，提高单产，减少碳排放。

37、本发明有益效果在于：

38、1.提质固氮绿色增产arc微生物菌剂发酵工艺可用于提质固氮绿色增产arc微生物菌剂组成菌株的发酵生产、不同剂型提质固氮绿色增产arc微生物菌剂的生产，应用简便、成本低、效益高；2.提质固氮绿色增产arc微生物菌剂可以用于增加花生、大豆等豆科作物单产水平，通过单项技术实现了提高豆科产品品质以及进一步减轻豆科作物病害和/或提高作物产品质量安全水平和/或降低花生果表斑点的同时诱导促进大豆花生高效结瘤固氮和极显著增产；3.对推动我国大豆油料产能提升和绿色低碳高效生产具有重大意义。