一种鉴别诃子基原的试剂盒及应用

本发明涉及中药鉴别，尤其涉及一种鉴别诃子基原的试剂盒及应用。

背景技术：

1、诃子作为临床中常见的多基原植物中药材，其具有涩肠止泻，敛肺止咳，降火利咽的功效。据2020版中国药典规定，诃子为使君子科combretaceae植物诃子(terminaliachebula)或绒毛诃子(terminalia chebula var.tomentella)的干燥成熟果实，经考证，绒毛诃子是为缓解诃子紧缺、寻求替代药材而发现的新药用资源。然而，尽管诃子和绒毛诃子都为药用诃子的基原植物，但它们的成分含量和药效具有较大差异，例如诃子中没食子酸的含量、诃子鞣酸远大于绒毛诃子，而绒毛诃子中诃子次酸的含量则相对较高。中药所含化学成分的种类和含量是其产生生理活性的决定因素，直接决定了临床用药的安全性和有效性。因此，药用诃子基原植物的鉴定对其临床用药的安全性及有效性具有重要意义。诃子和绒毛诃子的果实外表有很大区别，但微粉化处理后以及进一步加工后则难以通过观察而区分，并且二者所含化学成分的组成相似，含量的不同难以实现准确鉴别，特别是在中成药中的诃子基原则更是难以通过现有方法进行准确鉴别。

技术实现思路

1、针对以上技术问题，本发明提供了一种鉴别诃子基原的试剂盒及应用。本技术提供的试剂盒能够特异性扩增诃子的特征序列，从而实现药材或中成药的诃子基原鉴定。

2、为达到上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：

3、本发明第一方面提供了一种鉴别诃子基原的试剂盒，包括引物对hz-ndhd和引物对hz-its2m中的至少一种，所述引物对hz-ndhd由序列如seq id no.1所示的上游引物和序列如seq id no.2所示的下游引物组成，所述引物对hz-its2m由序列如seq id no.3所示的上游引物和序列如seq id no.4所示的下游引物组成。

4、seq id no.1的序列为：5ˊ-tataatcctccgctagttga-3ˊ；

5、seq id no.2的序列为：5ˊ-ccacgaattattttccttgg-3ˊ；

6、seq id no.3的序列为：5ˊ-gaaccatcgagtctttgaac-3ˊ；

7、seq id no.4的序列为：5ˊ-gtatttgggccatccgtg-3ˊ。

8、以上引物是基于诃子和绒毛诃子的叶绿体基因组经人工设计得到。经理化性质评估，上述引物不容易形成发夹结构和引物二聚体，且退火温度适中，能够确保pcr反应的正常进行。

9、经实验验证，上述引物对的扩增效率和测序成功率均为100％，可用于进行pcr扩增；将扩增所得序列与诃子或绒毛诃子叶绿体基因组特征序列进行比对，即可判断待测物质中诃子的基原。当试剂盒含有上述两对引物对时，将上述引物对分别pcr扩增得到的结果分别进行序列比对，可进一步确保鉴别结果的准确性。

10、由引物对hz-ndhd扩增得到的诃子特征性序列为：

11、gttaatggatcgtccaattggaaatgataagagaatgtataggtcgttaaaaggagctctacagaagctatacatatagtatatattcgaattaccttatttcctctatgaggaagaaagaaaataaaagaacctgccactattggtaaaactacaattatggttaa；

12、由引物对hz-ndhd扩增得到的绒毛诃子特征性序列为：

13、gttaatggatcgtccaattggaaatgataagagaatgtataggtcgttaaaaggagctctaaggaagcaatacatatggtatatattcgaattaccttatttcctctatgaggaagaaagaaaataaaagaacctgccactattggtaaaactacaattatggttaa。

14、由引物对hz-its2m扩增得到的诃子特征性序列为：

15、gcaagttgcgcccgaggcctcggccgagggcacgtctgcctgggtgtcacgcatcgcgttgcctccataccctccacccctcgagcgatgggaggatggtccggaagcggaagctggcctcccgtgaccacgagc；

16、由引物对hz-its2m扩增得到的绒毛诃子特征性序列为：

17、gcaagttgcgcccgaagcctcggccgagggcacgtctgcctgggtgtcacgcatcgcgctgcctccataccctccacccctcgagcgatgggaggacggtccggaagcggaagctggcctcccgtgaccacgagc

18、优选地，所述的试剂盒包括引物对hz-ndhd。以该引物对对诃子进行鉴定得到的基因型更为稳定。

19、优选地，各引物以引物混合液的形式存在，所述引物混合液中各引物的浓度分别为0.5～1.5μl。

20、优选地，所述试剂盒还包括pcr缓冲液、dna聚合酶溶液和模板dna溶液，所述pcr缓冲液中含有镁离子和脱氧核苷三磷酸(dntp)。pcr缓冲液、dna聚合酶溶液均可选择用于pcr扩增的市售试剂，例如，可选用宝日医生物技术有限公司的gflextm buffer和tks gflextmdna polymerase。模板dn a为待测样品的总dna。

21、本发明第二方面提供了上述试剂盒在鉴别诃子基原中的应用。以待测样品的总dna为模板，用上述试剂盒中的引物对进行pcr扩增，根据扩增产物的序列即可对待测样品进行基原鉴别。

22、优选地，该应用的具体步骤包括：

23、s1、提取待测样品的总dna；

24、s2、以所述总dna为模板dna，用上述试剂盒中的引物对进行pcr扩增；

25、s3、对pcr扩增产物进行测序，根据扩增产物的基因序列鉴别待测样品的基原。

26、优选地，所述pcr扩增的反应体系为：

27、

28、所述引物对hz-ndhd的扩增反应条件为：98℃，1min；98℃，10s，49℃，15s，72℃，20s，35个循环；72℃，5min；所述引物对hz-its2m的扩增反应条件为：98℃，1min；98℃，10s，52，15s，72℃，20s，35个循环；72℃，5min。

29、该pcr扩增的反应体系中，模板dna的浓度可根据pcr扩增的效果进行常规调整。

30、当待测样品数量较多时，可通过在pcr扩增前在上下游引物的5’端添加不同序列的tag序列来实现混合样本的检测，简化检测过程，缩短检测时间。

31、本发明第三方面提供了上述试剂盒在鉴定中成药中诃子基原中的应用。以待测中成药的总dna为模板，用上述试剂盒中的引物对进行pcr扩增，根据扩增产物的序列即可对待测中成药进行诃子的基原鉴别。

32、优选地，该应用的具体步骤包括：

33、s1、提取待测中成药的总dna；

34、s2、以所述总dna为模板dna，用上述试剂盒中的引物对进行pcr扩增；

35、s3、对pcr扩增产物进行测序，根据扩增产物的基因序列鉴别待测中成药的诃子基原。

36、优选地，所述pcr扩增的反应体系为：

37、

38、

39、所述引物对hz-ndhd的扩增反应条件为：98℃，1min；98℃，10s，49℃，15s，72℃，20s，35个循环；72℃，5min；所述引物对hz-its2m的扩增反应条件为：98℃，1min；98℃，10s，52，15s，72℃，20s，35个循环；72℃，5min。

40、该pcr扩增的反应体系中，模板dna的浓度可根据pcr扩增的效果进行常规调整。

41、当待测样品数量较多时，可通过在pcr扩增前在上下游引物的5’端添加不同序列的tag序列来实现混合样本的检测，简化检测过程，缩短检测时间。

42、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

43、本发明提供的引物设计合理，能确保pcr扩增反应的顺利进行；扩增序列中的特异性位点稳定存在，在诃子与绒毛诃子的鉴别中准确度高，结果可靠；特异性高，可用于中成药中诃子基原的鉴别。利用本发明提供的试剂盒中的引物对结合上述pcr反应条件，能够快速实现药材或加工品的诃子基原鉴别，结果准确，可用于药材及中成药的质量提升和质量监控，进而为临床用药的安全性和有效性提供更好保障。