一种己二胺高产菌株及其制备方法与流程

本发明涉及生物合成1,6-己二胺，特别涉及一种己二胺高产菌株及其制备方法。

背景技术：

1、目前，有研究利用生物酶催化构建了1,6-己二胺的人工合成途径，例如文献1(laum k.methods and microorganisms for the biological synthesis of(s)-2-amino-6-hydroxypimelate,hexamethylenediamine and 6-aminocaproate[z].googlepatents.2015)公开了谷氨酸至1,6-己二胺的生物催化途径；文献2(fedorchuk t p,khusnutdinova a n,evdokimova e,et al.one-pot biocatalytic transformation ofadipic acid to 6-aminocaproic acid and1,6-hexamethylenediamine usingcarboxylic acid reductases and transaminases[j].j am chem soc,2020,142(2):1038-48.)公开了己二酸至1,6-己二胺的生物转化途径，成功在体外实现了己二酸至1,6-己二胺的生物转化，并获得了3mm的产量；文献3(zhang z,fang l,wang f,etal.transforming inert cycloalkanes intoα,ω-diamines by designed enzymaticcascade catalysis[j].angewandte chemie international edition,2023,62(16):e202215935.)构建了三个不同的模块，分别以环己烷和环己醇为底物，合成了7.6mm和16.5mm的1,6-己二胺。文献4(石焜,郁惠蕾,许建和.羧酸还原酶的研究进展[j].微生物学通报,2020,47(07):2255-65.)利用羧酸还原酶可以催化羧酸还原为相应的醛，对羧酸还原酶系统发育、结构与催化机理、蛋白质工程和固定化工程进行了研究，揭示其作为重要工具酶在生物转化及合成生物学中的应用。目前，还没有报道天然的1,6-己二胺生物合成途径。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种高产己二胺的菌株，所要解决的技术问题是如何在工程菌内构建一套完整的1,6-己二胺代谢合成路径。本发明的另一目的在于提供一种上述菌株的制备方法，解决如何获得上述重组菌株的问题。

2、为解决上述技术问题，本发明提供以下的技术方案：

3、一种己二胺高产菌株，所述菌株表达羧酸还原酶突变体mab car l342e、转氨酶pata和转氨酶vfta，所述mab car l342e的氨基酸序列如seq id no.1所示。

4、优选地，所述pata的氨基酸序列如seq id no.2所示，所述vfta的氨基酸序列如seq id no.7所示。

5、优选地，所述菌株的保藏名称为escherichia coli dah37，保藏编号为cctccno：m20231767，所述菌株于2023年9月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。

6、为了获得上述高产己二胺菌株，本发明采用如下方法制备该菌株，步骤如下：

7、(1)构建表达羧酸还原酶突变体mab car l342e的重组菌一；

8、(2)向重组菌一中转化含转氨酶pata基因和转氨酶vfta基因的表达载体得到同时表达羧酸还原酶突变体和转氨酶的生产1,6-己二胺的菌株。

9、优选地，所述步骤(1)的方法为：以含羧酸还原酶野生型基因的质粒为模板，设计引物对进行pcr反应，克隆羧酸还原酶突变体基因，将羧酸还原酶突变体基因插入表达载体后转化宿主菌，即得重组菌一。

10、优选地，所述引物对的核酸序列如seq id no.11-12所示，所述pcr反应的退火温度为55-67℃。

11、优选地，步骤(2)中所述转氨酶pata基因的dna序列如seq id no.13所示；所示转氨酶vfta基因的dna序列如seq id no.14所示。

12、本发明应用上述方法构建的菌株以6-氨基己酸为底物生物合成1,6-己二胺。

13、本发明提供一种含有pata基因和vfta基因的质粒。

14、本发明获得的有益效果：本发明通过优化羧酸还原酶和双转氨酶基因的表达，构建了1,6-己二胺生物合成菌株dah37，提供了一种以6-氨基己酸为起始底物生物合成1,6-己二胺的全新路径。含有双转氨酶基因的dah37菌株合成1，6-己二胺的能力显著高于仅表达单转氨酶基因的菌株，表现出良好的工业化应用前景。

技术特征：

1.一种己二胺高产菌株，其特征在于：所述菌株表达羧酸还原酶突变体mab carl342e、转氨酶pata和转氨酶vfta，所述mab car l342e的氨基酸序列如seq id no.1所示。

2.根据权利要求1中所述生产己二胺的菌株，其特征在于：所述pata的氨基酸序列如seq id no.2所示，所述vfta的氨基酸序列如seq id no.7所示。

3.根据权利要求2中所述生产己二胺的菌株，其特征在于：所述菌株的保藏名称为escherichia coli dah37，保藏编号为cctcc no：m20231767，所述菌株于2023年9月22日保藏于中国典型培养物保藏中心。

4.如权利要求1-3中任一项所述生产己二胺菌株的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

5.如权利要求4所述生产己二胺菌株的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)的方法为：以含羧酸还原酶野生型基因的质粒为模板，设计引物对进行pcr反应，克隆羧酸还原酶突变体基因，将羧酸还原酶突变体基因插入表达载体后转化宿主菌，即得重组菌一。

6.如权利要求5所述生产己二胺菌株的制备方法，其特征在于：所述引物对的核酸序列如seq id no.11-12所示，所述pcr反应的退火温度为55-67℃。

7.如权利要求4所述生产己二胺菌株的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述转氨酶pata基因的dna序列如seq id no.13所示；所示转氨酶vfta基因的dna序列如seq id no.14所示。

8.如权利要求1-3中任一项所述生产己二胺菌株在以6-氨基己酸为底物合成1,6-己二胺中的应用。

9.一种含有pata基因和vfta基因的质粒。

技术总结本发明公开了一种己二胺高产菌株及其制备方法，所述菌株表达羧酸还原酶突变体MAB CAR L342E、转氨酶PatA和转氨酶VFTA，所述MAB CAR L342E的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述PatA的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述VFTA的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。本发明通过优化羧酸还原酶和双转氨酶基因的表达，构建了1,6‑己二胺生物合成菌株DAH37，提供了一种以6‑氨基己酸为起始底物生物合成1,6‑己二胺的全新路径。含有双转氨酶基因的DAH37菌株合成1，6‑己二胺的能力显著高于仅表达单转氨酶基因的菌株，表现出良好的工业化应用前景。技术研发人员：陈祥,刘伟,姚良雨,杨兴旭,姜贤刚,邓禹,李国辉,李文飞受保护的技术使用者：淮北矿业绿色化工新材料研究院有限公司技术研发日：技术公布日：2024/6/18