产脲节杆菌菌株05-507、生防菌剂及其应用的制作方法

本技术涉及生防菌剂，特别是一种产脲节杆菌菌株05-507、生防菌剂及其应用。

背景技术：

1、青枯病主要由罗尔斯通氏菌(ralstonia spp.)侵染引起，是作物重要的土传病害。罗尔斯通氏菌能侵染400多种作物，在香蕉、番茄、马铃薯、烟草上为害较重。在我国烟草青枯病主要由烟草罗尔斯通氏菌(r.nicotianae)侵染引起，该病在长江流域及其以南各烟区普遍发生(liu jun-ying,zhang jian-feng,wu han-lian,et al.proposal toclassify ralstonia solanacearum phylotype i strains as ralstonia nicotianaesp.nov.,and a genomic comparison between members of the genusralstonia.frontiers in microbiology,2023,14:1135872.doi:10.3389/fmicb.2023.1135872.)。卢灿华,李军营,米梦鸽等于2021年发表的“蒲桃雷尔氏菌(ralstonia syzygii)llrs-1的基因组学分析”([c]//中国植物病理学会.植物病理科技创新与绿色防控——中国植物病理学会2021年学术年会论文集.中国农业科学技术出版社,2021:1.doi:10.26914/c.cnkihy.2021.063949.)一文已探明，该病在云南省文山、保山、临沧、红河、昆明、玉溪、曲靖、昭通、大理、丽江、楚雄和德宏等12个州市的43个区(县)有发生，其中文山、临沧、红河、普洱烟区发病较重。虽然烟草青枯病为害较重，但因抗病资源匮乏，加之无化学防治的特效药，该病一直是制约烟草产量和品质提升的重要因素。

2、生物防治因其对环境友好而受到广泛关注。已有大量生防资源作为土传病害生物防治手段得到深入研究，例如已报道的青枯病生防菌主要包括假单胞菌(pseudomonasspp.)、芽孢菌(bacillus spp.)、链霉菌(streptomyces spp.)、不动杆菌(acinetobacterspp.)、伯克霍尔德氏菌(burkholderia spp.)和类芽孢菌(paenibacillus spp.)。

3、我国已针对烟草青枯病开发注册11种生防菌，主要为荧光假单胞菌、解淀粉芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等杀菌剂，多数菌剂具有拮抗罗尔斯通氏菌的能力。国内已报道的烟草青枯病生防菌的相关专利主要包括：产脲类节杆菌(enterbactertabaci)05-507(cn115678806a)、指示器寡养单胞菌(stenotrophomonas indicatrix)菌株107e3(cn115612651a)、罗尔斯通氏菌(ralstonia sp.)56d2(cn113502250a)、副黄假单胞菌(p.parafulva)dw15(cn114934001a)、韩国假单胞菌(p.koreensis)clp-23(cn111705016a)、解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)tba03(cn111117936a)、多粘类芽孢杆菌nx1-4-4(cn107365729a)、枯草芽孢杆菌(b.subtilis)生防菌株trb3(cn102747013a)；复合菌剂主要有3株假单胞菌(p.lurida)fgd5-2、(p.koreensis)hch2-3和(p.rhodesiae)mtd4-1组合(cn112920965a)，细黄链霉菌(streptomyces microflavus)cgmcc 12841、微白黄链霉菌(s.albidoflavus)cgmcc 12842、链霉菌(s.pratensis)cgmcc12843和1株铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)组合(cn106754563a)，浅多色链霉菌、累西菲链霉菌、沙福芽孢杆菌、中孢短芽孢杆菌、褐红木霉菌组合(cn106465734a)，里氏木霉(trichoderma ressei)accc 30150和黄赭色链霉菌(s.silaceus)accc 40021组合(cn103315005a)。

4、虽然烟草青枯病在我国发生较为广泛，但仅有多粘菌与枯草菌复合的菌剂(pd20200380)注册。在我国，不同种植区的经纬度、海拔和烤烟品种，其病原菌多样性较为复杂，急需研发适应性强、防效好的复合生防菌控制病害蔓延。

5、公开于背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本技术的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域普通技术人员所公知的现有技术。

技术实现思路

1、本技术针对上述技术问题提供了一种产脲节杆菌菌株05-507、生防菌剂及其应用。

2、本技术提供了一种产脲节杆菌菌株05-507，产脲节杆菌(paenarthrobacterureafaciens)菌株05-507的保藏编号：cctcc no:m 20211381；该菌株用于促进烟苗生长和/或防治青枯病。

3、优选的，菌株05-507能较好利用的碳源包括：d-麦芽糖、d-海藻糖、d-纤维二糖、龙胆二糖、蔗糖、d-松二糖、水苏糖、蜜三糖/棉子糖、α-d-乳糖、蜜二糖、β-甲酰-d-葡糖苷、n-乙酰神经氨酸、α-d-葡糖、d-甘露糖、d-果糖、d-半乳糖、d-甘露醇、肌醇、甘油、l-谷氨酸、l-丝氨酸、果胶、d-葡糖醛酸、p-羟基-苯乙酸、柠檬酸、α-酮-戊二酸、l-苹果酸、γ-氨基-丁酸、乙酰乙酸；利用能力弱的碳源有：糊精、d-水杨苷、n-乙酰-d-葡糖胺、n-乙酰-β-d-甘露糖胺、n-乙酰-d-半乳糖胺、3-甲酰葡糖、d-果糖、l-果糖、l-鼠李糖、肌苷、d-阿拉伯醇、d-葡糖-6-磷酸、d-果糖-6-磷酸、d-天冬氨酸、明胶、氨基乙酰-l-脯氨酸、l-丙氨酸、l-精氨酸、l-天冬氨酸、l-组胺、l-焦谷氨酸、l-半乳糖醛酸内酯、d-葡糖酸、葡糖醛酰胺、粘酸/粘液酸、奎宁酸、糖质酸、丙酮酸甲酯、l-乳酸、d-苹果酸、溴-丁二酸、α-羟基-丁酸、β-羟基-d,l丁酸、α-酮-丁酸、丙酸、乙酸；

4、优选地，菌株05-507不能利用的碳源有：d-山梨醇、d-丝氨酸、d-半乳糖醛酸、d-乳酸甲酯、吐温40、甲酸；

5、优选地，菌株05-507在含有1％乳酸钠、梭链孢酸、d-丝氨酸、醋竹桃霉素、利福霉素sv、二甲胺四环素、林肯霉素/洁霉素、硫酸四癸钠、万古霉素、四唑紫或四唑蓝的条件下长势弱；

6、优选地，菌株05-507在含有ph 5、ph 6、1％nacl、4％nacl、8％nacl、盐酸胍、萘啶酮酸、氯化锂、亚碲酸钾、氨曲南、丁酸钠或溴酸钠的条件下生长较好。

7、优选地，菌株05-507对青枯病病原菌无拮抗作用。

8、优选地，采用该菌株促进烟苗生长的方法为采用含菌株05-507的制剂对烟苗灌根。

9、通过实验验证，使用含菌株05-507的溶液灌根后，烟株的株高、最大叶片面积均大于对照组，说明该菌株具有较好的促进烟株生长的作用。

10、优选地，含菌株05-507的制剂中菌株05-507的菌浓度大于等于108cfu/ml。

11、优选地，灌根操作包括以下步骤：对移栽1d的烟苗按每株烟苗3ml菌液量进行灌根。

12、优选地，含菌株05-507的制剂为菌株05-507发酵液；

13、优选地，菌株05-507发酵液的制备方法包括以下步骤：将菌株05-507接种于培养基中在30～35℃下、200～225r/min摇培20～48h得到；培养基为葡萄糖5g/l，豆粕粉20g/l，骨蛋白胨2.5g/l，玉米淀粉15g/l，酵母膏2.5g/l，硫酸镁0.5g/l，磷酸氢二钾1g/l，ph 7.3。

14、本技术的另一方面还提供了一种生防菌剂，至少包括：如上述菌株05-507，该菌剂用于促进烟苗生长；或至少包括：如上述菌株05-507及菌株wy11、菌株05-2101；菌株wy11的保藏编号：cgmcc no.6663；菌株05-2101的保藏编号为cctcc no：m 2022547；生防菌剂用于促进烟草幼苗生长及防治青枯病。

15、该菌剂的相对于常规对照组的防效为57.27％，高于化学药剂氯尿硫酸铜的防效；采用该菌剂处理的基质烟苗时，烟苗的鲜重和地上部分鲜重极显著高于常规。幼苗的鲜重可达10g，地上部分的鲜重可达14g，均高于对照组的9g和8g。

16、同时该菌剂对于青枯病病原菌无有效抑菌带，说明该菌剂不以拮抗为主要机制控制烟草青枯病，可能是3株菌通过协同作用，竞争生态位点、调控烟株根际微生物组、诱导植株抗病或其他机制控制病害。长期施用该菌可有效防止耐药菌株的产生。

17、该菌剂中所用各菌株可制成各种符合各类符合工艺生产要求的剂型产品，例如，粉剂、片剂、液体剂等使用。

18、优选地，生防菌剂中至少包括：按体积比为1:1:1组成的菌株05-507制剂及菌株wy11制剂、菌株05-2101制剂。

19、可以采用各菌株的发酵液，也可以为各菌株的粉剂等各类常用制剂形式按该比例混合，各菌株的发酵液制备按现有本领域常用方法进行发酵培养，菌株05-507的发酵培养条件与前述相同，菌株wy11、菌株05-2101的发酵培养条件为该菌株文献记载相同。粉剂则采用各菌株发酵液通过物理吸附工艺或喷雾干燥方法制得。

20、本技术的菌剂及制剂的剂型不限于粉剂，本领域技术人员根据本技术的教导和启发，出于实际生产需要，结合微生物工艺领域常用技术手段(例如，《制剂技术百科全书》、《药物制剂技术》等)，选择合适的辅料加以调配，将本技术保藏编号为cctcc no：m 2019922的嗜水气单胞菌(aeromonas hydrophila)菌株ztyl3制成各种符合各类符合工艺生产要求的其他剂型产品，例如，片剂、液体剂、喷雾剂、颗粒剂等。

21、优选地，生防菌剂还包括：辅料。

22、优选地，辅料选自：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、ph值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂中至少一种。

23、优选地，生防菌剂的剂型为粉剂。

24、优选地，发酵稀释液包括：发酵液；菌株wy11、菌株05-2101的发酵条件为：在200r/min，35℃下培养20～24h，得到发酵液；

25、菌株wy11发酵所用培养基为葡萄糖5g/l，豆粕粉20g/l，骨蛋白胨2.5g/l，玉米淀粉15g/l，酵母膏2.5g/l，硫酸镁0.5g/l，磷酸氢二钾1g/l，ph 7.3；菌株05-2101发酵所用培养基为葡萄糖20g/l，豆粕粉25g/l，酵母膏4g/l，磷酸氢二钾1.5g/l，ph 7.3。

26、具体地，各菌株的发酵液发酵方法如下：

27、(1)灭菌：空消条件为：0.15mpa、123℃、1h；实消条件为：0.15mpa、123℃、35min；

28、(2)接种：灭菌完成后，培养液温度下降至37℃时开始接种，接种比例为菌种/培养液(v/v)为1:100；

29、(3)发酵：转速：保持120r/min至发酵结束；通气量：保持15m3/h时，保持至发酵结束；整个过程保持罐压在0.05mpa；因设备原因允许通气量在短时间内浮动。温度：整个发酵过程保持温度在37℃，上下可浮动0.5℃。发酵时间：运行发酵42h。

30、(4)检测：接种前对菌种进行检测，检测菌种的纯度，方法为划线培养和显微镜镜检；待灭菌完成的培养液温度下降至37℃时，在接种前进行第1次取样，检测灭菌的彻底程度，方法为划线培养和显微镜镜检；从接种开始8h后进行第2次取样，检测发酵是否污染，方法为划线培养和显微镜镜检；发酵24h进行第3次取样，检测发酵是否污染和芽孢率，此后每6h进行1次取样，直到芽孢率达到95％以上完成发酵，方法为划线培养和显微镜镜检；发酵完成后，取样检测发酵液菌量，采用方法为稀释涂板法。

31、优选地，生防菌剂中菌株05-507的菌浓度大于等于109cfu/ml，菌株wy11的菌浓度大于等于108cfu/ml，菌株05-2101的菌浓度大于等于108cfu/ml。

32、优选地，生防菌剂稀释形式为发酵稀释液或菌粉悬浮液。

33、优选地，烟草青枯病的病原菌为烟草罗尔斯通氏菌(ralstonia nicotianae)、茄科罗尔斯通氏菌(ralstonia solanacearum)、假茄科罗尔斯通氏菌(ralstoniapseudosolanacearum)或蒲桃罗尔斯通氏菌(ralstonia syzygii)中至少一种。

34、本技术的另一方面还提供了一种促进烟株幼苗生长且防治青枯病的方法，将如上述的生防菌剂根据需要稀释后与烟苗培养基质拌合；

35、以上根据需要稀释是指根据获取菌剂的浓度以及使用要求，根据本领域常规稀释要求进行稀释满足使用要求即可。例如可以按体积比为15：450进行稀释后，与基质进行拌合后施用。基质与稀释后菌剂的配比可以按本领域常用比例进行，例如稀释后菌剂与基质按体积比为1:10进行拌合。

36、烟苗培养基质可以为用于烟草种子萌发的培养基质，也可以为用于烟草幼苗生长的培养基质。该菌剂可有效促进种子萌发后的长势以及烟苗的长势。

37、烟苗培养基质可以为烟草漂浮育苗基质、育苗土、有机肥。

38、优选地，该生物菌剂用于育苗时，按100～400g/池添加于烟苗培养基质中使用。在该范围内添加该菌剂，均可保证烟苗生长并实现促进生长、防治青枯病的效果。更优选地，该生物菌剂用于育苗时，按100g/池添加于烟苗培养基质中。具体使用是指将菌剂按使用规模计算后，与基质拌合后，作为育苗基质使用。

39、优选地，该生物菌剂用于防治青枯病时，按1～10g/株添加于烟苗培养基质中后施用。具体使用是指将菌剂按使用规模计算后，与所用基质拌合后，作为育苗基质用于烟苗的培育种植中。

40、本技术能产生的有益效果包括：

41、1)本技术所提供的产脲节杆菌菌株05-507、生防菌剂及其应用，经平板拮抗能力测定发现菌株05-507、05-2101以及05-507、05-2101、wy11组成的复合菌剂st6对罗尔斯通氏菌无抑菌能力，说明菌株05-507、05-2101以及复合菌剂st6的控病机理与传统的拮抗菌不同，可能通过生态位竞争、诱导植株抗病、调节根际微生物群落等机制防病；

42、2)本技术所提供的产脲节杆菌菌株05-507、生防菌剂及其应用，菌株05-507对罗尔斯通氏菌生长无抑制能力，说明菌株05-507发挥控病作用不以产生抗生素为主。促生长实验表明菌株05-507具有促烟株生长的效果，主要通过促进烟株生长，增强烟株长势以达到对青枯病的防治效果，因此在田间施用菌株05-507防治烟草青枯病时，不会产生罗尔斯通氏菌对菌株05-507或菌株代谢产物的耐受性，说明施用含该菌株05-507的生物菌剂具有较好的安全性；

43、3)本技术所提供的产脲节杆菌菌株05-507、生防菌剂及其应用，烟草青枯病生防菌以芽孢菌、假单胞菌、链霉菌为主，以单一菌剂为主，复合菌剂在作物青枯病生物防治中的报道较少，本技术涉及的产脲类节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)05-507、wy11和05-2101复合菌剂为作物青枯病的防治提供新的生防资源。

44、本技术提供的产脲节杆菌(paenarthrobacter ureafaciens)05-507的保藏信息如下：保藏编号：cctcc no:m20211381；分类命名：paenarthrobacter ureafaciens 05-507；保藏日期：2021年11月08日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国、武汉、武汉大学。