烟草NtMYC2基因在烟草青枯病抗性和叶宽调控中的应用

本发明属于生物，涉及烟草ntmyc2基因在烟草青枯病抗性和叶宽调控中的应用。

背景技术：

1、烟草，烟草作为一种重要的科研模式植物和经济作物，在科研发展和国民经济中均发挥着重要的作用。烟草青枯病是由青枯雷尔氏菌(ralstonia solanacearum)侵染引起的一种细菌性土传病害，严重危害着烟草的产量和品质，是烟草三大病害之一。烟草青枯病1880年首次发现于美国北卡罗莱纳州，现几乎分布于世界上所有烤烟种植区，热带和亚热带烟区发病尤为严重，是威胁世界烟草生产的一大毁灭性病害。田间烟株一旦感染青枯病，伴随高温高湿的发病有利条件，病株就会迅速发病萎蔫死亡。青枯病在烟草中的发病率为15％-35％，在严重发生地区可达75％，给烟农造成了严重的经济损失。青枯菌病原菌寄主广泛，可侵染50多科的450余种作物，例如茄科、豆科、姜属等重要经济作物，其中以茄科作物危害最为严重，给农业生产造成了巨大的经济损失(wicker et al.,2007)。

2、结合正向遗传学手段，多个植物开展了青枯病抗性基因的定位工作，包括番茄、茄子、玉米、烟草、辣椒、马铃薯、花生等(zhao et al.,2016；mathew et al.,2020；shin etal.,2020)。然而目前通过定位策略从抗源材料中鉴定到的青枯病抗性基因仅在拟南芥中有报道：deslandes等(1998)成功克隆拟南芥青枯病抗性基因rrs1，包含nbs和wrky结构域，编码产物同时具有识别功能和转录活性；godiard等(2010)利用拟南芥ler x col-0的ril群体定位到三个青枯病抗性位点，并证实ereta能够增强拟南芥对青枯病的抗性，该基因编码编码一种富含亮氨酸的重复受体样激酶(lrr-rlk)。拟南芥青枯病抗性基因的克隆让青枯病抗性机理研究上了一个新台阶，为其他物种的研究提供了重要参考。随着分子生物学和组学技术的不断进步，一些青枯病抗性相关基因通过反向遗传学的策略被鉴定到，包括兔防御素基因np-1、花生青枯病抗性相关基因ahrrs5、nac家族转录因子stnacb4、受病原细菌鞭毛蛋白flg22诱导表达的磷脂酶nbplc2-1和nbplc2-2、几丁质酶类基因家族ntpr-q等(fu et al.,1998；zhang et al.,chang et al.,2020；liu et al.,2020；2016；akinoriet al.,2020)。上述研究表明青枯病抗性相关基因的类型复杂，但大多数能够参与调控下游防御相关信号因子以激活植物对青枯菌的抗性。

3、myc2(myelocytomatosis proteins 2)是一类b hlh家族转录因子，是ja信号途径中的主要调控因子。myc2属于b hlh家族，其羧基端c-terminal具有保守的bhlh结构域，这是b hlh家族蛋白典型的特征，也是myc2定位细胞核所必需的结构域(lorenzo et al.，2004)，该区域包含15～20个主要的碱性氨基酸，参与myc2与目标基因启动子中的g-box元件结合(carretero-paulet et al.，2010)；其氨基端n-terminal domain存在bhlh-myc_n结构域，其中包含与jaz(jasmonate-zim domain)蛋白结合的jid域(jaz interactiondomain)和转录激活功能域(transcriptional activation domain，tad)(chini et al.，2007；fernández-calvo et al.，2011；chen et al.，2012)。陆生植物中myc2功能研究最早可追溯到轮藻的研究(et al.，2019)中。茉莉酸(jasmonate，ja)及其衍生物茉莉酸甲酯(methy jasmonate，me ja)作为一种重要的信号分子，能激活多种相关转录因子的活性(huot et al.，2014)。ja参与植物中的激素信号传导(wasternack&hause，2013；aertset al.，2021)、植物生长发育(wasternack&hause，2013；hu et al.，2022)、植物防御(reinbothe et al.，2009；yan&xie，2015)、逆境响应(wasternack&hause，2013；彭轶等，2022；yang et al.，2022)、调控次生代谢产物合成(de geyter et al.，2012)等重要的生命活动。这一系列过程通常涉及ja信号的感知和核心通路的诱导，ja信号可调控转录因子myc2的活性并触发复杂的调控网络，进而调节下游ja响应基因的转录和表达(de geyteret al.，2012；chini et al.，2016；goossens et al.，2016)。

4、目前，关于myc2转录因子在植物中的功能机制研究较为深入，已在拟南芥、烟草、番茄、玉米、水稻、长春花、菊花等多个物种中被鉴定并表征其功能(schweizer et al.，2013；sun et al.，2014；sui et al.，2018；ramirez-prado et al.，2019；min et al.，2020；kong et al.，2021)。植物激素在调控植物激素信号转导，逆境与非生物逆境响应，次生代谢产物和植物生长发育中具有重要作用。myc2作为以ja为主的多种激素诱导的主调控因子发挥着重要作用，一是植物体内的jaz蛋白结合myc2从而抑制myc2的活性，当植物遭遇外界胁迫、病虫侵害或者外界me ja刺激时，植物体中的ja水平升高，jaz蛋白被e3泛素连接酶scfcoi1结合而释放myc2。二是通过与转录中介体亚基med25形成功能复合物而在全基因组范围内激活ja响应基因的表达(chen et al.，2012；wang et al.，2019)。转录因子myc2在多种园艺作物对胁迫响应过程中发挥了重要作用(kazan，2015)。在拟南芥中，at jaz2与myc2/3/4互作直接调节at nac19/55/72的转录可增大植物叶片的气孔孔径，当受到假单胞菌侵染时，cor能够抑制jaz2的活性而使植物易感病(gimenez-ibanez et al.，2017)。atmyc2可通过与rf1蛋白之间的拮抗作用使拟南芥选择正确的调控方式以响应病原体和损伤胁迫(lorenzo et al.，2004)。在番茄中，myc2正向调控其下游mtf(myc2-targetedtranscription factors)的转录，这些mtf(如ja2l、erf.c3)进一步调控病原体应答基因pr-sth2的表达；在拟南芥中，myc2负向调节病原体应答基因pdf1.2(du et al.，2017)。番茄中的myc2可能通过介导独脚金内酯、aba和ja间的串扰负调控番茄对根结线虫的防御(xuet al.，2019)。据报道，myc2参与了多种植物次生代谢物的合成调控，在拟南芥中，myc2/3/4是芥子油苷生物合成途径限速酶基因的直接转录激活因子(schweizer et al.，2013)；在烟草中，nt myc2能够促进尼古丁生物合成途径中的关键酶基因pmt的转录从而提高尼古丁含量(shoji&hashimoto，2011)，还能够调节东莨菪素来提高烟草对链格孢菌的抵御能力(sun et al.，2014)。myc2广泛参与植物光形态建成、气孔发育、种子发育、叶片衰老和果实成熟等生长发育过程，myc2广泛参与植物光形态建成、气孔发育、种子发育、叶片衰老和果实成熟等生长发育过程，研究表明拟南芥myc2/3/4能进一步激活hy5的表达以抑制细胞伸长相关的基因转录，从而诱导幼苗光形态建成的发生(yi et al.，2020)。在苹果中的研究表明md myc2可以通过作用于乙烯响应因子md erf3进而调控果实成熟(li et al.，2017)。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供烟草ntmyc2基因在烟草青枯病抗性和叶宽调控中的应用。

2、本发明的目的可通过以下技术方案实现：

3、烟草ntmyc2基因在调节烟草对青枯病抗性和/或烟草叶片宽度中的应用，所述的烟草ntmyc2基因编码区序列如seq id no.1所示。

4、作为本发明的一种优选，敲除烟草ntmyc2基因降低烟草对青枯病抗性和/或减小烟草叶片宽度。

5、有益效果：

6、本发明利用基因编辑技术在普通烟草中对ntmyc2基因进行基因编辑。突变株系对青枯菌的抗性显著降低，并且伴随叶片发育异常。转录组数据解释了突变株的植物免疫相关的go和kegg与野生型存在差异。上述研究为myc2在植物抵抗生物胁迫的分子机制研究提供了新的证据。