来源于病原菌细胞壁的多糖HAF2-1及其制备与应用

本发明提供了一种病原菌来源的细胞壁多糖提取物，具体是从立枯丝核菌中提取的一种热碱提水溶性细胞壁多糖haf2-1，其能够应用于诱导植物产生抗病性。

背景技术：

1、水稻纹枯病是世界范围内分布最为广泛的水稻病害之一，且有发生范围不断扩大、程度不断增加的趋势，造成严重减产。导致水稻纹枯病的病原菌为立枯丝核菌(rhizoctonia solaniag1ia)，它是一种丝核菌属真菌，是水稻、玉米、马铃薯等重要农作物的致病菌。其细胞壁由丰富的多糖组成，多糖是一类由醛糖或酮糖通过糖苷键连接而成的天然高分子多聚物，在生物体内发挥着重要的代谢调节作用。

2、通常，细胞壁作为植物和病原菌互作的第一道防线，细胞壁组成的变化通常能够作为病原相关分子模式(pamp)和损伤相关分子模式(damp)诱导植物免疫从而增强抗性。目前已经有报道称植物或病原菌来源的多糖可以作为一种潜在的诱导子激发植物的免疫抗性。例如，来自产黄青霉干菌丝体的中性半乳甘露聚糖可以保护n.glutinosa免受烟草花叶病毒的侵害，该病毒诱导no和h2o2的产生以启动早期防御反应(fuetal，2020)。作为pamp，存在于真菌和卵菌壁中的β-1,3-葡聚糖可以触发拟南芥中免疫相关基因的表达(melidaetal，2013，2018)。因此，作为植物病害真菌，了解其细胞壁多糖的主要结构对于病原菌侵染和病害防治具有重要意义。

3、目前，有关纹枯病的防治较为困难，农业防治中免疫诱导是植株抗病的重要途径，但是由于缺乏对病菌细胞壁结构的了解及高效提取技术，目前的诱导剂种类少，针对水稻专一性弱。wolski团队(2005，2006)从一种非致病性立枯丝核菌株中分离出的α-1,3-葡聚糖，能诱导马铃薯中的葡聚糖酶活性。从甜瓜中分离出来的立枯丝核菌中提取的岩藻甘露半乳聚糖，具有外抑制结肠癌细胞增殖的效果(alexandreetal，2018)。但对于纹枯病的致病菌rhizoctonia solaniag1ia菌株的细胞壁多糖未见报道，本发明提供了一种来自立枯丝核菌细胞壁多糖及制备方法，可用于从免疫诱抗途径加强对纹枯病防治，具有一定的应用价值。

技术实现思路

1、本发明目的在于提供立枯丝核菌细胞壁多糖、及其制备和在诱导植物抗性方面的应用。

2、本发明的技术方案之一，一种来源于病原菌细胞壁多糖haf2-1，其特征为：

3、1)单糖组成为岩藻糖，半乳糖，葡萄糖，甘露糖，优选地，岩藻糖，半乳糖，葡萄糖，甘露糖的相对摩尔比为1.43±0.05：3.27±0.19：83.93±0.25：11.37±0.85。

4、2)重均分子量约为3097±50kda,优选地，重均分子量为3097kda；

5、3)多糖糖苷键主链结构为→4)-α-glcp-(1→，并且含有一定程度的侧链取代，优选地，多糖糖苷键的连接方式如下：→4)-glcp-(1→为主链，含有→4,6)-glcp-(1→和→3,4)-glcp-(1→分支，→6)-glcp-(1→侧链和少量的→3)-glcp-(1→，以及manp-(1→末端。其中，manp-(1→，→3)-glcp-(1→，→4)-glcp-(1→，→6)-glcp-(1→，→3,4)-glcp-(1→，→4,6)-glcp-(1→的相对摩尔比为8.66：1.1：57.28：23.30：3.10：6.63.

6、本发明的技术方案之二，上述一种来源于病原菌细胞壁多糖haf2-1的制备方法，包括以下步骤：

7、(1)菌株培养；(2)细胞壁提取脱脂；(3)沸水提取、冷碱提取；(4)热碱提取；(5)分离纯化。(1)立枯丝核菌培养：立枯丝核菌置于pdb培养基中活化后，用接菌环挑取菌饼边缘的菌丝接入液体培养基中，于26-30℃静态培养2-4天。

8、(2)立枯丝核菌细胞壁的提取脱脂：将步骤(1)中的立枯丝核菌经布氏漏斗抽滤除去发酵液得到菌丝体，用pbs缓冲液(ph＝7.0-7.4)清洗3-4次去除培养基，液氮研磨加入pbs缓冲液(ph＝7.0-7.4)中进行超声细胞粉碎粉碎，后用pbs缓冲液清洗1-2次，水洗3-4次，离心弃上清，残渣冻干即得立枯丝核菌细胞壁；以料液比1：10-20(g/ml)加入无水乙醇，65-70℃

9、提取1-2h，去除脂溶性组分。挥干乙醇后得脱脂的立枯丝核菌细胞壁。

10、进一步地，所述步骤(2)中，超声粉碎需要冰水浴，400w，5s，间隔时间5s，40次；离心转速4000g，时间5min，温度4℃。进一步地，所述步骤(2)中，挥干无水乙醇时，水浴加热75-82℃。

11、(3)沸水、冷碱提取细胞壁：将步骤(2)脱脂后的立枯丝核菌细胞壁以料液比1：10-20(g/ml)，随后经沸水、冷碱(15-20℃，0.5-1mnaoh)提取2-3次，离心，弃上清，除去与细胞壁结合较弱得组分。

12、进一步地，所述步骤(3)中，离心转速4000g，时间5min，温度4℃。

13、进一步地，所述步骤(3)中，离心转速4000g，时间5min，温度4℃。

14、(4)热碱提取：将步骤(3)中的细胞壁残渣进行热碱提取，碱提溶液为naoh，浓度为1-2m，提取温度为70-90℃，提取次数为2-3次。离心合并上清，用醋酸钠中和后，透析48-72h，旋蒸浓缩后加入4倍体积的无水乙醇醇沉，离心收集沉淀，复溶于水，sevage试剂(氯仿：正丁醇＝5：1，体积比)除蛋白。

15、进一步地，所述步骤(4)中，透析时，间隔12h换一次水，透析袋规格为3500da。

16、进一步地，所述步骤(4)中，离心转速8000-12000rpm，时间为5-10min。进一步地，所述步骤(4)中，除蛋白时，用水制备成5mg/ml的多糖溶液加入sevage试剂，首次加入与多糖浓度等体积的sevage试剂，后续重复操作中加入多糖溶液体积的1/5，振荡、离心4000-8000rpm,5-10min，直至两相界面间无白色混浊悬液，收集上层水相，经冷冻干燥得到立枯丝核菌碱提细胞壁粗多糖。

17、(5)碱提水溶性细胞壁粗多糖离子交换柱层析分离纯化。

18、将上述(4)制备的除蛋白后的立枯丝核菌碱提细胞壁多糖制备成水溶液浓度为10-20mg/ml，用0.22μm滤膜除杂，将其加入到deae-52阴离子交换柱，先采用超纯水洗脱，后采用0.1-0.12m，0.3-0.35m，0.5-0.8m nacl逐级等度洗脱，用苯酚硫酸法检测各管糖含量并绘制洗脱曲线后，收集0.1m nacl洗脱部分的洗脱液，浓缩后冻干，经0.1m nacl洗脱后得到的组分为haf2。

19、(6)碱提水溶性细胞壁粗多糖凝胶过滤层析分离纯化。

20、将(5)得到的haf2制备成水溶液浓度为10-20mg/ml，用0.22μm滤膜除杂，将其加入到sephacryl s-300hr凝胶色谱柱，流动相为超纯水，用苯酚硫酸法检测各管糖含量并绘制洗脱曲线，收集主峰部分，浓缩冻干后得到立枯丝核菌碱提细胞壁多糖haf2-1。

21、本发明的技术方案之三，上述一种碱提水溶性立枯丝核菌细胞壁多糖haf2-1在诱导植物抗性方面的应用。

22、所述来源于立枯丝核菌的碱提水溶性细胞壁多糖haf2-1能激活水杨酸信号途径诱导水稻对纹枯病的抗性，使用浓度为2-3mg/ml。

23、本发明的有益效果：

24、本发明提供了新型的立枯丝核菌(r.solaniag1ia)来源的细胞壁多糖，同时提供了该细胞壁多糖的制备方法及在激活植物免疫中的应用，该细胞壁多糖易溶于水，可以有效激活水稻中的水杨酸信号及其下游的信号途径，诱导水稻产生对真菌病害的系统抗病性，尤其对纹枯病有很好的防治效果，应用前景较好。