一种引物设计方法、发夹修饰引物、试剂盒和检测方法与流程

本发明属于生物化学检测，涉及基因检测，具体涉及一种引物设计方法、发夹修饰引物、试剂盒和检测方法。

背景技术：

1、荧光定量pcr由于其灵敏度高、特异性强，被作为新型冠状病毒检测的金标准，但其对于操作人员及环境的要求较高，且扩增时间长，限制了现场即时检测的能力。

2、等温扩增技术(isothermal amplification technology，ita)是基于恒温扩增的新型核酸扩增技术，扩增过程中反应体系始终维持在恒定的温度下，通过添加不同活性的酶和各自特异性引物来达到快速扩增核酸的目的。该技术具有简单、快速等优点，对设备要求低、且扩增时间短，仅需在恒温状态下即可完成反应，在即时检测中有良好的应用前景。等温扩增技术包括环介导等温扩增(lamp)、滚环扩增(rca)、重组聚合酶扩增(rpa)、核酸序列的扩增(nasba)、链置换扩增(sda)等。其中lamp由notomi等人在2000年首次报道此技术，具有简单快速、高灵敏度、高特异性的特点。lamp使用4-6条引物识别靶序列的6-8段区域，利用链置换dna聚合酶在恒温条件下进行扩增，可在短时间内完成扩增反应。四条核心引物为两条内引物和两条外引物，另外还可以将两条环引物加入到反应体系中加速lamp反应。目前，针对lamp扩增产物的检测，较为简便的方法是直接在产物中加入如染色剂进行染色观察，或观察扩增副产物的沉淀析出导致溶液浊化现象，但大多采用间接检测方法，无法区分特异性与非特异性扩增，导致出现假阳性的结果。专利文献cn113337620a公开了一种基于flos-lamp检测大西洋鲑鱼的试剂盒及方法，基于大西洋鲑鱼细胞色素b基因筛选了4条特异性引物，同时设计了1条环引物并在其3’末端倒数第2个碱基标记荧光探针，该探针与靶标特异性结合释放荧光信号，可以实现特异性、高灵敏度检测，但这种方法要求引物满足从3’端起第2或第3个位置存在胸腺嘧啶(t)和3’末端存在胞嘧啶(c)或鸟嘌呤(g)这两个条件，不具有通用性。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种引物设计方法。

2、其技术方案如下：

3、一种引物设计方法，其关键在于，首先确定目标核酸的靶序列，根据该目标核酸上游区域的核酸序列，选定两段序列f2和f1，其中序列f2位于序列f1的上游；再确定所述引物的第一段为序列f1c，第二段为序列f2，所述序列f1c与所述序列f1互补；所述引物还包括第三段，该第三段为发夹序列，该第三段的两端具有一组互补序列，以允许其两端通过互补序列相结合从而形成发夹结构；所述第一段、第二段和第三段连接形成所述引物，其中所述第二段位于所述引物的3’端，所述第一段位于所述第二段上游。

4、作为优选，上述第三段的5’端与所述第一段的3’端连接，所述第三段的3’端与所述第二段的5’端连接。

5、作为优选，上述互补序列的配对碱基对数量为3～15个。

6、作为优选，上述第三段5’端和3’端的核苷酸上分别标记有荧光基团和淬灭基团，所述第三段形成发夹结构时所述荧光基团和淬灭基团相互靠近从而使所述荧光基团的荧光被淬灭，所述第三段展开形成非发夹结构时，所述荧光基团发出荧光。

7、本发明的目的之二在于提供一种发夹修饰引物。

8、其技术方案如下：

9、一种发夹修饰引物，其关键在于按照上述方法设计后合成；

10、优选地，所述荧光基团选自fam、hex、vic、joe、tet、cy3、tamra、texas red、tex-615和cy5中的任意一种，所述淬灭基团选自dabcyl、bhq1、bhq2、bhq3和bbq650中的任意一种。

11、本发明的目的之三在于提供一种发夹修饰引物的用途。

12、其技术方案如下：

13、如上所述的发夹修饰引物在制备核酸等温扩增检测试剂盒或等温扩增检测方法中的应用。

14、本发明的目的之四在于提供一种试剂盒。

15、其技术方案如下：

16、一种试剂盒，其关键在于，包括引物组，该引物组包括两条外引物f outer和router、两条内引物f inner和r inner，以及如上任意一项所述的发夹修饰引物；

17、优选地，所述试剂盒还包括两条环引物f loop和r loop。

18、在一种实施方式中，所述试剂盒用于肺炎链球菌的基因扩增检测，所述内引物finner的序列如seq id no.2所示，所述内引物r inner的序列如seq id no.3所示，所述外引物f outer的序列如seq id no.4所示，所述外引物r outer的序列如seq id no.5所示，所述环引物f loop的序列如seq id no.6所示，所述环引物r loop的序列如seq id no.7所示。

19、作为优选，上述试剂盒还包括扩增反应液试剂组以及扩增酶；

20、所述扩增反应液试剂组包括反应缓冲液、mgso4、dntp、热敏ung酶和无酶无菌水。

21、本发明的目的之五在于提供一种检测方法。

22、其技术方案如下：

23、一种检测肺炎链球菌的方法，其关键在于过程为，先制备待测肺炎链球菌dna样品，使用所述扩增反应液试剂组、扩增酶和所述引物组配制反应液，并加入待测样品，形成等温扩增反应体系；接着使所述反应体系保持在所述热敏ung酶的适宜温度使其激活，以消化潜在污染模板；然后将所述反应体系于67℃条件下等温扩增，并在扩增过程中采集荧光信号，分析结果。

24、与现有技术相比，本发明的有益效果：通过对等温扩增引物进行发夹结构修饰设计，同时在发夹结构的两端连接一个荧光基团和一个淬灭基团，扩增过程中发夹结构不打开，而以反应形成双链产物使发夹结构打开时荧光信号显著增强作为指示，能够实现简单快速、高特异性的等温扩增检测；具有通用性，适用于多物种检测，有助于满足等温扩增在临床即时检测中的需求与应用；能用于使用四条引物或六条引物的等温扩增检测。

技术特征：

1.一种引物设计方法，其特征在于：首先确定目标核酸的靶序列，根据该目标核酸上游区域的核酸序列，选定两段序列f1和f2，其中序列f2位于序列f1的上游；确定所述引物的第一段为序列f1c，第二段为序列f2，所述序列f1c与所述序列f1互补；所述引物还包括第三段，该第三段为成发夹序列，该第三段的两端具有一组互补序列，以允许其两端通过互补序列相结合从而形成发夹结构；所述第一段、第二段和第三段连接形成所述引物，其中所述第二段位于所述引物的3’端，所述第一段位于所述第二段上游。

2.根据权利要求1所述的一种引物设计方法，其特征在于：所述第三段的5’端与所述第一段的3’端连接，所述第三段的3’端与所述第二段的5’端连接。

3.根据权利要求1所述的一种引物设计方法，其特征在于：所述互补序列的配对碱基对数量为3～15个。

4.根据权利要求1～3任意一项所述的一种引物设计方法，其特征在于：所述第三段5’端和3’端的核苷酸上分别标记有荧光基团和淬灭基团，所述第三段形成发夹结构时所述荧光基团和淬灭基团相互靠近从而使所述荧光基团的荧光被淬灭，所述第三段展开形成非发夹结构时，所述荧光基团发出荧光。

5.一种发夹修饰引物，其特征在于按照权利要求4所述的方法设计后合成；

6.如权利要求5所述的发夹修饰引物在制备核酸等温扩增检测试剂盒或等温扩增检测方法中的应用。

7.一种试剂盒，其特征在于：包括引物组，该引物组包括两条外引物fouter和r outer、两条内引物f inner和r inner，以及如权利要求5所述的发夹修饰引物；

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒用于肺炎链球菌的基因扩增检测，所述发夹修饰引物的序列如seq id no.1所示，所述内引物f inner的序列如seq idno.2所示，所述内引物r inner的序列如seq idno.3所示，所述外引物f outer的序列如seqid no.4所示，所述外引物router的序列如seq id no.5所示，所述环引物f loop的序列如seq id no.6所示，所述环引物r loop的序列如seq id no.7所示。

9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于：还包括扩增反应液试剂组以及扩增酶；

10.一种检测方法，用于肺炎链球菌的检测，其特征在于过程为：先制备待测肺炎链球菌dna样品，使用权利要求9所述扩增反应液试剂组、扩增酶和所述引物组配制反应液，并加入待测样品，形成等温扩增反应体系；接着使所述反应体系保持在所述热敏ung酶的适宜温度使其激活，以消化潜在污染模板；然后将所述反应体系于67℃条件下等温扩增，并在扩增过程中采集荧光信号，分析结果。

技术总结本发明公开了一种引物设计方法、发夹修饰引物、试剂盒和检测方法，其中引物设计方法为，首先确定目标核酸的靶序列，根据该目标核酸上游区域的核酸序列，选定两段序列F2和F1，其中序列F2位于序列F1的上游；再确定引物的第一段为序列F1C，第二段为序列F2，序列F1C与序列F1互补；引物还包括第三段，该第三段为发夹序列，该第三段的两端具有一组互补序列，以允许其两端通过互补序列相结合从而形成发夹结构；所述第一段、第二段和第三段连接形成引物，其中第二段位于所述引物的3’端，第一段位于第二段上游。利用本发明的发夹修饰引物能够实现简单快速、高特异性的等温扩增检测，满足临床即时检测中的需求与应用。技术研发人员：蒋国成,焦思棋,余农,王永东,张宁,汪倩受保护的技术使用者：科来思生物科技（重庆）有限公司技术研发日：技术公布日：2024/6/18