一种三菌人工光合混菌系统的构建方法

本发明涉及工业微生物，具体为一种三菌人工光合混菌系统的构建方法。

背景技术：

1、顺式粘康酸（cis, cis-muconic acid，简称ma）是一种天然存在的有机酸，其为不饱和的二羧酸，分子式为c6h6o4，分子量142.11。顺式粘康酸的衍生物包括己二酸、对苯二甲酸等商业中间体，这些中间体主要用于商业生产各类纺织品、塑料包装品等领域。2023年，粘康酸的市场价格为每公斤1.5美元，全球产量每年约为7.9万吨，预计2024年市场规模将达到1.1亿美元。顺式粘康酸的生物合成主要通过利用葡萄糖等碳源的从头合成，或者以芳香族化合物为底物进行生物降解。从头合成顺式粘康酸主要通过莽草酸途径，利用途径中的有关中间代谢物作为前体进行合成。以芳香族化合物为底物，首先要求宿主菌株能够对其有一定的耐受能力，随后通过相关降解途径或者外源酶进行生物合成顺式粘康酸。尽管目前已经在多种微生物细胞工厂中开展了顺式粘康酸的生物合成工作，但是还没有出现过使用人工光合混菌系统合成顺式粘康酸的研究。而现有工作均以异养菌为底盘，培养过程需要大量额外的糖或芳香族化合物作为底物，不仅增加了顺式粘康酸生物合成的成本，还会释放大量co2影响环境。

2、蓝细菌能够利用太阳能和二氧化碳作为唯一能源和碳源进行放氧光合作用，且具有生长速度快、固碳效率高、遗传操作容易、培养方法简单等优势，使其成为“负碳”生产化学品的理想细胞工厂。糖类是蓝细菌中碳水化合物的重要存在形式，同时也是蓝细菌作为细胞工厂的代表性产物。在过去几十年的代谢工程研究中，研究人员已经在异养微生物底盘，如大肠杆菌、酵母菌中积累了丰富的工程化改造经验，并建立了多种遗传操作工具。自然界中，光合微生物混菌体系中不同菌株之间存在相互作用，这种关系的存在使得混菌体系表现出稳定性、适应性等多方面的优势。受此启发，研究人员开始利用工程化方法对自然条件下广泛存在的“自养-异养”混菌系统进行模拟，将产糖蓝细菌与产化学品异养菌进行混合培养，构建光驱动的“人工光合混菌系统”作为“负碳”生物合成平台。

3、谷氨酸棒状杆菌是一种兼性好氧的革兰氏阳性菌，最佳生长温度在30到32℃之间，最适ph在7.0到7.5之间，细胞呈现短杆棒状。2003年，代表性菌株谷氨酸棒状杆菌13032基因组被完全测序。谷氨酸棒状杆菌具有较强的环境适应能力，对多种物质具有较高的耐受性，生长速度较快，代谢转化效率较高，已经成为科学研究、工业生产等领域的模式菌株。现有研究主要通过分子生物学手段消除顺式粘康酸的分解途径或者重塑前体碳流量，并加入芳香化合物为底物或者以糖类为碳源从头合成顺式粘康酸。无论采用哪种生物合成方式，均需要加入大量碳源维持菌体生长。在以葡萄糖作为碳源，分别以儿茶酚、苯酚等芳香族化合物为前体生产顺式粘康酸的研究中，顺式粘康酸的摩尔产率能达到100%。

4、因此，提供一种三菌人工光合混菌系统的构建方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有的缺陷而提供的一种三菌人工光合混菌系统的构建方法，仅依靠光照和co2，不需要额外添加有机碳源进行顺式粘康酸的生物合成。

2、实现上述目的的技术方案是：

3、一种三菌人工光合混菌系统的构建方法，包括：

4、步骤s1，将茶碱诱导型启动子ptho、大肠杆菌w蔗糖转运蛋白基因cscb、终止子trbcl进行融合，并与表达载体psi-spe进行连接，将形成的重组表达载体1；

5、步骤s2，将强启动子pcpc560、拟南芥苯丙氨酸裂解酶基因pal、终止子trbcl进行融合，并与表达载体psi-spe进行连接，形成的重组表达载体2；

6、步骤s3，将重组表达载体1与重组表达载体2分别转入聚球藻7942中，分别得到蔗糖分泌菌株7942-cscb与反式肉桂酸生产菌株7942-pal；

7、步骤s4，将基因catb上下游同源臂片段进行融合，基因phdr上下游同源臂片段进行融合，并分别与表达载体pk18mobrpsl进行连接，得到重组表达载体3和重组表达载体4；

8、步骤s5，将重组表达载体3和重组表达载体4依次转入谷氨酸棒状杆菌13032中，得到顺式粘康酸生产菌株cgb-cp；

9、步骤s6，以聚球藻7942与谷氨酸棒状杆菌13032单独培养的培养基nbg与cg12为基础衍生出四种测试培养基m1、m2、m3和m4；

10、步骤s7，分别将得到蔗糖分泌菌株7942-cscb、反式肉桂酸生产菌株7942-pal和顺式粘康酸生产菌株cgb-cp在四种测试培养基中的生长与生产情况综合分析，得到最适合三菌人工光合混菌系统的最佳培养基为m4；

11、步骤s8，分别在30°c、32°c、34°c和37°c条件下，使用nbg和m4培养基分别对两种聚球藻7942基因工程菌和谷氨酸棒状杆菌13032基因工程菌进行培养，检测菌体的生长及蔗糖、反式肉桂酸和顺式粘康酸产量，得到最佳培养温度为32°c；

12、步骤s9，选择m4培养基和最佳培养温度32°c作为构建条件，进而建立三菌人工光合混菌系统。

13、优选的，所述步骤s1中，以质粒puc-tho为模板扩增得到茶碱诱导型启动子ptho；以质粒puc-cscb为模板扩增得到大肠杆菌w蔗糖转运蛋白基因cscb；以整合型质粒pcp3031为模板扩增得到终止子trbcl。

14、优选的，所述步骤s1中，质粒puc-tho是由茶碱诱导型启动子ptho核苷酸序列进行合成的；质粒puc-cscb是由大肠杆菌w蔗糖转运蛋白基因cscb进行合成的；表达载体psi-spe是用于聚球藻pcc 7942的整合型质粒，整合位点为中性位点nsi。

15、优选的，所述步骤s2中，以集胞藻6803基因组为模板扩增得到强启动子pcpc560；以质粒puc-pal为模板扩增得到拟南芥苯丙氨酸裂解酶基因pal；以整合型质粒pcp3031为模板扩增得到终止子trbcl。

16、优选的，所述步骤s2中，质粒puc-pal是由拟南芥苯丙氨酸裂解酶基因pal核苷酸序列进行合成的。

17、优选的，所述步骤s4中，以谷氨酸棒状杆菌13032基因组为模板扩增得到基因catb上下游同源臂片段；以谷氨酸棒状杆菌13032基因组为模板扩增得到基因phdr上下游同源臂片段。

18、优选的，所述步骤s6中，

19、nbg培养基1 l组成包括：1.5g的硝酸钠、0.02g的碳酸钠、0.075g的七水合硫酸镁、0.04g的磷酸氢二钾、0.001g的乙二胺四乙酸、2.86g的硼酸、0.006g的柠檬酸铁铵、0.036g的二水合氯化钙、0.0494g的六水合硝酸钴、0.079g的五水合硫酸铜、0.39g的五水合钼酸钠、0.222g的七水合硫酸锌、1.81g的四水合氯化锰、0.36g的茶碱、2.29g的tes和8.766g的氯化钠，加水至1l；

20、cg12培养基1 l组成包括：10g的硫酸铵、2g的尿素、1g的磷酸二氢钾、1g的磷酸氢二钾、0.25g的七水合硫酸镁、42g的mops，0.2mg的生物素，0.01g的氯化钙，0.033g的原儿茶酸，0.011g的七水合硫酸亚铁、0.011g的一水合硫酸锰、0.001g的七水合硫酸锌、0.2mg的硫酸铜和0.02mg的六水合氯化镍，加水至1l；

21、m1培养基1 l组成包括：nbg培养基成分、1g的尿素和0.5g的硫酸铵，加水至1l；

22、m2培养基1 l组成包括：nbg培养基成分、1g的尿素、0.5g的硫酸铵、0.1mg的生物素、0.005g的氯化钙、5.5mg的七水合硫酸亚铁、5.5mg的一水合硫酸锰、0.5mg的七水合硫酸锌、0.1mg的硫酸铜、0.01mg的六水合氯化镍和0.125g的七水合硫酸镁，加水至1l；

23、m3培养基1 l组成包括：nbg培养基成分、1g的尿素、0.5g的硫酸铵、0.1mg的生物素、0.005g的氯化钙、5.5mg的七水合硫酸亚铁、5.5mg的一水合硫酸锰、0.5mg的七水合硫酸锌、0.1mg的硫酸铜、0.01mg的六水合氯化镍、0.125g的七水合硫酸镁和0.0165g的原儿茶酸，加水至1l；

24、m4培养基1 l组成包括：nbg培养基成分、1g的尿素、0.5g的硫酸铵、0.1mg的生物素、0.005g的氯化钙、5.5mg的七水合硫酸亚铁、5.5mg的一水合硫酸锰、0.5mg的七水合硫酸锌、0.1mg的硫酸铜、0.01mg的六水合氯化镍、0.125g的七水合硫酸镁、0.0165g的原儿茶酸、0.5g的磷酸二氢钾和0.5g的磷酸氢二钾，加水至1l。

25、优选的，所述步骤s7中，最适培养基m4的确定过程包括：

26、步骤s71，在光强100μmol photons m-2 s-1，转速160rpm，温度为37℃条件下，以初始od750约为0.1将蔗糖分泌菌株7942-cscb分别接种于25 ml nbg、m1、m2、m3和m4培养基中；

27、步骤s72，每组共计使用3个生物平行，培养5天，每24 h测定od750数值并绘制生长曲线，并取培养液上清40μl作为待测样品，利用蔗糖检测试剂盒对蔗糖定量并绘制蔗糖生产曲线；

28、步骤s73，在光强100μmol photons m-2 s-1，转速160rpm，温度为37℃条件下，以初始od750约为0.1将反式肉桂酸生产菌株7942-pal分别接种于25 ml nbg、m1、m2、m3和m4培养基中；

29、步骤s74，每组共计使用3个生物平行，培养5天，每24 h测定od750数值并绘制生长曲线，并取培养液上清500μl作为待测样品，利用hplc对反式肉桂酸进行定量并绘制生产曲线；

30、步骤s75，在光强100μmol photons m-2 s-1，转速160rpm，温度为30℃条件下，以初始od630约为0.04将顺式粘康酸生产菌株cgb-cp分别接种于25 ml cg12、m1、m2、m3和m4培养基中；

31、步骤s76，并向其中添加终浓度为200mg/l的蔗糖，以及终浓度为20 mg/l反式肉桂酸标准品，每组共计使用3个生物平行，培养48 h，24 h时补加100 mg/l蔗糖；

32、步骤s77，并每12 h测定od630数值并绘制生长曲线，并且取培养液上清500μl作为待测样品，使用hplc进行对顺式粘康酸进行定量并绘制生产曲线；

33、步骤s78，通过根据蔗糖分泌菌株7942-cscb、反式肉桂酸生产菌株7942-pal和顺式粘康酸生产菌株cgb-cp的分别产生的蔗糖、反式肉桂酸和顺式粘康酸生产曲线确定最合适的培养基为m4。

34、优选的，所述步骤s8中，最适培养条件32℃的确定过程包括：

35、步骤s81，在光强100μmol photons m-2 s-1，转速160rpm，温度为30℃、32℃和34℃条件下，以初始od750约为0.1将蔗糖分泌菌株7942-cscb接种于25 ml nbg培养基中；

36、步骤s82，每组共计使用3个生物平行，培养5天，每24 h测定od750数值并绘制生长曲线，并取培养液上清40μl作为待测样品，利用蔗糖检测试剂盒对蔗糖定量并绘制蔗糖生产曲线；

37、步骤s83，在光强100μmol photons m-2 s-1，转速160rpm，温度为32℃和34℃条件下，以初始od750约为0.1将反式肉桂酸生产菌株7942-pal接种于25 ml nbg培养基中；

38、步骤s84，每组共计使用3个生物平行，培养5天，每24 h测定od750数值并绘制生长曲线，并取培养液上清500μl作为待测样品，利用hplc对反式肉桂酸进行定量并绘制生产曲线；

39、步骤s85，在光强100μmol photons m-2 s-1，转速160rpm，温度为32℃、34℃和37℃条件下，以初始od630约为0.04将顺式粘康酸生产菌株cgb-cp接种于25 ml m4培养基中；

40、步骤s86，并在34℃和37℃条件下的m4培养基中添加终浓度为200 mg/l的蔗糖，以及终浓度为20 mg/l反式肉桂酸标准品，在32℃条件下的m4培养基中添加终浓度为100 mg/l的蔗糖，以及终浓度为20 mg/l反式肉桂酸标准品；

41、步骤s87，每组共计使用3个生物平行，培养48 h，24 h时补加起始蔗糖浓度的一半，每12h测定od630数值并绘制生长曲线，并取培养液上清500μl作为待测样品，利用hplc对顺式粘康酸进行定量并绘制生产曲线；

42、步骤s88，通过根据蔗糖分泌菌株7942-cscb、反式肉桂酸生产菌株7942-pal和顺式粘康酸生产菌株cgb-cp的分别产生的蔗糖、反式肉桂酸和顺式粘康酸生产曲线确定最合适的培养温度为32℃。

43、本发明的有益效果是：本发明通过获得建立三菌人工光合混菌系统的培养基组成及培养条件，进而得到生产顺式粘康酸的三菌人工光合混菌系统，人工光合混菌系统能够实现顺式粘康酸的负碳生物合成，即仅依靠光照和co2，不需要额外添加有机碳源进行顺式粘康酸的生物合成。