一种提高重组人胶原蛋白羟化率的方法与流程

本发明属于生物，具体涉及一种提高重组人胶原蛋白羟化率的方法。

背景技术：

1、胶原蛋白是动物体内一类重要的蛋白质，广泛分布于皮肤、软骨、血管等组织，参与细胞的迁移、分化和繁殖，对维护细胞、组织、器官的正常生理功能起着重要的作用，在食品、饲料、美容、化妆品、医药等领域应用普遍。

2、胶原蛋白是由肽三联体gly-x-y组成，其中x和y理论上可以是任何氨基酸。然而，脯氨酸对x位置有偏好，而羟脯氨酸对y位置有偏好。羟脯氨酸是在胶原蛋白合成后，经脯氨酸羟化酶作用，将脯氨酸进行羟基化修饰后形成的。

3、天然胶原蛋白具有稳定的三重螺旋结构。研究表明，缺乏羟脯氨酸的胶原蛋白分子在生理温度下不能形成稳定的三重螺旋结构，且胶原蛋白重要结构序列中常常含有羟脯氨酸。含有羟脯氨酸的胶原蛋白，在结构上更接近人胶原蛋白，拥有优异的生物学活性，是高级的生物材料。因此，提高胶原蛋白羟基化水平，获得更接近天然高级结构的胶原蛋白具有巨大的市场潜力和前景。

4、由于发酵表达产率高、培养基简单等特点，毕赤酵母常用于重组人胶原蛋白的表达。但现有技术中，毕赤酵母表达体系通常使用aox启动子来控制重组人胶原蛋白的表达，该方法无法实现人胶原蛋白和人羟化酶两种蛋白的分别调控，且通过该方法获得的重组人胶原蛋白中羟脯氨酸占比较低，难以满足胶原蛋白的市场发展需求。

技术实现思路

1、本发明针对上述毕赤酵母表达系统中，胶原蛋白羟化率低的问题提供了一种提高重组人胶原蛋白羟化率的方法。

2、为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：一种提高重组人胶原蛋白羟化率的方法，包括以下步骤：

3、步骤一、构建重组人胶原蛋白表达质粒；

4、步骤二、构建人羟化酶表达质粒，包括构建新型thi11双启动子载体和连接人羟化酶表达序列；

5、步骤三、将重组人胶原蛋白表达质粒和人羟化酶表达质粒转化到毕赤酵母中并筛选获得能够共表达人胶原蛋白和人羟化酶的重组菌株；

6、步骤四、将重组菌株，用甲醇、维生素b1诱导培养，对获得重组人胶原蛋白进行纯化后，用液相法检测重组人胶原蛋白中脯氨酸、羟脯氨基酸的含量。

7、作为优选，所述步骤一中的构建重组人胶原蛋白表达质粒的方法为：选取能够编码不含n短端肽的全长人iii型胶原α1链核苷酸序列，根据酵母密码子偏好进行优化，合成所需重组人胶原蛋白dna序列，并连接到毕赤酵母表达质粒上，形成重组人胶原蛋白表达质粒。

8、作为优选，步骤一中的所述的重组人胶原蛋白表达质粒中使用的为aox启动子。

9、作为优选，所述步骤二中的构建thi11双启动子载体方法为：合成thi11启动子序列，并通过限制性内切酶及t4连接酶连接到赤酵母表达质粒上，形成thi11双启动子质粒。

10、作为优选，所述构建thi11双启动子载体的方法中毕赤酵母表达质粒为ppic3.5k、ppic9k、ppiczα或pgapzα。

11、作为优选，所述步骤二中的构建人羟化酶表达质粒的方法为：根据人羟化酶alpha和beta亚基蛋白序列以及酵母密码子偏好进行优化，合成所需的dna片段后，依次连接到thi11双启动子载体上，形成人羟化酶表达质粒。

12、作为优选，所述beta亚基蛋白序列上的信号肽更换为αmf信号肽。

13、作为优选，所述步骤三中的毕赤酵母为x-33菌株、gs115菌株或smd1168菌株。

14、作为优选，所述步骤四中诱导培养时维生素b1的含量为0-100μg/l。

15、与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

16、(1)本发明构建了毕赤酵母表达菌株，该菌株由aox启动子控制的人胶原蛋白表达和由thi11启动子控制的人羟化酶表达，通过控制甲醇和维生素b1的添加量，实现了人胶原蛋白和人羟化酶的独立表达控制，即两蛋白既能共同表达又能分别调控。

17、（2）本发明通过毕赤酵母表达体系，构建由aox启动子控制的人胶原蛋白表达载体和由thi11启动子双启动子控制的人羟化酶表达载体，并在重组菌株诱导表达过程中，控制菌株在甲醇的培养条件下维生素b1的添加量调控了羟化酶表达，提升了重组人胶原蛋白中羟脯氨酸的占比，显著提高了重组人胶原蛋白羟基化率。

18、（3）根据本发明的方法生产获得了全长的重组人胶原蛋白，且该重组蛋白可耐受胃蛋白的消化，具有良好的稳定性。此外，使用该方法获得人胶原蛋白不存在致热原问题，有效的避免了免疫原性的产生。

技术特征：

1.一种提高重组人胶原蛋白羟化率的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的提高重组人胶原蛋白羟化率的方法，其特征在于，所述步骤一中的构建重组人胶原蛋白表达质粒的方法为：选取能够编码不含n短端肽的全长人iii型胶原α1链核苷酸序列，根据酵母密码子偏好进行优化，合成所需重组人胶原蛋白dna序列，并连接到毕赤酵母表达质粒上，形成重组人胶原蛋白表达质粒。

3.根据权利要求1所述的提高重组人胶原蛋白羟化率的方法，其特征在于，所述步骤一中的所述的重组人胶原蛋白表达质粒中使用的为aox启动子。

4.根据权利要求1所述的提高重组人胶原蛋白羟化率的方法，其特征在于，所述步骤二中的构建thi11双启动子载体方法为：合成thi11启动子序列，并通过限制性内切酶及t4连接酶连接到毕赤酵母表达质粒上，形成thi11双启动子表达载体。

5.根据权利要求4所述的提高重组人胶原蛋白羟化率的方法，其特征在于，所述构建thi11双启动子载体的方法中毕赤酵母表达质粒为ppic3.5k、ppic9k、ppiczα或pgapzα。

6.根据权利要求5所述的提高重组人胶原蛋白羟化率的方法，其特征在于，所述步骤二中的构建人羟化酶表达质粒的方法为：根据人羟化酶alpha亚基、beta亚基蛋白序列以及酵母密码子偏好进行优化，合成相应dna片段，并通过限制性内切酶及t4连接酶依次连接到thi11双启动子表达载体上，形成人羟化酶表达质粒。

7.根据权利要求6所述的提高重组人胶原蛋白羟化率的方法，其特征在于，所述beta亚基蛋白序列上的信号肽更换为αmf信号肽。

8.根据权利要求1所述的提高重组人胶原蛋白羟化率的方法，其特征在于，所述步骤三中的毕赤酵母为x-33菌株、gs115菌株或smd1168菌株。

9.根据权利要求1所述的提高重组人胶原蛋白羟化率的方法，其特征在于，所述步骤四中诱导培养时维生素b1的含量为0-100μg/l。

技术总结本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高重组人胶原蛋白羟化率的方法，包括以下步骤：选取全长胶原蛋白核酸序列，连接到含AOX启动子的表达载体，同时构建THI11双启动子表达载体并连接能够编码人羟化酶核酸序列，形成人羟化酶表达载体；将两表达载体共同转化到毕赤酵母中筛选获得可共表达人胶原蛋白和羟化酶的重组表达菌株；对重组表达菌株进行诱导培养，调节两种诱导剂获得高羟化率的重组人胶原蛋白；相比现有技术，本发明实现了人胶原蛋白与羟化酶的独立调控，提高了重组人胶原蛋白中的羟脯氨基酸的占比，获得具有良好稳定性的重组人胶原蛋白。技术研发人员：刘宁,吕宏博受保护的技术使用者：山东美瑞生物技术有限公司技术研发日：技术公布日：2024/6/18