一种体内来源单倍体细胞制作类脑器官的方法

本发明属于类脑器官的制备，特别涉及一种体内来源单倍体细胞制作类脑器官的方法。

背景技术：

1、神经退行性疾病已逐渐成为威胁人类健康的主要因素。近年来，阿尔茨海默症，帕金森病及肌萎缩侧索硬化症等疾病引起了全世界的广泛关注，然而目前世界上尚无有效的治疗方法。因此有必要系统的解析神经退行性疾病发生的机制。

2、哺乳动物单倍体细胞系因其产生纯合基因型的优势近年来被广泛用于高通量遗传学筛选，以揭示重要生命进程或疾病发生的关键调控基因。哺乳动物单倍体神经谱系细胞系的建立将会成为解析神经系统疾病的发生机制的理想工具。前期文献报道所建立的单倍体神经干细胞类似细胞为体外分化所得，异质性较大，不利于功能基因的探索。除此以外，目前所报道的小鼠类脑器官的建立方法均为组织或胚胎干细胞来源，尚未有神经干细胞来源的小鼠类脑器官的报道。

3、公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种体内来源单倍体细胞制作类脑器官的方法，从而克服上述现有技术中的缺陷。

2、为了实现上述目的，本发明提供了一种体内来源单倍体细胞制作类脑器官的方法，包括以下步骤：

3、步骤一：将bcl2过表达的小鼠单倍体胚胎干细胞通过胚胎注射的方法获得重构胚胎，并将重构胚胎移植回0.5天假孕母鼠的输卵管中，在胚胎发育到e8.5天时进行解剖，分离体节组织；

4、步骤二：将分离后的体节组织培养于神经干细胞培养基中，并通过流式分选富集单倍体细胞，建立小鼠单倍体神经干细胞系；

5、步骤三：将获得的小鼠单倍体神经干细胞系培养于类脑培养液中，经过生长和空间折叠获得单倍体神经干细胞来源的小鼠类脑器官；

6、步骤四：采用免疫荧光细胞和分子生物学进行鉴定。

7、进一步的，作为优选，所述步骤一还包括以下步骤：

8、s1：对性成熟的icr母鼠进行超数排卵处理，并与公鼠进行合笼，第二天见栓的母鼠用于获取受精卵；

9、s2：在每个受精卵胚胎中注射8-12个bcl2过表达的小鼠单倍体胚胎干细胞构成重构胚胎；

10、s3：将重构胚胎移植到0.5天假孕母鼠的输卵管中，继续饲养至e8.5天；

11、s4：在e8.5天将假孕母鼠处死，用无菌器械分离子宫，在体式镜下分离胚胎，剖出e8.5的完整胚胎，用解剖针分离该胚胎体节区域。

12、进一步的，作为优选，所述步骤s2中在受精卵胚胎4-8细胞时期时注射。

13、进一步的，作为优选，所述步骤二还包括以下步骤：

14、s11：将分离后的体节组织培养于神经干细胞培养基中每3-5天使用0.05% 的胰蛋白酶-edta消化液进行消化传代形成细胞悬液；

15、s12：采用荧光染料对消化后的细胞悬液进行染色；

16、s13：通过流式分选富集单倍体1n峰，建立小鼠单倍体神经干细胞系。

17、进一步的，作为优选，所述步骤三还包括以下步骤：

18、s111：将状态良好的小鼠单倍体神经干细胞消化为单细胞，离心后去除上清；

19、s112：用神经培养基础培养基重悬细胞沉淀并进行悬浮培养，24小时内观察单倍体神经干细胞重聚成3d球状结构；

20、s113：用神经培养基础培养基添加2μm sb-431542(mce, hy10431,usa) 和dmh1(mce, hy12273, usa)悬浮诱导3d球状结构 7天后贴壁培养继续诱导8天，待神经花环样结构明显形成；

21、s114：采用毛细针将神经管样结构切下，随培养基转移至15ml离心管中自然沉降，用神经培养基础培养基添加2μm sb-431542(mce, hy10431,usa) 、dmh1(mce, hy12273,usa)和2%的b27的培养基重悬神经管样的细胞球样沉淀，继续悬浮培养2-3天，即可自组织形成球状的前脑背侧类脑器官。

22、与现有技术相比，本发明的一个方面具有如下有益效果：

23、本发明将bcl2过表达的小鼠单倍体胚胎干细胞通过胚胎注射的方法获得重构胚胎，再经过分离培养建立体内来源的小鼠单倍体神经干细胞，最后通过体外培养形成单倍体神经干细胞来源的小鼠类脑器官，异质性较小，有助于功能基因的探索，系统的解析神经退行性疾病发生的机制；

24、本发明对建立的小鼠单倍体神经干细胞以及获得的小鼠类脑器官均进行了鉴定，可以提高小鼠类脑器官制作的可靠性。

技术特征：

1.一种体内来源单倍体细胞制作类脑器官的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种体内来源单倍体细胞制作类脑器官的方法，其特征在于，所述步骤一还包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的一种体内来源单倍体细胞制作类脑器官的方法，其特征在于，所述步骤s2中在受精卵胚胎4-8细胞时期时注射。

4.根据权利要求1所述的一种体内来源单倍体细胞制作类脑器官的方法，其特征在于，所述步骤二还包括以下步骤：

5.根据权利要求1所述的一种体内来源单倍体细胞制作类脑器官的方法，其特征在于，所述步骤二之后对小鼠单倍体神经干细胞特异性标志物进行鉴定。

6.根据权利要求1所述的一种体内来源单倍体细胞制作类脑器官的方法，其特征在于，所述步骤三还包括以下步骤：

技术总结本发明公开了一种体内来源单倍体细胞制作类脑器官的方法，包括以下步骤：步骤一：将BCL2过表达的小鼠单倍体胚胎干细胞通过胚胎注射的方法获得重构胚胎，并将重构胚胎移植回0.5天假孕母鼠的输卵管中，在胚胎发育到E8.5天时进行解剖，分离体节组织；步骤二：将分离后的体节组织培养于神经干细胞培养基中，并通过流式分选富集单倍体细胞，建立小鼠单倍体神经干细胞系；步骤三：将获得的小鼠单倍体神经干细胞系培养于类脑培养液中，经过生长和空间折叠获得单倍体神经干细胞来源的小鼠类脑器官；步骤四：采用免疫荧光细胞和分子生物学进行鉴定。本发明通过体外培养形成单倍体神经干细胞来源的小鼠类脑器官，异质性较小，有助于功能基因的探索。技术研发人员：高倩,聂韶晨,张文豪,赵乙丁,刘大勇受保护的技术使用者：南开大学技术研发日：技术公布日：2024/6/18