一种利用烟草表达弓形虫TgGRA3蛋白的方法及其在诊断猫弓形虫感染中的应用

本发明涉及一种利用烟草表达弓形虫tggra3蛋白的方法，还涉及tggra3在诊断猫弓形虫感染中的应用。本发明属于生物。

背景技术：

1、刚地弓形虫(toxoplasma gondii nicolle&manceaux，1908)是一种专性原生动物寄生虫，可引起弓形虫病。弓形虫感染被世界组织和粮食及农业组织列为全球第四大最常见的食源性寄生虫感染(torgerson et al.2015)。据估计，全球有超过三分之一的人口感染了弓形虫。弓形虫感染的高流行率已成为一个公共卫生问题，严重危害全球人口，特别是孕妇和免疫功能低下者(zhou et al.2021；shirbazou etal.2013)。由于弓形虫可感染几乎所有的温血动物，宿主广泛，也给畜牧业造成巨大的经济损失。弓形虫通常通过污染水、食物、土壤和植物引起人类和动物感染(pan et al.2017；kurth et al.2021)。此外，猫等猫科动物作为弓形虫的最终宿主，通过排出卵囊污染环境，在弓形虫病向人类和动物传播中起着重要作用。由于与人类密切接触的宠物猫数量不断增加，它们正成为人类感染弓形虫的主要来源(karimi et al.2022；liu,cao,andzhu 2014)。此外，不计其数的流浪猫增加了弓形虫病的患病率，并引发了公共卫生问题(levy and crawford 2004)。开发简单、快速、灵敏、廉价的猫刚地弓形虫感染诊断方法对预防和控制猫刚地弓形虫在人与动物中的传播至关重要。

2、弓形虫病的诊断可分为直接法和间接法。包括病原体检查和聚合酶链反应(pcr)在内的直接方法具有特异性，但往往灵敏度较低(robert et al.2021)。对于间接方法，通常使用酶联免疫吸附试验(elisa)、间接血凝试验(iha)和western blot检测弓形虫抗体(khan andnoordin 2020)。其中，elisa最适合临床检测，操作简单，特异性和敏感性高。elisa通常通过抗原检测血清中igg,igm和iga抗体(tomasi,schlit,and stadtsbaeder1986)。因此，筛选有效抗原对elisa的发展具有重要意义。然而，弓形虫蛋白往往难以异质表达。

3、生产可溶性和功能性重组蛋白是生物技术领域的主要目标之一，因为从天然来源获得令人满意的产量是不可能的(ferrer-miralles et al.2015)。大肠杆菌是最常用的重组蛋白表达系统。然而，值得一提的是，在许多情况下，原核表达系统对成功的异源蛋白生产造成了严重的限制。当然，真核表达系统具有翻译后加工修饰系统，表达的外源蛋白更接近于天然蛋白。不同的真核表达系统已经被开发出来，如酵母、昆虫和哺乳动物细胞系统(vieira gomes et al.2018)。然而，对于表达的真核蛋白，很难从细胞中实现真正的分泌，其输出量非常低(unzueta et al.2015)。无细胞重组蛋白合成系统使这种难以获得的分子的生产成为可能，因为它可以调整反应介质，并且不需要支持细胞代谢和活力。

4、致密颗粒蛋白在寄生液泡(pv)中分泌，并已成功地在大肠杆菌中作为融合蛋白表达(jacobs,vercammen,and saman 1999)。通过对弓形虫抗原蛋白筛选数据的分析，在抗体谱中发现了大量具有较强免疫原性的抗原，其中许多是致密颗粒蛋白，如gra2、gra3、gra4、gra5、gra6和gra8(et al.2018)。

5、本发明利用烟叶成功表达了弓形虫抗原gra3，并评价了猫血清igg抗体与该抗原的反应。

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于提供一种利用烟草表达弓形虫tggra3蛋白的方法。

2、本发明的目的之二在于提供弓形虫tggra3蛋白在诊断猫弓形虫感染中的应用。

3、为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

4、本发明提供的一种利用烟草表达弓形虫tggra3蛋白的方法，包括以下步骤：

5、(1)载体构建

6、根据toxodb中tggt1_227280gra3序列，从弓形虫rh速殖子扩增gra3基因开放阅读框全长，扩增引物如下:gra3-forwardprimer:5’-atggctgatcaacctgaaaa-3’，gra3-reverse primer:5’-gttgttgttattgttattag-3’，并将纯化好的pcr反应产物通过pacⅰ和notⅰ酶切位点连接至pjl-trbo载体，转化大肠杆菌感受态细胞；吸取感受态细胞加到含50μg/mlkan+的lb培养平板上，将细胞均匀涂开，将平板置于37℃恒温箱倒置过夜培养，将测序正确的阳性单克隆提取重组质粒，命名为pjl-trbo-gra3-6×his，并将其转化农杆菌感受态，然后加入无抗生素的lb液体培养基，于28℃振荡培养2～3小时后5000rpm离心一分钟收菌，留取80-150μl上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含50μg/mlkan+和100μg/mlrif+的yep平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天；

7、(2)烟草瞬时转化

8、挑取测序正确的pjl-trbo-gra3-6×his阳性单克隆菌株至含相应抗生素的yep培养基中，在28℃摇床上200rpm孵育过夜至od600≈1.2，在室温下5000rpm离心10min收集微生物，在含有10mm mes,10mm mgcl2和150μmas的渗透培养基中重悬至od600≈0.3-0.5，避光培养3-6小时；将生长旺盛期的水培本烟叶片浸泡在农杆菌悬浮液中，并施加约0.4mpa的真空30-45秒后取出用水冲洗，将浸染后的植株放在与渗透前相同的生长条件下生长，30-40h后收集表达重组蛋白的烟叶；

9、(3)蛋白提取以及纯化

10、将表达重组蛋白的烟叶称取重量后液氮速冻，并在提前预冷的研钵中用液氮快速研磨，直到叶片材料被磨成非常细的粉末，然后将粉末转移至离心管，用2倍体积的提取液充分振荡后，在4℃下孵育30min，期间可在摇床上4℃旋转，样品在4℃下以12,000rpm离心20分钟，收集上清液，根据上清液的体积加入1mm pmsf，混合均匀备用；采用真空过滤装置过滤上清液，去除不溶性物质，得到粗提蛋白tggra3；

11、(4)纯化

12、将获得的粗提蛋白tggra3装在ni-nta预装柱上用蛋白纯化仪纯化，在280nm处监测吸光度，收集蛋白峰对应的蛋白，最后将纯化的tggra3蛋白用his抗体免疫沉淀，并通过westernblotting检测。

13、其中，优选的，步骤(3)中所述的提取液为含有200mm nacl、0.2％tween20以及1mmpmsf的50mm tris-hcl，ph 8.0。

14、其中，优选的，步骤(4)中将获得的粗提蛋白tggra3装在ni-nta预装柱上用蛋白纯化仪以1.0min/ml的流速纯化，用结合缓冲液平衡柱，洗涤缓冲液洗脱杂蛋白，洗脱缓冲液梯度洗脱tggra3蛋白。

15、其中，优选的，所述的结合缓冲液为含有0.2mnacl和10mm咪唑的50mm tris-hcl，ph＝8.0；所述的洗涤缓冲液为含有0.2mnacl和40mm咪唑的50mm tris-hcl，ph 8.0；所述的洗脱缓冲液为含有0.2m nacl,500mm咪唑的50tris-hcl，ph＝8.0。

16、进一步的，本发明还提供了按照以上任一项所述的方法制备得到的弓形虫tggra3蛋白在制备诊断猫弓形虫感染的试剂中的应用。

17、其中，优选的，所述的试剂为elisa检测试剂。

18、其中，优选的，所述的试剂用于检测猫弓形虫抗体时按照以下步骤进行：elisa板上包被his抗体，4℃孵育过夜，用pbst洗涤1次，37℃终止反应2h；然后用pbst洗涤5次；将按照权利要求1-3任一项所述的方法制备得到的弓形虫tggra3蛋白用脱脂牛奶等量稀释，接种到包被有his抗体的孔中，板洗净后，将5％v/v脱脂牛奶1:100稀释的待检测猫血清加入板中，37℃孵育2h；然后加入1:1500稀释的酶标抗猫抗体，37℃孵育2h；最后，加入tmb底物溶液进行反应；用2m硫酸停止反应，采用酶标仪读取od450nm吸光度。

19、相较于现有技术，本发明的有益效果是：

20、本发明首先利用大肠杆菌表达了多种具有潜在抗原性的弓形虫致密颗粒蛋白，包括tggra2、tggra3、tggra4、tggra5、tggra6、tggra7和tggra8，但只有tggra6和tggra7成功表达。然而实验数据表明tggra7和tggra6对于检测猫弓形虫感染都不够敏感。因此，本发明发明人尝试在烟草中表达tggra3，烟草是外源蛋白异源表达的有效宿主，结果tggra3重组蛋白在烟草中成功表达。然后本发明选取7份tggra6-elisa和tggra7-elisa检测结果为阴性或od值接近临界值的样品(这些样品被认为是真阳性，因为它们被tglys-elisa检测为阳性)检测重组tggra3的抗原性。结果表明，tggra3能与这些样品中的抗体发生强烈反应。重要的是，与tggra6-或tggra7-elisa相比，tggra3-elisa能够更加灵敏的区分阳性猫样本和阴性对照，这表明tggra3在诊断猫弓形虫感染方面具有良好的潜力。