多功能蛋白表达系统及其制备方法和应用

【】本发明涉及生物，特别涉及多功能蛋白表达系统及其制备方法和应用。

背景技术

0、背景技术：

1、蛋白异源表达是利用dna重组技术，将不同物种的目的基因与载体dna在体外进行重组，然后把这种重组dna分子引入受体细胞，并使之增殖和表达的技术，对推动人类科学有重要的作用。蛋白异源表达的本质是基因表达，基因表达是生物大分子研究如结构生物学研究的重要基础，药物和蛋白酶等的大规模生产都是基因异源表达的成果。然而，基因的表达充满了挑战性，基因是否能够表达和表达量高低并不是随心所欲的，一直以来，科学家都致力于寻找基因高效表达的方法。基因本身，载体，宿主，诱导剂，环境等都是影响基因表达的因素。

2、基因表达的实验中，本领域技术人员通常考虑的问题是表达系统的选择，载体的选择，以及表达标签的选择。如表达系统分为原核表达系统如大肠杆菌表达系统和真核表达系统如昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统，以及无细胞表达系统等。载体根据宿主的不同可以分为细菌表达载体、昆虫细胞表达载体、哺乳动物细胞表达载体和无细胞表达系统载体等。常用的表达标签有his、gst、mbp标签等，标签的作用是促进外源基因在异源宿主中的表达和后续的亲和纯化等。在现有技术的实验过程中如果发现宿主不合适或者标签不合适再进行更换，则需要重新合成重组质粒，这样会导致工作量就会很大，费时费钱。因此，如何能将外源基因简单、快速的更换于不同的表达载体表达系统，实现基因在原核细胞、真核细胞、无细胞表达系统的通用表达是目前的蛋白表达系统技术中研究的空白。

技术实现思路

0、技术实现要素：

1、鉴于研究进展，有必要提供多功能蛋白表达系统及其制备方法和应用，该系统能将外源基因简单、快速的更换于不同的表达载体中，实现基因在原核细胞和真核细胞的通用表达，是目前的蛋白表达系统技术中研究的空白。

2、为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

3、本发明包括多功能蛋白表达系统，所述蛋白表达系统包括多个不同来源的表达载体；所述多个不同来源的表达载体改进方法为：对原始载体利用限制性内切酶双酶切载体或者利用固定引物通过pcr获得线性dna分子，对载体进行插入、替换或缺失的技术手段对线性dna分子进行处理，使不同的来源的表达载体均包含适合同源重组克隆方式的统一序列：“gttctgttccaggggcccggatcctaaaagcttgtcgagaagtactagaggat”(seq id no.2)；所述统一序列可被接口引物对扩增，接口引物对的上游序列如：5’-aagcttgtcgagaagtactagagg-3’(seq id no.13)所示，下游序列如：5’-ggatccgggcccctggaacagaac-3’(seq id no.14)所示。

4、进一步的，所述蛋白表达系统包括pst系列载体、plib系列载体、pcdna-8his-3c载体、peg-8his-mcherry-3c载体和t7cf-8his-mcherry-3c载体；所述pst系列载体包括pst-8his-3c载体、pst-8his-gst-3c载体和pst50-8his-mbp-3c载体；所述plib系列载体包括plib-8his-3c载体、plib-8his-gst-3c载体和plib-8his-mbp-3c载体；

5、所述pst系列载体由大肠杆菌表达载体pst50trc4-hpcdhfr改进获得；所述plib系列载体由昆虫表达系统bigbag系列中的plib载体改进获得；所述pcdna-8his-3c载体由哺乳动物细胞表达系统质粒pcdna3.1改进获得；所述peg-8his-mcherry-3c载体由真核表达载体peg-bacmam载体改进获得；所述t7cf-8his-mcherry-3c载体由无细胞表达系统载体t7p14-degfp改进获得。

6、所述载体pst-8his-3c的改进方法为：利用ndeⅰ和bsrgⅰ酶对载体pst50trc4-hpcdhfr线性化处理后，连接如seq id no.3所示的dna片段即得；所述pst50trc4-hpcdhfr线性化处理后的基因序列如seq id no.1所示；

7、所述载体pst-8his-gst-3c的改进方法为：利用同源重组克隆技术，将载体pst-8his-3c的8his与hrv3c位点之间的9个碱基agcggatct替换成seq id no.8所示的dna片段即得；

8、所述载体pst-8his-mbp-3c的改进方法为：利用同源重组克隆技术，将载体pst-8his-3c的8his与hrv3c位点之间的9个碱基agcggatct替换成seq id no.4所示的dna片段即得；

9、所述载体plib-8his-3c的改进方法为：利用bamhⅰ和hindiii酶对载体plib线性化处理后，利用同源重组克隆技术连接如seq id no.6所示的dna片段即得；所述plib线性化处理后的基因序列如seq id no.5所示；

10、所述载体plib-8his-gst-3c的改进方法为：利用同源重组克隆技术，将载体plib-8his-3c的8his与hrv3c位点之间的9个碱基agcggatct替换成seq id no.8所示的dna片段即得；

11、所述载体plib-8his-mbp-3c的改进方法为：利用同源重组克隆技术，将载体plib-8his-3c的8his与hrv3c位点之间的9个碱基agcggatct替换成seq id no.4所示的dna片段即得；

12、所述载体pcdna-8his-3c的改进方法为：利用nheⅰ和xbaⅰ酶对载体pcdna3.1线性化处理后，连接如seq id no.3所示的dna片段即得；所述pcdna3.1线性化处理后的基因序列如seq id no.7所示；

13、所述载体peg-8his-mcherry-3c的改进方法为：利用rsrii和xbaⅰ酶对载体peg-bacmam线性化处理后，连接如seq id no.10所示的dna片段即得；所述peg-bacmam线性化处理后的基因序列如seq id no.9所示；

14、所述载体t7cf-8his-mcherry-3c的改进方法为：利用ncoⅰ和xhoⅰ酶对载体t7p14-degfp线性化处理后，连接如seq id no.12所示的dna片段即得；所述t7p14-degfp线性化处理后的基因序列如seq id no.11所示。

15、本发明还包括所述多功能蛋白表达系统在真核生物和/或原核生物以及无细胞表达系统中生产蛋白的应用。

16、本发明还包括将不同目的基因接入所述多功能蛋白表达系统的引物对，所述引物对的上游引物序列为5’-gttctgttccaggggcccggatcc+目的基因上20个特异性的碱基匹配序列-3’，下游引物序列为5’-atcctctagtacttctcgac aagctt+目的基因上20个特异性的碱基反向匹配序列-3’。

17、本发明还包括应用所述多功能蛋白表达系统进行蛋白生产的方法，所述方法为：

18、(1)用引物对对不同的目的基因进行扩增，所述引物对的上游引物序列为5’-gttctgttccaggggcccggatcc+目的基因上20个特异性的碱基匹配序列-3’，下游引物序列为5’-atcctctagtacttctcgac aagctt+目的基因上20个特异性的碱基反向匹配序列-3’。同时用统一的正向引物：5’-aagcttgtcgagaagtactagagg-3’(seq id no.13)，反向引物：5’-ggatccgggcccctggaacagaac-3’(seq id no.14)扩增权利要求1所述的多功能蛋白表达系统载体中的一个或者数个质粒。

19、(2)然后将步骤(1)扩增出来的目的产物和载体产物利用同源重组酶连接，得到重组质粒，将重组质粒在大肠杆菌、昆虫细胞和/或哺乳动物细胞中进行转化、表达或者在无细胞表达系统中表达，最后纯化即得。

20、本发明具有如下有益效果：

21、1、本技术的多功能蛋白表达系统是基于大肠杆菌表达载体、昆虫细胞表达载体、哺乳动物细胞表达载体、无细胞表达系统载体改进的，细菌表达载体骨架pst50trc4-hpcdhfr和昆虫细胞表达载体骨架plib的核苷酸序列，利用限制性内切酶双酶切获得线性dna分子，经过处理，使插入的核苷酸序列与线性载体有一段overhand，然后就可以利用gibson assembly在一管反应中快速组装出新的多克隆表达载体。在这里，我们用这种方法对细菌表达载体pst50trc4-hpcdhfr为模板进行改造设计出pst-8his-3c表达载体。为了使其更好地服务于基因表达，又分别连接了gst,8his-mbp标签，设计pst-8his-gst-3c和pst50-8his-mbp-3c表达载体。为了证明这种设计载体的方法的普遍性，我们还对昆虫细胞表达载体plib进行改造，设计出plib-8his-3c表达载体，在此基础上又分别添加了几个常用的标签，设计出plib-8his-gst-3c、plib-8his-mbp-3c。对哺乳动物细胞表达载体pcdna3.1、peg-bacmam载体改进，设计了pcdna-8his-3c、peg-8his-mcherry-3c表达载体，对无细胞表达系统载体t7p14-degfp改进获得t7cf-8his-mcherry-3c，它既能促进基因在大肠杆菌中表达，又能促进基因在昆虫细胞、哺乳动物细胞、无细胞表达系统中以及低成本快速构建克隆，进行表达测试。

22、2、本技术表达系统中改进之后的载体均均包含适合同源重组克隆方式的统一序列：“gttctgttccaggggcccggatcctaaaagcttgtcgagaagtactagaggat”，该序列与正向引物f：5’-gttctgttccaggggcccggatcc+特异性目的基因上的20个碱基的匹配序列-3’，反向引物r：5’-atcctctagtacttctcgac aagctt+特异性目的基因上的20个碱基的反向匹配序列-3’相配合，能将不同目的基因快速的连接到蛋白表达系统中的不同载体上。在更换不同载体时，更换引物重新做pcr，实现了，仅用一对引物，就能将目的基因扩增到不同的载体，大大简化了目的基因在不同载体中表达的实验方案，能够促进基因在原核细胞、真核细胞和无细胞表达系统的通用表达。