具有抗肿瘤活性的取代硫脲基磷酰胺酯类化合物的制作方法

专利名称：具有抗肿瘤活性的取代硫脲基磷酰胺酯类化合物的制作方法技术领域：本发明是一种有关新型广谱抗肿瘤药物的合成方法。氮芥磷酸衍生物作为抗癌药物早在五十年代就开始了研究，有些因具有良好的抗癌活性已用于临床，如Endoxan，Holoxan等，但它们具有损害骨髓细胞及泌尿系统等副作用[Arnold，H.；Bourseaux，F.，Angew.Chem.，1958，70，539]。因此，进一步对氮芥磷酸衍生物作结构修饰，寻找高效、低毒的抗肿瘤药物，对促进肿瘤的化疗作用具有十分重要的意义。有些磷酰硫脲类化合物对人畜十分安全，甚至无毒，在医药上还可用作杀线虫剂、抗肿瘤剂及体内驱虫剂。此外，将α-氨基酸引入药物，可以作为药物的有效载体，增强药物的脂溶性，降低药物的毒性，提高药物的活性，增强药物的化疗作用[Szekerke M.，Cancer Treatment Rept.，l976，60，347；Cox P，J.，Biochem.Pharmacol.，1979，28，2045；Deyine，K.G.，etal.，Kinchington，D.AIDS 1990，4，371]。本发明将取代硫脲基及生命体内源物质α-氨基酸引入氮芥磷酸衍生物，目的是寻求一种高效低毒的抗肿瘤药物。所合成化合物具有广谱抗肿瘤活性，尤其对人乳腺癌(BCAP)、人胃癌(MGC)及人白血病(HL-60)等瘤株有很好抑制作用。本发明的抗肿药物是通过亲核取代反应和亲核加成反应而得到的一类新型氮芥磷酸衍生物，其合成方法如下 Y1＝Y2＝o-Me，m-Me，p-Me，o-Cl，m-Cl ，p-Cl，H，m-NO2，p-NO2，p-Br；R＝H，o-Cl，m-Cl，p-Cl，p-Br，o-Me，m-Me，p-Me，m-NO2，p-NO2，2，4-Cl2，2，4-Me2，2，3，4，5，6-Cl5；Y3与R相同；R1＝H，Me，i-Pr，PhCH2，i-Bu，CH2CH2SCH3，s-Bu上述产物(I)和(II)用作抗肿瘤药物具有较好的广谱的抗肿瘤活性(见实例1-实例12)；本发明的抗肿瘤药物的合成路线简单，工艺操作简便，原料易得，产物易于分离和纯化，合成周期短。实例1 o-对氯苯基-N’，N’-二-(2-氯乙基)-N3-邻氯苯基硫脲基磷酰胺酯的制备及应用在100ml反应瓶中，加入4mmol o-对氯苯基-N，N-二-(2-氯乙基)氯代磷酰胺酯和30ml无水乙腈。室温搅拌下分别加入8.2mmol硫氰酸钾。在12-20℃搅拌反应8-12小时。在低于60℃下减压蒸干溶剂，剩余物用50ml(25ml×2)无水苯分两次提取，并用10ml(5ml×2)无水苯洗滤渣两次。合并滤液与洗液，减压蒸去溶剂，以20ml无水乙腈作反应溶剂，室温下滴加4mmol邻氯苯胺和10ml乙腈的混合液，搅拌反应4-6小时，滤出所得固体产物，滤液浓缩，加适量无水乙醚，冷冻放置，又析出部分产品，合并所得固体，用丙酮-乙醚重结晶，得产品1.28g，产率63.7％，m.p.131-2℃，分子式C17H18Cl4N3O2PS。元素分析计算值(％)C，40.72；H，3.59；N，8.38；实测值(％)C，40.48；H，3.47；N，8.45；1HNMR(CDCl3)，δ(ppm)3.36-3.82(m，8H，2ClCH2CH2)，7.1-7.92(m，8H，8Ph-H)，8.16(d，1H，NH)，10.34(s，1H，NH)。抗肿瘤活性测试方法[Journal of Immunological methods89，271-277(1986)]，取对数生长期细胞，加入96孔培养板。待贴壁后加入受试化合物，培养72h，加入MTT，4h后除去培养液，加入酸化异丙醇，振荡后测定量570nm处光密度值。把实例1得到的产物用上述方法测试得到体外抗肿瘤活性结果如下 实例2 o-邻甲苯基-N’，N’-二-(2-氯乙基)-N3-对氯苯基硫脲基磷酰胺酯的制备及应用操作同实例1，用o-邻甲苯基-N，N-二-(2-氯乙基)氯代磷酰胺酯中间体及用对氯苯胺代替邻氯苯胺进行反应。产品为白色固体，从丙酮-乙醚重结晶，m. p.143-4℃，收率68.4％。分子式C18H21Cl3N3O2PS。元素分析计算值(％)C，44.95；H，4.37；N，8.74；实测值(％)C，44.71；H，4.34；N，8.70；1HNMR(CDCl3)，δ(ppm)2.40(s，3H，CH3)，3.44-3.92(m，8H，2ClCH2CH2)，7.12-7.58m，8H，8Ph-H)，8.48(d，1H，NH)，10.5(s，1H，NH)。生测结果如下 实例3 o-2，4-二甲苯基-N’，N’-二-(2-氯乙基)-N3-对氯苯基硫脲基磷酰胺酯的制备及应用操作同实例2，用o-2，4-二甲苯基-N，N-二-(2-氯乙基)氯代磷酰胺酯中间体进行反应。产品为白色固体，从丙酮-乙醚重结晶，m.p.126-7℃，收率61.1％。分子式C19H23Cl3N3O2PS。元素分析计算值(％)C，46.11；H，4.65；N，8.49；实测值(％)C，46.13；H，4.48；N，8.26；1HNMR(CD3C(O)CD3)，δ(ppm)2.32-2.40(ds，6H，2CH3)，3.44-3.90(m，8H，2ClCH2CH2)，7.12-7.92(m，8H，7Ph-H，NH)，10.5(s，1H，NH)。生测结果如下 实例4 o-邻甲苯基-N’，N’-二-(2-氯乙基)-N3-对溴苯基硫脲基磷酰胺酯的制备及应用操作同实例2，用对溴苯胺代替对氯苯胺进行反应。产品为白色固体，从丙酮-乙醚重结晶，m.p.148-9℃，收率67.7％。分子式C18H21Cl2BrN3O2PS。元素分析计算值(％)C，41.14；H，4.00；N，8.00；实测值(％)C，41.06；H，3.68；N，8.08；1HNMR(CD3C(O)CD3)，δ(ppm)2.40(s，3H，CH3)，3.44-3.90(m，8H，2ClCH2CH2)，7.04-7.68(m，8H，8Ph-H)，9.52(d，1H，NH)，10.5(s，1H，NH)。生测结果如下 实例5 o-对氯苯基-N’，N’-二-(2-氯乙基)-N3-乙氧羰基异丙基取代亚甲基硫脲基磷酰胺酯的制备及应用在100ml反应瓶中，加入4mmol o-对氯苯基-N，N-二-(2-氯乙基)氯代磷酰胺酯和30ml无水乙腈。室温搅拌下分批加入8.2mmol硫氰酸钾，搅拌反应8-10小时，在不超过60℃下减压蒸去溶剂，剩余物用50ml(25ml×2)无水苯分两次提取，并用10ml(5ml×2)苯洗滤渣两次，合并滤液与洗液，减压蒸去溶剂，以20ml无水乙腈作反应溶剂，将4mmol dl-α-缬氨酸乙酯的10ml无水乙腈溶液室温下滴入，并反应6-15h。减压浓缩，加适量乙醚，冷冻放置，析出白色固体，抽滤，用氯仿-乙醚重结晶。m.p.125℃，收率61.9％。分子式C18H27Cl3N3O4PS。元素分析计算值(％)C，41.66；H，5.21；N，8.10；实测值(％)C，41.42；H，5.38；N，7.96；1HNMR(CDCl3)，δ(ppm)0.82-0.99(m，6H，2CH3)，1.21(m，3H，CH3)，2.4(m，1H，CH)，3.4-3.68(m，8H，2ClCH2CH2)，4.18(m，2H，CH2)，4.82(m，1H，CH)，7.10-7.36(m，4H，4Ph-H)，7.8(w，1H，NH)，9.2(q，1H，NH，J＝7.11Hz)；31PNMR(CDCl3)，δ(ppm)1.091及0.916。生测结果如下 实例6 o-对氯苯基-N’，N’-二-(2-氯乙基)-N3-乙氧羰基(2-甲硫基)乙基取代亚甲基硫脲基磷酰胺酯的制备及应用操作同实例5，用d1-α-蛋氨酸乙酯代替d1-α-缬氨酸乙酯进行反应。产品为白色固体，从氯仿-乙醚重结晶，m.p.139℃，收率54.7％。分子式C13H27Cl3N3O4PS2。元素分析计算值(％)C，39.24；H，4.90；N，7.63；实测值(％)C，39.23；H，4.90；N，7.63；1HNMR(CDCl3)，δ(ppm)1.24-1.29(m，3H，CH3)，2.05-2.10(ds，3H，CH3)，1.8-2.6(m，4H，2CH3)，3.36-3.72(m，8H，2ClCH2CH2)，4.19-4.25(m，2H，CH2)，4.90(q，1H，CH)，7.21-7.32(m，4H，4Ph-H)，7.6(w，1H，NH)，9.3(q，1H，NH，J＝7.2Hz)；31PNMR(CDCl3)，δ(ppm)0.952及0.901。生测结果如下 实例7 o-对氯苯基-N’，N’-二-(2-氯乙基)-N3-乙氧羰基仲丁基取代亚甲基硫脲基磷酰胺酯的制备及应用操作同实例5，用d1-α-异亮氨酸乙酯代替d1-α-缬氨酸乙酯进行反应。产品为白色固体，从氯仿-乙醚重结晶，m.p.134℃，收率60.2％。分子式C19H29Cl3N3O4PS。元素分析计算值(％)C，42.82；H，5.45；N，7.89；实测值(％)C，42.93；H，5.48；N，7.87；1HNMR(CDCl3)，δ(ppm)0.7-0.96(m，6H，2CH3)，1.2-1.31(m，3H，CH3)，1.0-1.6(m，2H，CH2)，1.9-2.1(m，1H，CH)，3.52-3.63(m，8H，2ClCH2CH2)，4.17-4.22(m，2H，CH2)，4.85(m，1H，CH)，7.22-7.34(m，4H，4Ph-H)，7.76-7.9(w，1H，NH)，9.2(q，1H，NH，J＝7.64Hz)。生测结果如下 实例8 o-对氯苯基-N’，N’-二-(2-氯乙基)-N3-乙氧羰基苄基取代亚甲基硫脲基磷酰胺酯的制备及应用操作同实例5，用1-α-苯丙氨酸乙酯代替d1-α-缬氨酸乙酯进行反应。产品为白色固体，从乙醚-石油醚中重结晶，m.p.132-3℃，收率51.4％。分子式C22H27Cl3N3O4PS。元素分析计算值(％)C，46.60；H，4.77；N，7.41；实测值(％)C，46.28；H，4.57；N，7.44；1HNMR(CDCl3)，δ(ppm)1.23(t，3H，CH3)，3.16(t，2H，CH2)，3.48-3.66(m，8H，2ClCH2CH2)，4.17(q，2H，CH2)，5.12(q，1H，CH)，7.07-7.31(m，5H，4Ph-H，NH)，8.98(d，1H，NH，J＝7.40Hz)；31PNMR(CDCl3)，δ(ppm)1.837；IR(cm-1)3392(m，NH)，1733(s，C＝O)，1513，1537，1482(s，苯环)，1328(m，C＝S)，1228(s，P＝O)。生测结果如下 实例9 2-氮芥-4，6-二硫代-5-对甲苯基-1，3，5，2-磷杂三氮六元环-2-氧化物的制备将2g(7.7mmol)原料(a)置于100ml三口瓶中，加入40ml无水乙腈，0-10℃下分批加入1.9g(19.6mmol)原料(c)[过量23％]。0-25℃下搅拌3h，TLC跟踪证实为一个产物点时，停止搅拌，减压除去溶剂，重结晶得无色晶体(G)1.13g，产率为91.16％，m.p.64-65℃，1HNMR(δ，ppm)3.4-3.8(m，8H，2ClCH2CH2)；31PNMR(δ，ppm)28.8，IR(cm-1)2997(w)，1966(s，-N＝C＝S)，1265(m，P＝O)，1096，1024，982；MS(EI，m/e)303(M+)，305(m+＋2)，254(基峰)192。将2g(6.6mmol)中间体(G)置于250ml反应瓶中，加入80ml无水甲苯，-30～-20℃下慢慢滴入含等摩尔对甲苯胺的50ml无水甲苯溶液，40min滴完。控制此温度搅拌2-2.5hr.升至-5～0℃搅拌约2hr直至固体析出量不再变化。脱去溶剂，得一无定形白色粉末，用丙酮∶乙醚＝2∶3混合溶剂重结晶，得2.38g白色固体，产率87.74％，m.p.114-116℃，1HNMR(δ，ppm)2.3(s，3H，CH3)，3.5-3.9(mb，8H，2ClCH2CH2)，7，1-7.3(mb，2H，C3H5)；IR(cm-1)3090(w，C6H4)，2977，2820(s，CH2，CH3)，1985(wb，-N＝C-SH)，1601，1590，1536，1504(s，N＝C，C＝C)1426，1380(m，CH3，CH2弯曲振动)，1320(m，P＝O)，1190，1160，10000，980，元素分析计算值(％)C，37.96；H4.01；N，13.76；实测值(％)C，37.84；H，4.16；N，13.62。实例102-氮芥-4，6-二硫代-5-间硝基苯基-1，3，5，2-磷杂三氮六元环-2-氧化物的制备按实例9的合成方法，取2g(6.6mmol)中间体G置于250ml反应瓶中，加入80ml无水甲苯，在-20～-10℃下慢慢滴入含等摩尔间硝基苯胺的80ml无水甲苯溶液，约45min滴完。保持-10℃反应2hr，0℃继续搅拌3hr，升温30℃搅拌约1hr直至析出固体量不再增多。脱去溶剂，得一浅黄色固体化合物，用丙酮∶乙醚＝1∶1混合溶剂重结晶得1.87g浅黄色粉末，产品产率64.11％m.p.109-110℃，1HNMR(δ，ppm)3.4-4(mb，8H，2ClCH2CH2)，7.2-7.9(tmb，4H，取代硝基苯基)，IR(cm-1)3156(w)，2984，2810(m，CH2)，2030(wb，-N＝C-SH)，1597，1576，1517(s，N＝C)，1354，1427(s，CH2)，1205(m，P＝O)，1196，1096，999。元素分析计算值(％)C，33.38；H3.26；N，12.97；实测值(％)C，33.64；H，3.25；N，12.88。实例11 2-氮芥-2，6-二氧代-4-硫代-5-对甲苯基-1，3，5，2-磷杂三氮六元环化合物的制备将2g(7.72mmol)原料(a)溶于40ml无水乙腈中，-10℃下，分批加入0.5g(7.7mmol)原料(b)，搅拌1-1.5hr后，升温0～5℃，搅拌24hr，经TLC跟踪示原料a基本消失，将温度降至0℃以下。搅拌下分批加入0.7g(7.2mmol)原料(c)，保持此温度反应约50min，升至室温搅拌4hr。减压除去溶剂，用无水苯将中间体(H)萃取出来，纯化得无色粘稠物(H) 1.68g，产率75.56％。1HNMR(δ，ppm)3.3-3.9(mb，8H，2ClCH2CH2)，IR(cm-1)2900(w)，2090(m，N＝C＝O)，1965(s，N＝C＝S)，1264(m，P＝O)，1115，1042，981(m)；MS(CI，m/e)287(M+)，238(M+-ClCH2，基峰)，252，147，163，176，42，63，49。将新制备的中间体(H)2g(6.94mmol)置于250ml反应瓶中，迅速使其溶于80ml无水甲苯中。在-25～-20℃下，慢慢滴入等摩尔对甲苯胺的50ml无水甲苯溶液中，约30min滴完。保持此温度搅拌约1hr，升温-10～0℃搅拌4-6hr.直至析出固体量不再增多，脱去溶剂，得白色粉末，用丙酮∶乙醚＝1∶3混合溶剂重结晶，得白色固体2.26g，产品产率82.44％。m.p.108～109℃；1HNMR(δ，ppm)；2.34(s，3H，CH3)，3.2～3.9(mb，8H，2ClCH2CH2)，7.1～7.7(dmb，-C6H4)；IR(cm-1)3205(w，NH)，3090(w)2977，2819(s，CH3，CH2)，1975(wb，-N＝C-SH)，1610，1590(s，C＝O，N＝C)，1536，1504(m，-C＝C-)，1426，1382，1320(m，P＝O)，1191，1162，1000，980；MS(EI，m/e)376(M+-H2O)，349，300，254(基峰)，227，163，107。元素分析计算值(％)C，39.50；H，4.33；N，14.17；实测值(％5)C，39.72；H，4.24；N，14.22。实例12 2-氮芥-2，6-二氧代-4-硫代-5-间硝基苯基-1，3，5，2-磷杂三氮六元环化合物(PS)的制备及应用中间体(H)的合成方法同实例11。取新制备的2g中间体H，迅速溶于80ml无水甲苯中，在-25～-20℃下慢慢滴入等摩尔间硝基苯胺30ml无水甲苯20ml无水丙酮溶液，30～45min滴毕。保持-20℃下反应约2-3hr.，升至-5～0℃反应约2hr，10～20℃再继续反应1～2hr直到固体析出量不再增多。脱去溶剂，得浅黄色固体，用丙酮∶乙醚＝1∶1混合溶剂重结晶，得浅黄色粉末2.36g，产品产率79.83％m.p.117～118℃；1HNMR(δ，ppm)；3.48～4(mb，8H，2ClCH2CH2)，7.61～9(tmb，4H，C6H3)；IR(cm-1)3284(w，NH)，3053(m)2991，2820(m)，1983(w，-N＝C-SH)，1619(m，C＝O)，1587，1519，1478(m，N＝C，C＝C)，1342(s)，1203(m，P＝O)，1180，1112，998。元素分析计算值(％)C，33.81；H，3.46；N，16.68；实测值(％)C，33.81；H，3.31；N，16.42。PS毒性试验小白鼠经口试验实验方法首先进行预试验，确定剂量范围，然后将小白鼠随机分为四组，每组五只，给药前隔夜禁食，将配成不同剂量的药液经口一次给药，投药后小白鼠自由摄食、饮水于室温下观察一周。随时观察记录出现的症状和死亡情况。试验结果进行统计学处理，计算LD50(mg/Kg)，取95％可信限。PS小白鼠经口毒性试验结果 根据化学物质急性毒性分级标准，雄、雌小白鼠急性经口毒性属于低毒。PS对小鼠S-180肿瘤生长抑制试验试验方法给小鼠接种肿瘤，24h后称体，随机分成4组，每组10只，分设1个对照组和3个PS给药组(I、II、和III)，给药组I、II、和III组分别腹腔注射0.03，0.1和0.3mg/Kg·d-1的PS，对照组腹腔注射等体积二甲亚砜生理盐水溶液。连续给药10天，停药24h后解剖出肿瘤，称瘤重，计算出各给药组的抑瘤率。试验结果PS对小鼠S-180肿瘤生长的抑制作用 从以上试验结果可以看出，PS对小鼠S-180移植性肿瘤有一定程度的抑制作用。PS抗肿瘤活性实验方法(美国测)细胞系检测取12×8的微试孔板，每孔加入瘤细胞悬液，含瘤细胞数为2×105个，然后于每孔加入0.2ml含10％FBS和2mM L-谷酰胺的RPMI培养基，进行培养。药物用少量DMSO溶解(DMSO的终浓度为0.025％)。微试孔板前二排为对照组，其余各排则加用培养液稀释的药物，受试药物的浓度为10μg/ml，在CO2孵箱中培养48小时。取100μl细胞样品用库尔特计数器计数细胞总数、取20μl细胞样品加入20μl0.5％台盼蓝染料染色30秒，用血球计数器计数死细胞数，微试孔板12排均用台盼蓝染料检测死细胞数，前二排对照组用库尔特计数器计数细胞总数。3H-胸腺嘧啶掺入试验细胞培养的条件同上述细胞系检测，有些细胞瘤株则需加入10-7MPMA或5μg/ml PHA(植物血坏凝集系)，在数活细胞前16小时，这些细胞在PBS中用10μl含0.5μCi的3H-胸腺嘧啶脉动，然后用真空器吸入滤纸中，用蒸馏水冲洗3遍，滤纸干燥过夜，然后用液体闪烁计数器计数。权利要求1.具有抗癌活性的取代硫脲基磷酰胺酯类化合物，其特征在于它的化学结构为(ClCH2CH2)2NP(O)AA1，其中 X＝S(I1)，O(I2)Y＝o-Me，m-Me，p-Me，o-Cl，m-Cl，p-Cl，H，m-NO2，p-NO2，p-Br； R＝H，o-Cl，m-Cl，p-Cl，p-Br，o-Me，m-Me，p-Me，m-NO2，p-NO2，2，4-Cl2，2，4-Me2，2，3，4，5，6-Cl5；Y3与R相同；R1＝H，Me，i-Pr，PhCH2，i-Bu，CH2CH2SCHz3，s-Bu2.以(ClH2CH2)2NP(O)Cl2(a)为原料，将其与NaOCN(b)，KSCN(c)以及 (d)分别进行壹步或两步亲核取代反应，得中间体化合物(ClCH2CH2)2NP(O)(NCS)2(G)，(ClCH2CH2)2NP(O)(NCO)(NCS)(H)及(ClCH2CH2)2NP(O)(OR)(NCS)(P)，分别将其与取代苯胺(e)或H2NC(R1)HCO2Et(f)进行亲核加成反应，制备(I1)、(I2)、(II1)、(II2)的方法，其主要特征在于制备(I2)时，原料(a)(b)(c)的摩尔比为1～1.4∶1.0～0.95∶0.95～0.6，无水乙腈为溶剂，反应温度为-15-40℃得到中间体H，然后再与取代苯胺(e)反应，溶剂为无水甲苯，反应温度为-30-45℃，时间为25min～8h；由中间体(q)制备(P)时，q和b的摩尔比为1∶2.0～2.1，用q 4mmol、b 8.2mmol，溶剂为30ml无水乙腈，反应温度12-20℃，反应时间8-12小时，反应完毕后，在不超过60℃下减压蒸去溶剂，用无水苯提取，提取液经浓缩后得到(P)；用q与e各4mmol，溶剂为无水乙腈30ml，反应温度是室温，反应时间为4～6小时，制备II1；用(q)、(f)各4mmol，所用溶剂为无水乙腈30ml，反应温度是室温，反应时间为6-15小时，制备II2。3.按照权利要求1所述的化合物(I1)、(I2)，其特征在于它们有较高的抗癌活性及较低的毒性。全文摘要利用各种取代苯胺及α-氨基酸酯与氮芥双异硫氰酸酯、氮芥异氰异硫氰酸二酯及单异硫氰酸酯氯化物进行加成反应，得到了四个系列取代硫脲基及脲基氮芥磷酰胺类衍生物。该类化合物具有广谱的抗癌活性，对人胸癌、白血病、乳腺癌(BCAP)、胃癌(MGC)及结肠癌(HCT)等均有很好的抑制作用。小鼠毒性试验表明，此类化合物均属于低毒。其合成工艺简单，原料易得，因此是一类具有很好发展前景的新型高效、低毒的抗肿瘤化合物。文档编号C07F9/00GK1123285SQ94117518公开日1996年5月29日 申请日期1994年10月25日 优先权日1994年10月25日发明者陈茹玉, 毛丽娟, 王惠林, 周嘉 申请人:南开大学