一种提取分离原花青素的方法

专利名称：一种提取分离原花青素的方法技术领域：本发明属于天然产物医药保健领域，具体涉及一种分离提纯原花青素的方法要。背景技术：原花青素(Oligomeric Proantho Cyanidins， 0PC)是一禾中有着特殊分子结构的生物类黄酮，是目前国际上公认的清除人体内自由基最有效的天然抗氧化剂，具有非常强的体内活性。实验证明，0PC的抗自由基氧化能力是维生素E的50倍，维生素C的20倍，并吸收迅速完全，口服20分钟即可达到最高血液浓度，代谢半衰期达7小时之久。原花青素有改善血液循环、治疗糖尿病性视网膜病、减轻水肿、美白皮肤和抑制静脉曲张等功效，在欧洲花青素己用于临床治疗几十年。天然产物中存在两种最基本的原花青素单体， 一种为儿茶素，另一为表儿茶素，这两种单体通过聚合可形成寡聚体或多聚体，按聚合度的大小通常将二 四聚体称为低聚体，英文为Oligomeric p潔yanidins，简称0PCs或PC0s，五聚体以上贝愤为高聚体Procyanidolic polymers (PPC)。近年来，国内外学者对0 P C s的理化特性和生物特性进行了大量的研究工作，并取得突破性进展，在原花青素的提取分离上，也有大量的文献报道。在原花青素的提取主要是利用有机溶剂或水溶液(CN100384832C、 CN1613854A、 CN 1176919C)、酸溶液(CN 1193995C、CN 1169804C)或超临界C02体系(CN 1264729A、 CN 11G7110C、CN 1749253A)中将原料中的低聚原花青素提取出来，其中有的文献用到微波辅助提取(CN 1102589C)。有机溶剂提取，只能提取植物本体中的低聚原花青素，而高聚原花青素大部分还留在植物本体中。酸水可以将高聚原花青素降解成二聚体或三聚体甚至单体，然后提取出来，但是，同时会把原料的低聚体原花青素降解，而原花青素单体的抗氧化作用远远小于二聚体和三聚体原花青素，造成药效流失。超临界C02和微波辅助手段有助于提高原花青素的提取率，但是作用有限，而且往往还要求苛刻的工艺条件，不但造成生产成本的增加，还会造成部分原花青素的分解。原花青素的分离提纯主要有树脂吸附或柱层析法(CN100384832C、 CN 1923830A、 CN 1253446C、 CN 1169804C)、逆流萃取法(CN 1176919C)和膜分离法(CN 101100464A)和抗溶剂法(CN1613854A)，其中树脂吸附柱层析法和膜分离法主要是针对提取物中的一些糖类而采用的，而逆流萃取法利用原花青素和杂质在两种不同溶剂中的分配比不同达到分离目的，由于不同聚合度的原花青素在两种溶剂的分配比也不尽相同，所以，分离效果有限，工艺收率低。发明内容本发明的目的是提高一种率效高，分离效果好的提取分离原花青素的方法。本发明以富含原花青素的植物本体为原料，经过皮仁分离、碱水提取、有机溶剂萃取、水相中和、浓縮，加入甲醇提取其中的低聚原花青素，过滤，滤液蒸千干燥，得到低聚原花青素产品；滤饼干燥，得到高聚原花青素。植物本体往往含有很多的糖类、蛋白质和脂肪等，如果提取是将整个葡萄籽或沙棘籽粉碎、脱脂，然后提取，提取物的杂质含量较大，要得到纯度较高的产品，就必须增加复杂的分离程序，这样不但增加/生产成本，而且由于生产工序的增加，会或多或少的造成目标产物的损失或降解。如果能在提取之前对原料进行适当的预处理，分离除去原料中不含目标产物或目标产物含量较少的那部分，不但可以减少工艺的程序，增加原料的处理量，而且可以提高产品的品质。在本发明中，利用目前成熟的设备皮仁分离器将葡萄籽或沙棘籽进行皮仁分离，然后对原花青素含量丰富的籽皮进行提取，由于籽皮中糖类和蛋白质等含量很少，在提取之后，可以不进行柱层析或膜分离等工艺，而得到纯度较高的原花青素产品。目前，原花青素通常采用有机溶剂或酸水提取。有机溶剂提取只能提取植物本体中的低聚原花青素，大部分高聚原花青素还留在植物本体中。酸水可以将高聚原花青素降解成二聚体或三聚体甚至单体，然后提取出来，但是，同时会把原料的低聚体原花青素降解，而原花青素单体的抗氧化作用远远小于二聚体和三聚体原花青素，造成药效流失。我们在实验中发现，原花青素在碱水中比在有机溶剂和酸水中具有更大的溶解度，可以把低聚和高聚原花青素一起提取出来，提取率大，而且在工艺条件下原花青素化学稳定，不易发生变质或降解。本发明的具体操作步骤如下(1) 将葡萄籽或沙棘籽皮仁分离，种皮粉碎成io-so目，按固-液比为lg: 1-10 ml将其加入pH值为9-14的碱-水溶液、碱-醇-水或碱-丙酮-水溶液，在10-5(TC下，提取1-10小时，过滤；滤饼重复提取、过滤，直至滤液无色或颜色很浅；(2) 合并滤液，浓縮至重量为种皮原料重量的0.5-2倍，浓縮液用有机溶剂萃取，分液，得到有机相和水相，水相用酸中和后加入1-IO倍体积的甲醇或乙醇，搅拌，静置，过滤；(3) 滤液蒸发，所得固体用水洗涤后干燥，得到低聚原花青素产品，滤饼用水洗涤后干燥，得到高聚原花青素。如(1)所述，碱-水溶液、碱-醇-水或碱-丙酮-水溶液所用的碱是无机碱如NaOH、 Ca(0H)2、 K0H、 Na2C03、 Na跳、氨水；有机碱如乙二胺或三乙胺等，但不局限于上述碱；碱-醇-水溶液所用的醇为甲醇、乙醇或异丙醇等，水和醇的配比为体积比1:0.1-10;碱-丙酮-水溶液所用的水和丙酮的配比为体积比1:0. I-IO.如(2)所述，萃取用有机溶剂为不溶于水且不和碱反应的脂溶性溶剂，优选卤代烃、芳香烃、烃、醚类、酯类或醇类，卤代烃优选氯仿、二氯甲垸，芳香烃优选苯和甲苯，烃类优选石油醚、汽油、正己烷和环己烷等，酯类优选乙酸乙酯和乙酸甲酯，醚类优选乙醚，醇类优选正丁醇和2-丁醇。如(2)所述，中和所用的酸可以是任何不和原花青素发生氧化还原反应的酸，优选盐酸、硫酸、磷酸、硝酸等无机酸或乙酸、甲酸、二乙酸、乳酸等有机酸，但不局限于上述酸。本发明的特点本发明具有如下有点1. 用碱溶液提取，不但能提取其中的低聚原花青素，而且可以提取高聚原花青素，提取率髙。2. 对原料进行皮仁分离，不但增加设备效率，产品纯度较高，而且对原料中的蛋白质等营养成分没有不良影响。3. 整个过程简单易行，没有用到膜分离或柱层析等处理批量小、生产成本高的技术，而且可以得到高纯度的原花青素产品。4. 同时得到低聚原花青素和高聚原花青素两种产品。具体实施例方式实施例1(1) 将100克10目的葡萄籽种皮，用pH值为9的NaHC03水溶液1000ml， 5(TC下，提取10小时，过滤；滤饼重复提取、过滤，直至滤液接近无色。(2) 合并滤液，浓縮至100ml，浓縮液用正丁醇萃取，分液，得到有机相和水相，水相用盐酸中和后加入100ml的甲醇，搅拌，静置，过滤。(3) 滤液蒸发，用水洗涤后干燥，得到低聚原花青素产品7g，含量为88%，滤饼用水洗涤后干燥，得到高聚原花青素4g，含量为76%。实施例2(1) 将100克20目的沙棘籽种皮，用pH值为14的NaOH-水-甲醇(水甲醇二l: 5，v/v)溶液100ml， 20。C下，提取1小时，过滤；滤饼重复提取、过滤，直至滤液接近无色。(2) 合并滤液，浓縮至50ml，浓縮液用二氯甲垸萃取，分液，得到有机相和水相，水相用硫酸中和，加入500ml的乙醇，搅拌，静置，过滤。(3) 滤液蒸发，用水洗涤后干燥，得到低聚原花青素产品7g，含量为92%，滤饼用水洗涤后干燥，得到高聚原花青素8g，含量为72%。实施例3(1) 将100克40目的葡萄籽种皮，用pH值为10的Na2C03-水-乙醇(水乙醇二l: 0. l，v/v)溶液800ml， 3(TC下，提取8小时，过滤；滤饼重复提取、过滤，直至滤液接近无色。(2) 合并滤液，浓縮至80ml，浓縮液用氯仿萃取，分液，得到有机相和水相，水相用硝酸中和，加入400ml的甲醇，搅拌，静置，过滤。(3) 滤液蒸发，用水洗涤后干燥，得到低聚原花青素产品6.5g，含量为86%，滤饼用水洗涤后千燥，得到高聚原花青素5g，含量为80%。实施例4(1) 将100克50目的葡萄籽种皮，用pH值为13的NaOH-水-异丙醇(水异丙醇=1: 2，v/v)溶液600ml， 40。C下，提取6小时，过滤；滤饼重复提取、过滤，直至滤液接近无色。(2) 合并滤液，浓縮至120ml，浓縮液用苯萃取，分液，得到有机相和水相，水相用磷酸中和，加入240ml的甲醇，搅拌，静置，过滤。(3) 滤液蒸发，用水洗涤后干燥，得到低聚原花青素产品6g，含量为90%，滤饼用水洗涤后干燥，得到高聚原花青素5g，含量为75%。实施例5(1) 将100克60目的沙棘籽种皮，用pH值为10的NaHC03-水-丙酮(水丙酮=1: 0. 1，v/v)溶液900ml， 3(TC下，提取9小时，过滤；滤饼重复提取、过滤，直至滤液接近无色。(2) 合并滤液，浓縮至150ml，浓縮液用甲苯萃取，分液，得到有机相和水相，水相用乙酸中和，加入500ml乙醇，搅拌，静置，过滤。(3) 滤液蒸发，用水洗涤后干燥，得到低聚原花青素产品6.5g，含量为94%，滤饼用水洗涤后干燥，得到高聚原花青素8. 5g，含量为75%。 .实施例6(1)将100克80目的沙棘籽种皮，用pH值为12的NaOH-水-甲醇(水甲醇=1: 8，v/v)溶液300ml, 50。C下，提取5小 时，过滤；滤饼重复提取、过滤，直至滤液接近无色。(2) 合并滤液，浓縮至180ml，浓縮液用石油醚萃取，分液，得 到有机相和水相，水相用甲酸中和，加入800ml乙醇，搅 拌，静置，过滤。(3) 滤液蒸发，用水洗涤后干燥，得到低聚原花青素产品6g， 含量为95%，滤饼用水洗涤后干燥，得到高聚原花青素9g， 含量为62%。实施例7(1) 将100克20目的葡萄籽种皮，用pH值为14的KOH-水-乙 醇(水乙醇=1: 10，v/v)溶液100ml， 5(TC下，提取6 小时，过滤；滤饼重复提取、过滤，直至滤液接近无色。(2) 合并滤液，浓縮至200ml，浓縮液用汽油萃取，分液，得到 有机相和水相，水相用乙二酸中和，加入300ml甲醇，搅 拌，静置，过滤。(3) 滤液蒸发，用水洗涤后干燥，得到低聚原花青素产品8g， 含量为84%，滤饼用水洗涤后干燥，得到高聚原花青素3g， 含量为79%。实施例8(1) 将100克40目的沙棘籽种皮，用pH值为14的NaOH-水-异 内醇(水异丙醇二l: 5，v/v)溶液500ml， 4(TC下，提取 l小时，过滤；滤饼重复提取、过滤，直至滤液接近无色。(2) 合并滤液，浓縮至60ml，浓縮液用环己烷萃取，分液，得 到有机相和水相，水相用乳酸中和，加入400ml乙醇，搅 拌，静置，过滤。(3) 滤液蒸发，用水洗涤后干燥，得到低聚原花青素产品8g， 含量为93%，滤饼用水洗涤后干燥，得到高聚原花青素 10. 5g，含量为64%。实施例9(1)将100克20目的葡萄籽种皮，用pH值为12的Ca(0H)2-水-丙酮(水丙酮=1:1，v/v)溶液800ml，2(TC下，提取3小时，过滤；滤饼重复提取、过滤，直至滤液接近无色。(2) 合并滤液，浓縮至80ml，浓缩液用正己垸萃取，分液，得 到有机相和水相，水相用盐酸中和，加入200ml乙醇，搅 拌，静置，过滤。(3) 滤液蒸发，用水洗涤后干燥，得到低聚原花青素产品9g， 含量为87%，滤饼用水洗涤后干燥，得到高聚原花青素4g， 含量为71%。实施例10(1) 将100克40目的沙棘籽种皮，用pH值为12的三乙胺-水-丙酮(水丙酮=1: 10，v/v)溶液600ml， 3CrC下，提取8 小时，过滤；滤饼重复提取、过滤，直至滤液接近无色。(2) 合并滤液，浓縮至100ml，浓縮液用乙醚萃取，分液，得到 有机相和水相，水相用硫酸中和，加入300ml甲醇，搅拌， 静置，过滤。(3) 滤液蒸发，用水洗涤后干燥，得到低聚原花青素产品7g， 含量为96%，滤饼用水洗涤后干燥，得到高聚原花青素8g， 含量为81%。实施例11(1) 将100克60目的沙棘籽种皮，用pH值为14的NaOH-水-甲 醇(水甲醇二l: 1， v/v)溶液500ml， 2(TC下，提取2小 时，过滤；滤饼重复提取、过滤，直至滤液接近无色。(2) 合并滤液，浓縮至200ml，浓縮液用乙酸甲酯萃取，分液， 得到有机相和水相，水相用乳酸中和，加入300ml甲醇，搅 拌，静置，过滤。(3) 滤液蒸发，用水洗涤后干燥，得到低聚原花青素产品6g， 含量为89%，滤饼用水洗涤后干燥，得到高聚原花青素7. 5g， 含量为64%。实施例12(1)将IOO克10目的葡萄籽种皮，用pH值为12的乙二胺-水-乙醇(水乙醇=1: . 1，v/v)溶液700ml， 10。C下，提 取4小时，过滤；滤饼重复提取、过滤，直至滤液接近无色。(2) 合并滤液，浓縮至50ml，浓縮液用乙酸乙酯萃取，分液， 得到有机相和水相，水相用乙酸中和，加入300ml甲醇，搅 拌，静置，过滤。(3) 滤液蒸发，用水洗涤后干燥，得到低聚原花青素产品8g， 含量为85%，滤饼用水洗涤后干燥，得到高聚原花青素4g， 含量为75%。实施例13(1) 将100克20目的沙棘籽种皮，用pH值为12的氨水-水-异 丙醇(水异丙醇=1: 1，v/v)溶液600ml， l(TC下，提取 5小时，过滤；滤饼重复提取、过滤，直至滤液接近无色。(2) 合并滤液，浓縮至120ml，浓縮液用2-丁醇萃取，分液，得 到有机相和水相，水相用盐酸中和，加入200ml乙醇，搅拌， 静置，过滤。(3) 滤液蒸发，用水洗涤后干燥，得到低聚原花青素产品5. 5g， 含量为94%，滤饼用水洗涤后干燥，得到高聚原花青素8g， 含量为79%。权利要求1、一种提取分离原花青素的方法，其特征在于包括如下步骤(1)将葡萄籽或沙棘籽皮仁分离，种皮粉碎成10-80目，按固-液比为1g∶1-10ml将其加入pH值为9-14的碱-水溶液、碱-醇-水或碱-丙酮-水溶液，在10-50℃下，提取1-10小时，过滤；滤饼重复提取、过滤，直至滤液无色或颜色很浅；(2)合并滤液，浓缩至重量为种皮原料重量的0.5-2倍，浓缩液用有机溶剂萃取，分液，得到有机相和水相，水相用酸中和后加入1-10倍体积的甲醇或乙醇，搅拌，静置，过滤；(3)滤液蒸发，所得固体用水洗涤后干燥，得到低聚原花青素产品，滤饼用水洗涤后干燥，得到高聚原花青素。2、 如权利要求1所述的一种提取分离原花青素的方法，其特征在于 所述步骤(1)中碱-水溶液、碱-醇-水或碱-丙酮-水溶液所用的 碱是无机碱或有机碱。3、 如权利要求2所述的一种提取分离原花青素的方法，其特征在于 所述无机碱为NaOH、 Ca(0H)2、 K0H、 Na2C03、 NaHC03或氨水。4、 如权利要求2所述的一种提取分离原花青素的方法，其特征在于 所述有机碱为乙二胺或三乙胺。5、 如权利要求1所述的一种提取分离原花青素的方法，其特征在于 所述步骤(1)碱-醇-水溶液所用的醇为甲醇、乙醇或异丙醇，水 和醇的体积比为1: 0. 1-10。6、 如权利要求1所述的一种提取分离原花青素的方法，其特征在于 所述步骤(1)碱-丙酮-水溶液所用的水和丙酮的体积比为1: 0. 1-10.7、 如权利要求1所述的一种提取分离原花青素的方法，其特征在于 所述步骤(2)中萃取用有机溶剂为不溶于水且不和碱反应的脂溶 性溶剂。8、 如权利要求7所述的一种提取分离原花青素的方法，其特征在于 所述的脂溶性溶剂为卤代烃、芳香烃、烃、醚类、酯类或醇类。9、 如权利要求8所述的一种提取分离原花青素的方法，其特征在于 所述的卤代烃为氯仿或二氯甲烷，芳香烃炎苯或甲苯，烃类为石油醚、汽油、正己垸或环己烷，酯类为乙酸乙酯或乙酸甲酯，醚类为乙醚，醇类为正丁醇或2-丁醇。10、 如权利要求1所述的一种提取分离原花青素的方法，其特征在 于所述歩骤(2)中和所用的酸为任何不和原花青素发生氧化还原 反应的无机酸或有机酸。11、 如权利要求10所述的一种提取分离原花青素的方法，其特征在 于所述无机酸为盐酸、硫酸、磷酸或硝酸。有机酸为乙酸、甲酸、 二乙酸或乳酸。全文摘要一种提取分离原花青素的方法是将葡萄籽或沙棘籽皮仁分离，种皮粉碎成10-80目，按固-液比为1g∶1-10ml将其加入pH值为9-14的碱-水溶液、碱-醇-水或碱-丙酮-水溶液，在10-50℃下，提取1-10小时，过滤；滤饼重复提取、过滤，直至滤液无色或颜色很浅；合并滤液，浓缩至重量为种皮原料重量的0.5-2倍，浓缩液用有机溶剂萃取，分液，得到有机相和水相，水相用酸中和后加入1-10倍体积的甲醇或乙醇，搅拌，静置，过滤；滤液蒸发，所得固体用水洗涤后干燥，得到低聚原花青素产品，滤饼用水洗涤后干燥，得到高聚原花青素。本发明原料进料量小，产品纯度高，提取率高，绿色环保，工艺简洁，便于工业化生产。文档编号C07D311/00GK101565414SQ20091007466公开日2009年10月28日 申请日期2009年6月3日 优先权日2009年6月3日发明者侯相林, 邓天昇, 齐永琴 申请人:中国科学院山西煤炭化学研究所