作为抗增殖剂的稠合杂环谷氨酸衍生物的制作方法

专利名称：作为抗增殖剂的稠合杂环谷氨酸衍生物的制作方法技术领域：本发明涉及如下所定义的能够抑制甘氨酰胺核苷酸甲酰转移酶(GARFT)的一些化合物，还涉及中间体化合物，含有所述化合物的药物组合物，用于抑制GARFT的用途，及用于抑制高等生物或微生物如细菌、酵母和真菌的细胞生长和增殖的用途。这种效用包括抗肿瘤、抗炎、治牛皮癣和免疫抑制活性。还公开了这些化合物的制备方法。抗增殖剂这一大类包括抗代谢化合物。已知为抗叶酸(盐)剂的一特定小类抗代谢物是维生素叶酸的拮抗剂。一般来说，抗叶酸剂与叶酸的结构非常相似，并带有叶酸的特征性的P—苯甲酰基谷氨酸片段。叶酸的此谷氨酸片段在生理pH下带有双负离子。因此，此化合物和其类似物具有驱动跨细胞膜转运的活化能，并起到代谢作用。甘氨酰胺核苷酸甲酰转移酶(GARFT)是嘌呤从头生物合成途径中的一种叶酸依赖性酶。该途径对细胞分化和增殖是关键的。已知关闭此途径具有抗增殖效果，特别是抗肿瘤作用。因此，已合成了多种叶酸类似物，并研究了它们抑制GARFT的能力。已报导了GARFT的原型特异性紧密结合抑制剂5，10—二去氮四氢叶酸显示抗肿瘤活性，见New Drugs.Concepts and Results in CancerChemotherapy.P.65—87，Kluwer Academic Publishers，Boston(1992)中F.M.Muggia的“Floate antimetabolites inhibitory to denovo purine synthesis”。本发明介绍一类新的含谷氨酸或酯片段的化合物。这些化合物对抑制甘氨酰胺核苷酸甲酰转移酶(GARFT)和高等生物和微生物如细菌、酵母和真菌细胞的生长和增殖有效。本发明还涉及含有这些化合物或其适当盐的药物组合物及这些化合物作为GARFT酶抑制剂的用途。如上所述，本发明化合物具有抗增殖活性，这一特性可称为抗肿瘤活性。本发明化合物可以是本身有活性，或为在体内转化为活性化合物的前体。优选的本发明化合物具有抑制GARFT酶的活性。特别优选的化合物对抑制L1210细胞系的生长有效，L1210是能在组织培养中生长的一种鼠白血病细胞系。本发明化合物还应该对抑制细胞的生长有活性，如能在培养基中生长的革兰氏阴性细菌大肠杆菌。本发明的化合物以及其药用盐可制成方便的剂型，如胶囊、片剂、或注射剂。可使用固态或液态药用载体。固态载体包括淀粉、乳糖、二水硫酸钙、石膏粉、蔗糖、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯树胶、硬脂酸镁和硬脂酸。液态载体包括糖浆、花生油、橄榄油、盐水溶液和水。载体和稀释剂可包括任何缓释材料，如甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯，单独使用或与蜡一起使用。当使用液态载体时，制剂可为糖浆、酏剂、乳剂、软明胶胶囊、无菌注射液(如，溶液)或水的或非水的液态悬剂。按照药物化学工作者的常规技术制备药物制剂，这涉及这样的步骤如混合，制粒，和制片剂所需的压制，或混合、填充和溶解各种成份以形成适当的目标产物，如口服、非胃肠道局部、阴道内、鼻内、支气管内、眼内、耳内和直肠给药的产品。本发明组合物还可含有一种或多种其它抗肿瘤化合物，如有丝分裂抑制剂(如长春花碱)；烷化剂；二氢叶酸还原酶抑制剂或TS抑制剂；抗代谢物(如，5—氟尿嘧啶和阿糖胞苷)；嵌入性抗生素(如，阿霉素和博莱霉素)；酶(如天冬酰胺酶)；拓扑异构酶抑制剂(如鬼臼乙叉甙)；生物应答修饰剂(如，干扰素)；或在共同未决和转让的美国专利申请07/991,259中描述的化合物，该申请于1992年12月16日递交，特别并入此作为参考。本发明组合物还可含有一种或多种其它化合物，包括抗细菌、抗真菌、抗寄生虫、抗病毒、治牛皮癣和抗球虫药物。抗细菌药例如有磺酰胺如磺胺甲异噁唑(SMZ)、磺胺嘧啶(SD)、磺胺—5—甲氧嘧啶或固效磺胺；二氢叶酸还原酶抑制剂如三甲氧苄氨嘧啶(TMP)、bromodiaprim、或trimetrexate；青霉素；头孢菌素；氨基糖甙；制菌性蛋白合成抑制剂；喹诺酮羧酸和其稠合异噻唑类似物。本发明的另一方面涉及抑制高等生物或微生物细胞生长和增殖的治疗方法，包括给予宿主有效量的本发明化合物。本发明化合物特别在治疗哺乳动物如人宿主和治疗鸟宿主中有用。特别优选的治疗方法包括给予宿主有效量的本发明化合物以抑制GARFT。这里描述的许多抗增殖药或其药用盐可用于本发明的治疗方法。这些化合物可以含有如上所述的稀释剂或载体的药物组合物形式给药。化合物剂量优选包含含有效量活性化合物的药物剂量单位。“有效量”指足以抑制叶酸代谢途径的量，并通过吸用一个或多个药物剂量单位达到有益的效果。对于脊椎动物宿主，日剂量单位例如含有高达1克活性化合物/kg宿主，优选1/2克，更优选100毫克，最优选的50毫克或更少/kg宿主重。给予需要叶酸代谢途径抑制介导的治疗的温血动物或哺乳动物(如病人)所选择的剂量，它可用任何已知的给药方法，包括如以软膏或霜剂局部使用；口服；如以栓剂直肠施用；经注射的非胃肠道施用；连续的阴道内、鼻内、支气管内、耳内或眼内输注。本发明化合物具有产生一种或多种抗增殖作用，抗细菌作用、抗寄生虫作用、抗病毒作用，治牛皮癣作用、抗原生动物作用、抗球虫作用、抗炎作用、免疫抑制作用或抗真菌作用的特征。这些化事物特别用于在有肿瘤的脊柱动物中产生抗肿瘤效果。本发明涉及能够抑制GARFT的下式I抗增殖化合物或其药用盐 其中n为0到2；A为硫、CH2、氧、—NH—或硒，但条件是当n为0时，A不为CH2，当n为1时，A不为CH2或NH；X为至少一取代或未取代的C1—3烷基或链烯基，C2—3炔基，取代或未取代的氨基，硫或氧；Ar为取代或未取代的单环碳环或杂环或稠合或非稠合碳环或杂环环系；和R1和R2独立地为氢或形成易水解酯基的片段。优选的R1和R2为氢、C1—6烷基、羟基烷基、烷基芳基、和芳烷基。特别优选的是氢和C2烷基。X和Ar的优选取代基包括C1—6烷基或链烯基，C2—6炔基，酰基，卤原子，氨基，羟基，硝基，巯基，单碳环或杂环，稠合或非稠合的碳环或杂环环系，羟基C1—6烷基或C1—6烷氧基C1—6烷基。特别优选的是A为硫，Ar为苯基。优选的本发明一小类化合物具有下式II 其中A′为硫或硒；X′为CH2，硫，氧或NH；Ar如式I中所定义；及R1和R2如式I中所定义，或其药用盐。R1和R2优选为氢、C1—6烷基，羟烷基，烷芳基，和芳烷基，特别优选为氢和C2烷基。A′优选为硫，X′优选为CH2，Ar优选为苯。虽然在式I和II中描绘的化合物呈4—氧代形式，并在整个此说明书中优选这一形式，但氧代基与相应的4—羟基存在互变异构平衡，因此每一处都应理解为也指互变异构的羟基形式。其中R1和R2为氢的式I和式II化合物均为抗肿瘤和抗增殖活性化合物。其中R1和R2为形成易水解酯基的片段(优选为乙基)的式I化合物，为形成游离谷氨酸形式的化合物的中间体，还可在体内水解，从而作为前药。本发明还包括药用盐，包括例如本发明化合物谷氨酸的碱金属盐、碱土金属盐、其它非毒性金属盐、铵盐和取代的铵盐，例如(但不限于)钠盐、钾盐、锂盐、钙盐、镁盐、铝盐、锌盐、铵盐、三甲铵盐、三乙铵盐、吡啶盐、和取代的吡啶盐。可以按如下方法制备本发明的新化合物在除式III化合物外的碱，优选非亲核性辅助碱存在下，在至少一种反应物至少部分溶解的溶剂中，在足以得到式V化合物的条件下，式III化合物 其中B为卤原子，优选溴，与式IV化合物反应 其中X′，A′或Ar如式II中所定义，R3为氢或任意带有一个或多个卤原子、羟基、或氨基的直链、支链或环形C1—6烷基； 其中A′、X′和Ar如式II中所定义，R3如式IV中所定义。式III化合物和式IV化合物优选在适当的溶剂中进行反应，在此溶剂中至少一种反应物或两种反应在反应温度下可溶解。在引入反应物前，最好吹入惰性气体如氩气或氮气通过溶剂以清除溶剂和反应环境中的氧。最好持续地吹入惰性气体，直到反应结束并例如通过倾入水中淬灭为止。适当的优选溶剂为极性非质子溶剂，如二甲基亚砜、N，N—二甲基甲酰胺、N，N—二甲基乙酰胺、或N—甲基—2—吡咯烷酮。式III和IV化合物反应的碱性介质优选由非亲核性辅助碱来提供，后者定义为能够中和取代反应产生的卤化氢的碱。优选的碱为碱金属或碱土金属碳酸盐，或三烷基胺如三甲胺、三乙胺或二异丙基乙胺。进行式IV和III化合物反应的优选方法是将式III化合物，优选5—溴—2，6—二氨基—4(3H)—氧代—嘧啶，悬浮在溶剂中；然后相继加入式IV化合物和辅助碱。然后将反应器浸入已加热至适当温度(20—200℃，优选70—120℃)的油浴中。在此温度下搅拌此混合物必要的时间(通常为30—330分)，然后冷却至室温并倾入水中。再经过滤或有机溶剂萃取可分离产物，式V化合物，并经重结晶或层析来纯化。式V化合物可与优选为盐酸的酸在优选为四氢呋喃的适当溶剂中，在优选为回流的足以得到式VI化合物的条件下反应 其中A′、X′和Ar同式II中所定义，R3同式IV中所定义。然后优选用氰基硼氢化钠还原式VI化合物，得到式VII化合物 其中A′、X′和Ar如式II中所定义，R3如式IV中所定义。式VII化合物在碱性条件下水解，形成式VIII化合物 其中A′、X′和Ar如式II中所定义。如果式VII化合物中R3为氢，就不需要此步反应，式VII化合物可如下述进行肽式键合。游离羧酸形式的式VIII化合物(或当R3为氢时的式VII化合物)可通过本领域技术人员已知的方法，与谷氨酸二酯盐酸盐肽合，形成式IX的二酯化合物 其中A′、X′、Ar、R1和R2如式II中所定义，条件是R1和R2都不为氢。最后，如需要，可将式IX化合物水解成式II所示的游离谷氨酸形式(R1和R2＝H)。在下述实施例中将给出式II化合物的详细合成。式II新化合物的具体实例包括(2—[4—[2—(2—氨基—4—氧代—4，6，7，8—四氢—3H—嘧啶并[5，4—b][1，4]噻嗪—6—基)乙基]苯甲酰氨基]戊二酸)二乙酯；和(2—[4—[2—[2—氨基—4—氧代—4，6，7，8—四氢—3H—嘧啶并[5，4—b][1，4]噻嗪—6—基)乙基]苯甲酰氨基]戊二酸)。优选这些化合物的d—型。应认识到根据本文的教导，本领域技术人员能够将本发明的教导应用于具体的问题和情形。下列实施例中是本发明产品的实例和具有代表性的制备及回收的方法。实施例11a步(1)(1，1—二甲氧基—丁—3—炔—2—醇) 向含1.037g(10.55mmol)三甲基甲硅烷基乙炔和50ml干燥四氢呋喃(THF)的溶液中在氩气下-78℃及搅拌下，滴加6.6ml1.6M亚丁基锂。-78℃下10分钟后，滴加1.21g(10.46mmol)乙二醛二甲基缩醛在5ml四氢呋喃中的溶液。-78℃下1小时后，用1ml H2O淬灭反应，升至室温，用乙酸乙酯稀释，用饱和NaCl溶液洗涤。水层用乙酸乙酯再萃取，合并有机相，用MgSO4干燥，减压浓缩。785mg所生成的黄色油溶解在四氢呋喃中，向其中加入5.8ml0.1M氟化四丁铵/四氢呋喃(THF)。50℃加热1小时后，蒸去挥发性物，残余物在硅胶上快速层析，用二氯甲烷/乙酸乙酯(9∶1)洗脱。这样得到412mg(总收率60％)炔醇化合物(1)，无色油。IR(neat)3441(broad)，3277，2944，2839，1636，1450，1196，1084cm-1.1H NMR(CDCl3)δ2.42(bs，1H)，2.49(s，1H)，3.51(s，3H)，3.53(s，3H)，4.36(bs，2H).元素分析C6H10O3·0.35H2O；C，52.81H，7.90.实测值C，52.87；H，7.86.1b步(2)(4—(3—羟基—4，4—二甲氧基—丁—1—炔基)苯甲酸甲酯) 向含232mg(1.78mmol)炔化合物(1)和467mg(1.78mmol)4—碘苯甲酸甲酯和5ml二乙胺的溶液中，搅拌下加入13mg(0.18mmol)二(三苯膦)氯化钯(II)和7mg(0.36mmol)碘化亚铜。室温下15小时后，减压除去挥发性物质，残余物在硅胶上快速层析，用二氯甲烷/乙酸乙酯(12∶1)洗脱。这样得到347mg(74％)化合物(2)，橙色油。IR(neat)3451(broad)，2953，2838，1717，1607，1437，1310，1283，1120，1082cm-1.1H NMR(CDCl3)δ2.46(bs，1H)，3.55(s，3H)，3.56(s，3H)，3.92(s，3H)，4.45(d，1H，J＝5.4Hz)，4.60(d，1H，J＝5.3Hz)，7.52(d，2H，J＝8.3Hz)，7.98(d，2H，J＝8.3Hz).元素分析C14H16O5C，63.62；H，6.10.实测值c，63.14；H，6.14.1c步(3)(4—(3—羟基—4，4—二甲氧基—丁基)苯甲酸甲酯) 含14.37g(54.38mmol)化合物(2)和1.40g 5％Pd/C和175ml乙醇的溶液在—Darr仪中在40psi氢气下氢化。2.5小时后，过滤反应混合物，用乙醇和甲醇洗涤催化剂。减压浓缩后，将残余物溶解在二氯甲烷中，滤过一短截硅胶，用二氯甲烷、再用二氯甲烷/乙酸乙酯(1∶1)洗脱，除去残余的炭。这样得到14.34g(98％)饱和醇化合物(3)，黄色油。IR(neat)3495(broad)，2953，1721，1611，1437，1283，1109，1080cm-1.1H NMR(CDCl3)δ1.72-1.93(m，2H)，2.75-2.93(m，2H)，3.39(s，3H)，3.44(s，3H)，3.58(m，1H)，3.90(s，3H)，4.13(d，1H，J.＝6.1Hz)，7.29(d，2H，J＝8.1Hz)，7.95(d，2H，J＝8.2Hz).元素分析C14H20O5·0.20H2OC，61.84；H，7.56.实测值C，61.83；H，757.1d步(4)(4—(3—甲磺酰氧基—4，4—二甲氧丁基)苯甲酸甲酯) 向含206mg(0.79mmol)饱和醇化合物(3)和0.16ml(1.15mmol)三乙胺和5ml二氯甲烷的0℃溶液中加入0.07ml(0.85mmol)甲磺酰氯。0℃下20分钟后，再加入0.02ml甲磺酰氯。再过30分钟后，将反应混合物倾入饱和NaHCO3溶液中，用二氯甲烷萃取2次。合并有机相，用MgSO4干燥，减压除去溶剂。此物足够纯，可用于下步反应。在硅胶上快速层析，用二氯甲烷/乙酸乙酯(20∶1)洗脱，得到分析样品。这样得到了甲磺酸酯化合物(4)，无色油。IR(neat)，2949，2839，1719，1611，1437，1352，1283，1177，1109，1078cm-1.1H NMR(CDCl3)δ2.04(m，2H)，2.77-2.91(m，2H)，3，09(s，3H)，3.41(s，3H)，3.45(s，3H)，3.90(s，3H)，4.38(d，1H，J＝5.5Hz)，4.64(m，1H)，7.29(d，2H，J＝8.2Hz)，7.96(d，2H，J＝8.2Hz).元素分析C15H22O7S；C，52.01；H，6.40；S，9.26实测值C，52.08；H，6.44；S，9.25.1e步(5)(4—(3—甲磺酰氧基—4—氧代丁基)苯甲酸甲酯) 向含600mg(1.73mmol)二甲基缩醛(甲磺酸酯)(化合物4)和5ml二氯甲烷的0℃溶液中，搅拌下加入1ml H2O和1ml三氟乙酸。温热至室温，回流24小时。冷却后，反应混合物用乙酸乙酯萃取，依次用饱和NaCl溶液、饱和NaHCO3溶液、再用饱和NaCl溶液洗涤2次，干燥(MgSO4)，减压除去挥发性物质。这样得到甲磺酸酯化合物(5)，不用纯化直接使用。NMR(CDCl3)δ2.20(m，2H)，2.85(m，2H)，3.17(s，3H)，3.91(s，3H)，4.95(dd，1H，J＝4.2Hz，8.4Hz)，7.29(d，2H，J＝8.1Hz)，7.99(d，2H，J＝8.2Hz)，9.59(s，1H).1f步(6)(4—[3—(4—甲氧苄基硫基)—4—氧代丁基]苯甲酸甲酯) 向含686mg(2.28mmol)甲磺酸酯化合物(5)和0.40ml(2.29mmol)N，N—二异丙基乙胺的DMF溶液中，搅拌下加入0.48ml(3.44mmol)4—甲氧基—a—甲苯硫醇。室温下3小时后，将反应混合物倾入0.5N HCl中，用乙酸乙酯萃取2次。合并有机相，用饱和NaCl溶液洗涤，干燥(MgSO4)，减压浓缩。得到醛化合物(6)，它足够纯，因而不用纯化用于下步反应。IR(KBr)2930，1715，1703，1611，1512，1282，1244，1107 cm-1.1H NMR(CDCl3)δ1.80-2.16(m，2H)，2.75(m，2H)，2.99(m，1H)，3.53(AB，2H，J＝13.4Hz)，3.81(s，3H)，3.90(s，3H)，6.83(d，2H，J＝8.5Hz)，7.12(d，2H，J＝8.2Hz)，7.19(d，2H，J＝8.6Hz)，7.90(d，2H，J＝8.2Hz)，9.27(d，1H，J＝4.2Hz).1g步(7)(4—[3—[1，3]二氧戊环—2—基—3—(4—甲氧苄基硫基)丙基]苯甲酸甲酯) 将含301mg(0.84mmol)醛化合物(6)、94ml(1.68mmol)乙二醇和42mg(0.17mmol)对甲苯磺酸吡啶盐和30ml苯的烧瓶。加热回流，用Dean-stark分水器除去生成的水。3小时后，将反应混合物倾入饱和NaCl溶液中，用乙酸乙酯萃取。合并有机相，干燥(MgSO4)，减压浓缩。残余物在硅胶上快速层析，用己烷—乙酸乙酯(5∶1)洗脱。这样得到标题化合物(7)，从甲磺酸酯二甲基缩醛(化合物(4))计算，总收率为84％。IR(neat)，2949，2886，1721，1611，1510，1435，1279，1248，1177，1111，1034cm-1.1H NMR(CDCl3)δ1.67(m，1H)，1.99(m，1H)，2.57(m，2H)，2.84(m，1H)，3.72-4.03(m，6H)，3.81(s，3H)，3.90(s，3H)，4.97(d，1H，J＝4.6Hz)，6.83(d，2H，J＝8.6Hz)，7.09(d，2H，J＝8.1Hz)，7.23(d，2H，J＝8.5Hz)，7.88(d，2H，J＝8.1Hz).元素分析.C22H26O5SC，65.65；H，6.51；S，7.97.实测值C，65.72；H，6.50；S，8.07.1h步(8)(4—[3—[1，3]二氧戊环—2—基—3—巯基丙基]苯甲酸甲酯) 向冷却至0℃的5.70g(14.16mmol)化合物(7)和5.42g(17.00mmol)醋酸汞的二氯甲烷溶液中，搅拌下滴加5ml三氟乙酸。0℃下3小时后，加入用硫化氢饱和的甲醇，0℃下3小时后，加入用硫化氢饱和的甲醇，0℃下继续搅拌20分钟。将此反应混合倾入饱和NaCl溶液中，用二氯甲烷萃取2次。合并有机相，干燥(MgSO4)，减压浓缩。向部分悬浮在甲醇中的残余物中分批加入1.07g(28.28mmol)硼氢化钠。30分钟后，将反应混合物倾入乙酸乙酯和0.5N HCl中，分层。反应中形成的金属汞用乙酸乙酯洗涤。合并有机层，用饱和NaCl溶液洗涤，干燥(MgSO4)，减压浓缩。残余物在硅胶上快速层析，用己烷—乙酸乙酯(4∶1)洗脱。这样得到1.99g(50％)硫醇化合物(8)，浅黄色油。IR(neat)，2951，2886，1719，1611，1435，1281，1179，1144，1111cm-1.1H NMR(CDCl3)δ1.64(d，1H，J＝7.8Hz)，1.74(m，1H)，2.15(m，1H)，2.80(m，2H)，3.00(m，1H)，3.90(s，3H)，3.97(m，4H)，4.91(d，1H，J＝4.0Hz)，7.28(d，2H，J-8.1Hz)，7.95(d，2H，J＝8.1Hz).元素分析C14H18O4SC，59.55；H，6.14.实测值LC，59.42；H，6.41.1i步(9)(4—[3—(2，4—二氨基—6—氧代—1，6—二氢—嘧啶—5—基硫基)—3—[1，3]二氧戊环—2—基—丙基]苯甲酸甲酯) 向1.91g(6.76mmol)硫酸化合物(8)和1.39g(6.78mmol)5—溴—2，4—二氨基—6—氧代嘧啶在氩气下脱气的N，N—二甲基甲酰胺中的溶液中，搅拌下加入1.18ml(6.77mmol)N，N—二异丙基乙胺。反应混合物在90℃加热3小时。冷却后倾入饱和NaCl溶液中，过滤收集形成的沉淀，用水洗，干燥。将滤饼悬浮在二氯甲烷中。慢慢加入己烷，再过滤收集沉淀，用己烷洗涤，干燥。这样得到1.91g(69％)目标二氯戊环化合物(9)，灰白色固体mp206-208℃(分解)。IR(KBr)3439，3341，3154，1701，1636，1591，1470，1447，1287cm-1.1H NMR(DMSO)δ1.64(m，1H)，1.84(m，1H)，2.58(m，1H)，2.79(m，1H)，3.19(m，1H)，3.82(s，3H)，3.85(m，4H)，4.83(d，1H，J＝4，3Hz)，6.33(broad s，4H)，7.33(d，2H，J＝8.1Hz)，7.83(d，2H，J＝8.1Hz，10.03(s，1H).元素分析C18H22N4O5SC，53.19；H，5.46；N，13.78；S，7.89.实测值C，52.98；H，5.53；N，13.60；S，7.76.1j步(10)(4—[2—(2—氨基—7—羟基—4—氧代—4，6，7，8—四氢—3H—嘧啶并[5，4—b][1，4]噻嗪—6—基)乙基]苯甲酸甲酯) 将1.20g(2.85mmol)二氧戊环化合物(9)和4ml 2N HCl于20ml THF中的悬液在搅拌下加热回流2.5小时。将此均一溶液慢慢倾入饱和NaHCO3溶液中，收集所形成的沉淀。滤液用乙酸乙酯萃取。分层形成沉淀(58mg)，收集并与第一份沉淀合并。乙酸乙酯层在MgSO4上干燥，减压除去溶剂。残余物(42mg)也与原沉淀合并。这样得到了984mg(98％)甲醇胺化合物(10)，橙色固体mp213-216℃。IR(KBr)3351，3441，1705，1638，1609，1557，1470，1289，1113，1020cm-1.1H NMR一对非对映异构体(DMSO)δ1.39and1.96(m，m，1H)，1.70(m，1H)，2.56-2.89(m，3H)，3.82(s，3H)，4.71and4.84(m，m，1H)，5.37 and 5.40(d，d，1H，J＝6.6Hz)，6.06(s，2H)，7.20(d，1H，J＝4.5Hz)，7.31and7.36(d，d，2H，J＝8.1Hz)，7.86and7.88(d，d，2H，J＝8.0Hz)，10.16and10.19(s，s，1H).元素分析C16H18N4O4S·1.7 H2OC，48.89；H，5.49；N，14.26；S，8.16.实测值C，48.78；H，5.18；N，14.00；S，8.03.1k步(11)4—[2—氨基—4—氧代—4，6，7，8—四氢—3H—嘧啶并[5，4—b][1，4]噻嗪—6—基]苯甲酸甲酯) 向冷却至0℃的1.126g(3.1mmol)甲醇胺化合物(10)的THF悬液中，加入2.3ml(18.64mmol)三氟化硼醚化物。加完后，5分钟内分批加入0.586g(9.32mmol)氰基硼氢化钠。现过30分钟后，加入5ml氨饱和的甲醇，用乙酸乙酯稀释反应混合物，用饱和NaCl溶液洗涤。干燥(MgSO4)有机层，减压除去溶剂。残余物在硅胶上快速层析，用二氯甲烷/甲醇(9∶1)洗脱。这样得到了542mg(50％)脱水酯化合物(11)，橙色固体mp245-246℃(分解)。IR(KBr)3358，2936，1721，1644，1595，1537，1447，1346，1281cm-1.1H NMR(DMSO)δ1.72(m，1H)，1.90(m，1H)，2.80(m，3H)，3.22(m，1H)，3.52(m，1H)，3.82(s，3H)，6.00(s，2H)，6.65(s，1H)，7.37(d，2H，J＝8.1Hz)，7.87(d，2H，J＝8.1Hz)，10.05(s，1H).元素分析C16H18N4O3SC，55.47；H，5.24；N，16.17；S，9.26.实测值C，55.31；H，5.29；N，16.09；S，9.17.1l步(12)4—[2—(2—氨基—4—氧代—4，6，7，8—四氢—3H—嘧啶并[5，4—b][1，4]噻嗪—6—基)乙基]苯甲酸) 将含530mg(1.53mmol)酯化合物(11)和10ml 1N NaOH的溶液于室温搅拌30分钟。用浓HCl将此均一溶液稍稍酸化(pH4)。用冰浴冷却后，过滤收集浅橙色沉淀，风干。然后将其悬浮在乙醇中，减压除去乙醇。这样得到了468mg(91％)的酸化合物(12)＞310℃(分解)IR(KBr)3285，3086，2928，1698，1642，1611，1576，1449，1348cm-1.1H NMR(DMSO)δ1.72(m，1H)，1.89(m，1H)，2.78(m，3H)，3.20(m，1H)，3.48(m，1H)，6.07(s，2H)，6.68(s，1H)，7.33(d，2H，J＝8.1Hz)，7.85(d，2H，J＝8.1Hz)，10.11(s，1H)，12.77(宽 s，1H).元素分析C15H16N4O3S·1.20H2OC，50.89；H，5.24；N，15.83；S，9.06.实测值C，50.70；H，4.92；N，15.58；S，8.87.1m步(13)(2—[4—[2—(2—氨基—4—氧代—4，6，7，8—四氢—3H—嘧啶并[5，4—b][1，4]噻嗪—6—基]乙基]苯甲酰氨基]戊二酸二乙酯) 搅拌下向含397mg(1.19mmol)酸化合物(12)、169ml(1.25mmol)1—羟基苯并三唑水合物(HOBT)、0.22ml(1.25mmol)N，N—二异丙基乙胺、300mg(1.25mmol L—谷氨酸二乙酯盐酸盐和15ml N，N—二甲基甲酯胺的溶液中，加入240mg(1.25mmol)1—(3—二甲氨基丙基)—3—乙基—碳化二亚胺盐酸盐(EDC)。室温下18小时后，将反应混合物倾入冰冷却的饱和NaCl溶液，收集所形成的沉淀，用H2O洗，风干。沉淀在硅胶上快速层析，用二氯甲烷/甲醇(9∶1)洗脱。这样得到了357mg(58％)的目标产物(13)，浅橙色固体mp132-136℃。IR(KBr)3333，1732，1645，1572，1535，1449，1343，1203，1020cm-1.1H NMR(DMSO)δ1.15(t，3H，J＝7.3Hz)，1.17(t，3H，J＝7.3Hz)，1.72(m，1H)，1.88-2.10(m，3H)，2.42(t，2H，J＝7.4Hz)，2.79(m，3H)，3.22(m，1H)，3.50(m，1H)，4.02(q，2H，J＝7.3；14.5Hz)，4.09(q，2H，J＝7.2，14.3Hz)，4.41(m，1H)，6.21(s，2H)，6.74(s，1H)，7.32(d，2H，J＝8.0Hz)，7.80(d，2H，J＝8.0Hz)，8.64(d，1H，J＝7.41Hz)，10.24(s，1H)元素分析C24H31N5O6SC，55.69；H，6.04；N，13.53；S，6.19.实测值C，55.41；H，6.11；N，13.48；S，6.12.1n步(14)(2—[4—[2—(2—氨基—4—氧代—4，6，7，8—四氢—3H—嘧啶并[5，4—b][1，4]噻嗪—6—基]乙基]苯甲酰氨基]戊二酸) 将320mg(0.618mmol)的谷氨酸酯化合物(13)和6ml 1NNaOH的混合物在室温搅拌3小时，用浓HCl中和，然后用2NHCl稍稍酸化。冷却后收集浅黄色沉淀，风干。滤饼用乙醇/乙腈溶解，共混除去残余的H2O。这样就得到了220mg(77％)的二酸化合物(14)mp188-190℃。IR(KBr)3348(宽)，2930，1717，1642，1539，1505，1348cm-1.1H NMR(DMSO)δ1.71(m，1H)，1.92(m，2H)，2.08(m，1H)，2.34(t，2H，J＝7.4Hz)，2.79(m，3H)，3.20(m，1H)，3.55(m，1H)，4.38(m，1H)，6.07(s，2H)，6.68(s，1H)，7.31(d，2H，J＝8.1Hz)，7.80(d，2H，J＝8.2Hz)，8.53(d，1H，J＝7.7Hz)，10.11(s，1H)，12.40(宽s，2H).元素分析C20H23N5O6S·1.5H2OC，49.17；H，5.36；N，14.34；S，6.56.实测值C，48.77；H，4.97，N，14.07；S，6.54.实施例2生物和生化评估体外实验用L1210鼠白血病(ATCC CCL 219)细胞系测是在本发明化保物存在时的细胞生长。将此细胞系保持在含5％热灭活小牛血清而无抗生素的RPMI 1640培养基中。在含1500(L1210)个细胞的160μL微培养物中测定IC50值，该培养物是在96孔板上以50IU/ml青霉素和50mg/ml红霉素补充的生长培养基中建立的。测量生长的时间是持续暴露于不同浓度试验化合物(14)的3天加上起始细胞铺展后的4小时，用Mos-mann的MITT—四唑鎓还原试验来测定(Immunol.Meth.65，55—63(1983))，由Acleq等改进(Cancer Res.48，589—601(1988))。水不溶性衍生物溶解在DMSO中，稀释到细胞培养物中终浓度为0.5％溶剂。测定GAR转甲酰酶的抑制常数用Cleland的方法(Biochem.Biophys.Acta 67，173-187(1963))测量GAR转甲酰酶的抑制常数。在22℃进行实验，加入酶开始反应，用Young等的分光光度计试验(Biochemistry 23，3979—3986(1984)在295nm监视反应。使用人的GAR转甲酰酶。可变底物为0.83μM，1.25μM，2.5μM和5μM浓度的10—甲酰—5，8—二光氮叶酸，而其它底物GAR(甘氨酰胺核苷酸)保持恒定在20μm。试验混合物含有20mM Hepes pH7.5，20μMGAR，和可变量的10—甲酰—5，8—二氮杂叶酸和抑制剂。对于抑制剂(14)，使用从0到约3Ki范围内的5个浓度。该数据作为反应速度对10—甲酰—5，8—二脱氮叶酸浓度的倒数作图。所有抑制剂浓度所得直线的斜率再对抑制剂浓度作图，从而测得抑制常数。GARFT抑制和细胞培养数据GARFT 细胞系，IC50(μM)Num.KiμM L1210(14) 0.0350.05本发明化合物和中间体含有一个或多个手性中心。本发明包括外消旋混合物、非对映异构体混合物，和光学活性化合物，如基本不含其它光学异构体的化合物，这种光学活性化合物可用本领域中熟知的方法得到。本领域技术人员可明显看出在本发明方法和产物中可有各种修饰和变化。因此，本发明应包括落在所附权利要求范围内的修饰和变化。权利要求1.式I化合物或其药用盐 其中n为0—2；A为硫、CH2、氧、—NH—或硒，但条件是当n为0时，A不为CH2，当n为1时，A不为CH2或NH；X为至少一取代或未取代的C1—3烷基或链烯基，C2—3炔基，取代或未取代的氨基，硫或氧；Ar为取代或未取代的单环碳环或杂环或稠合或未稠合的碳环或杂环环系；及R1和R2独立地为氢或形成易水解酯基的残基。2.权利要求1的化合物或盐，其中R1和R2独立地为氢，C1—6烷基，羟基烷基，烷基芳基，和芳烷基。3.权利要求2的化合物或盐，其中R1和R2独立地为氢和C2烷基。4.权利要求1的化合物或盐，其中X和Ar的取代基选自C1—6烷基或链烯基，C2—6炔基，酰基，卤原子，氨基，羟基，硝基，巯基，单环碳环或杂环，稠合或未稠合碳环或杂环环系，羟基C1—6烷基和C1—6烷氧基C1—6烷基。5.权利要求1的化合物或盐，其中A为硫，Ar为苯基。6.式II化合物或其药用盐 其中A′为硫或硒；X′为CH2、硫、氧或NH；Ar为取代或未取代的单环碳环或杂环或稠合或未稠合的碳环或杂环环系；及R1和R2独立地为氢或形成易水解酯基的残基。7.权利要求6的化合物或盐，其中R1和R2独立地为氢、C1—6烷基、羟基烷基、烷基芳基，和芳烷基。8.权利要求7的化合物或盐，其中R1和R2独立地为氢和C2烷基。9.权利要求6的化合物或盐，其中A′为硫，X′为CH2及Ar为苯基。10.d—(2—[4—[2—(2—氨基—4—氧代—4，6，7，8—四氢—3H—嘧啶并[5，4—b][1，4]噻嗪—6—基)乙基]苯甲酰氨基]戊二酸二乙酯)。11.d—(2—[4—[2—(2—氨基—4—氧代—4，6，7，8—四氢—3H—嘧啶并[5，4-b][1，4]噻嗪—6—基)乙基]苯甲酰氨基]戊二酸)。12.一种抗增殖组合物，其含有与药用载体结合的式I化合物或其药用盐， 其中n为0—2；A为硫、CH2、氧、—NH—或硒，但条件是当n为0时，A不为CH2，当n为1时，A不为CH2或NH；X为至少一取代或未取代的C1—3烷基或链烯基，C2—3炔基，取代或未取代的氨基，硫或氧；Ar为取代或未取代的单环碳环或杂环或稠合或未稠合的碳环或杂环环系；和R1和R2独立地为氢或形成易水解酯基的残基。13.权利要求12的组合物，其中R1和R2独立地为氢，C1—6烷基，羟基烷基，烷基芳基，和芳烷基。14.权利要求13的组合物，其中R1和R2独立地为氢和C2烷基。15.权利要求12的组合物，其中X和Ar的取代基选自C1—6烷基或链烯基，C2—6炔基，酰基，卤原子，氨基，羟基，硝基，巯基，单环碳环或杂环，稠合或未稠合碳环或杂环环系，羟基C1—6烷基和C1—6烷氧基C1—6烷基。16.权利要求12的组合物，其中A为硫，Ar为未取代的苯基。17.一种抗增殖组合物，其含有与药用载体结合的式II化合物或其药用盐 其中A′为硫或硒；X′为CH2、硫、氧或NH；Ar为取代或未取代的单环碳环或杂环或稠合或未稠合的碳环或杂环环系；及R1和R2独立地为氢或形成易水解酯基的残基。18.权利要求17的组合物，其中R1和R2独立地为氢、C1—6烷基、羟基烷基、烷基芳基，和芳烷基。19.权利要求18的组合物，其中R1和R2独立地为氢和C2烷基。20.权利要求17的组合物，其中A′为硫，X′为CH2，Ar为未取代的苯基。21.一种抑制微生物或高等生物细胞生长和增殖的方法，该方法包括以予需要这种治疗的宿主有效量的式I化合物或其药用盐 其中n为0—2；A为硫、CH2、氧、—NH—或硒，但条件是当n为0时，A不为CH2，当n为1时，A不为CH2或NH；X为至少一取代或未取代的C1—3烷基或链烯基，C2—3炔基，取代或未取代的氨基，硫或氧；Ar为取代或未取代的单环碳环或杂环或稠合或未稠合的碳环或杂环环系；及R1和R2独立地为氢或形成易水解酯基的残基。22.一种抑制微生物或高等生物细胞生长和增殖的方法，该方法包括以予需要这种治疗的宿主有效量的式II化合物或其药用盐 其中A′为硫或硒；X′为CH2、硫、氧或NH；Ar为取代或未取代的单环碳环或杂环或稠合或未稠合的碳环或杂环环系；及R1和R2独立地为氢或形成易水解酯基的残基。23.式II化合物或其药用盐的制备方法 其中A′为硫或硒；X′为CH2、硫、氧或NH；Ar为取代或未取代的单环碳环或杂环或稠合或未稠合的碳环或杂环环系；及R1和R2独立地为氢或形成易水解酯基的残基；该方法包括以下步骤(a)在除式III化合物外的碱，优选非亲核性辅助碱存在下，在至少一种反应物至少部分溶解的溶剂中，在足以得到式V化合物的条件下，式III化合物 其中B为卤原子，优选溴，与式IV化合物反应 其中X′，A′和Ar如式II中所定义，R3为氢或任意带有一个或多个卤原子、羟基、或氨基的直链、支链或环形C1—6烷基； 其中A′、X′和Ar如式II中所定义，R3如式IV中所定义；(b)式V化合物与酸在适当的溶剂中在足以得到式VI化合物的条件下反应 其中A′、X′和Ar如式II中所定义，R3如式IV中所定义；(c)在足以得到式VII化合物的条件下还原式VI化合物 其中A′、X′和Ar如式II中所定义，R3如式IV中所定义；(d)在足以形成式VIII化合物的碱性条件下，水解式VII化合物，这是当式VII化合物中R3不是氢时， 其中A′、X′和Ar如式II中所定义；及(e)将式VIII化合物或式VII化合物(当R3为氢时)与谷氨酸二酯盐酸盐肽合，形成如上所定义的式II的二酯，条件是R1和R2都不是氢。24.权利要求23的方法，它还包括将式II化合物水解为式II中所示(R1和R2都是氢)的游离谷氨酸形式的步骤。25.权利要求23的方法，其中(a)步中，B为溴。26.权利要求25的方法，其中(a)步中，除式III化合物以外的碱为非亲核性辅助碱。27.权利要求26的方法，其中(b)步中的酸为盐酸。28.权利要求27的方法，其中(b)步中的溶剂为四氢呋喃。29.权利要求28的方法，其中(c)步中使用氰基硼氢化钠进行还原。30.一种抑制GARFT的方法，包括给予需要这种抑制的宿主有效量的式I化合物或其药用盐， 其中n为0—2；A为硫、CH2、氧、—NH—或硒，但条件是当n为0时，A不为CH2，当n为1时，A不为CH2或NH；X为至少一取代或未取代的C1—3烷基或链烯基，C2—3炔基，取代或未取代的氨基，硫或氧；Ar为取代或未取代的单环碳环或杂环或稠合或未稠合的碳环或杂环环系；及R1和R2独立地为氢或形成易水解酯基的残基。31.一种抑制GARFT的方法，包括给予需要这种抑制的宿主有效量的式II化合物或其药用盐 其中A′为硫或硒；X′为CH2、硫、氧或NH；Ar为取代或未取代的单环碳环或杂环或稠合或未稠合的碳环或杂环环系；及R1和R2独立地为氢或形成易水解酯基的残基。全文摘要发现式I新化合物抑制甘氨酰胺核苷酸甲酰转移酶(GARFT)。还公开了制备此化合物的新方法，以及用此化合物作为抗增殖剂的方法和组合物。文档编号C07D517/04GK1117295SQ94191053 公开日1996年2月21日 申请日期1994年1月18日 优先权日1993年1月29日发明者M·D·沃尔尼, C·L·帕尔默, W·H·罗米尼斯 申请人:阿格罗尼制药公司