1-脱氨基-8-d-精氨酸抗利尿激素的制造方法

专利名称：1-脱氨基-8-d-精氨酸抗利尿激素的制造方法技术领域：本发明涉及一种制造治疗尿频的高纯1-脱氨基-8-D-精氨酸抗利尿激素的新方法。该方法包括将MPa(R1)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(R2)-Pro-OH(SEQ ID NO1)与(R3)-D-Arg(HCl)-Gly-NH2缩合和氧化所产生的肽。激素类似物1-脱氨基-8-D-精氨酸抗利尿激素(1-β-巯基丙酸-8-D-精氨酸)-抗利尿激素或去氨加压素以下简称为“DDAVP”为治疗诸如尿崩症，夜遗尿和尿失禁引起的尿频的重要抗利尿药。在本申请中1-脱氨基-8-D-精氨酸抗利尿激素(仍然被称为九肽衍生物)与天然的垂体神经部抗利尿激素不同，它是用1-β-巯基丙酸代替末端的甲硫氨酸并用D-精氨酸代替精氨酸而得到的。同样，合成的起始原料和中间体称为n肽衍生物，其中n为在相应的肽中的氨基酸和假氨酸残基的总数。佐拉(Zaoral)等的美国专利3,497,491描述了合成DDAVP的均相法，库切克V和佐拉M在1979，Coll.Czechoslov.Chem Com-mun.441173—1178中描述了固相法。然而，用现在已知的工艺方法仅得到无定形的1-脱氨基-8-D-精氨酸抗利尿激素，因而难以纯化。作为治疗应用，诸如具升压活性的杂质会导致并发症。在已知技术中收率可能是以牺牲纯度来提高的，反之亦然，且产品分子越大，纯化就越困难成本也越高。医药领域要求高纯的优质品，因此目前一般强调纯度。然而，目前已知的方法要求过多的纯化步骤，不可避免地会使收率减少。提纯需化人工，并使产品收率明显减少，因而提高了成本。因此，生产DDAVP的合成路线需要有一种工艺使其中合成的最后步骤的收率得到提高。这将减少对中间体和产品的高成本的提纯的要求和提供高收率的优质产品。同时需要有一种DDAVP经改进的相对不复杂的生产方法，其中，较少生成具升压或其它不需要的生理作用的杂质，或更易在提纯步骤中除去。本发明的目的是提供一种高产率地生产高纯度的1-脱氨基-8-D-精氨酸抗利尿激素的新方法。另一个目的是提供一种简单、经济的方法，通过在最终步骤中避免复杂、昂贵的提纯过程而高产率地生产高纯度的DDAVP。本发明的一种合成1-脱氨基-8-D-精氨酸抗利尿激素(I)的方法，其特征在于包括下列步骤(a)制备七肽MPa(R1)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(R2)-Pro-OH(II)(SEQ IDNO1)，或中R1和R2为巯基保护基，可以相同或者不同；(b)将步骤(a)的七肽与二肽(R3)-D-Arg(HCl)-Gly-NH2(III)缩合，式中R3为对酸敏感的氨基保护基；(c)形成九肽；MPa(R1)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(R2)-Pro-D-Ary(HCl)-Gly-NH2(IV)(SEQ ID NO1)以及(d)将步骤(c)的九肽在质子性溶剂中用碘氧化。在步骤(a)中制备七肽的较佳方法为通过三肽MPa(R1)-Tyr-Phe-X(V)(式中X为在Phe的羧基中取代羟基(-OH)的反应性基团)与四肽(R3)-Gln-Asn-Cys(R2)-Pro-OH(VI)缩合。巯基保护基R1和R2可以相同或彼此独立，可为乙酰胺基甲基(Acm)，叔丁基，叔丁基亚磺酸基，对甲基苄基，对甲氧基苄基，2-(3-硝基吡啶亚磺酰基)，乙基氨基甲酰基，三苯基甲基或9-芴基甲基。本发明的较佳的一个具体实施方案中，巯基保护基R1的R2两者为乙酰胺基甲基。在本发明的另一较佳的具体实施方案中，氨基保护基R3为N-叔丁氧基(BOC)。更佳的反应基X为活化的羧酸酯，诸如，对硝基苯酚或羟基琥珀酰亚胺的酯，或者是非活化的羧酸酯，诸如，甲酯、乙酯或苄酯，或者是叠氮化物，于是，反应基X可以是烷氧基，芳氧基或叠氮基，而较佳的烷氧基为琥珀酰亚胺氧基，较佳的芳氧基为对硝基苯氧基。在上述的方法中，步骤(d)的在低于pH5.0，较佳是在pH2.5—4.3之间用I2进行氧化。本方法在步骤(d)用I2氧化后，即在所有的合成完成之后，不经中断即将反应混合物进行提纯。一条较佳的提纯路线为通过离子交换色谱在一种用酸平衡的阳离子交换树脂上进行纯化。纯化所用的较佳的离子交换树脂为含磺酸基的。提纯可以进一步深化例如，采用附加的凝胶色谱步骤。根据本发明，同时揭示了按照本发明方法制备的高纯度的DDAVP以及将它用于治疗尿崩症、夜遗尿的尿失禁引起的尿频。本发明将通过不起限定作用的具体实施例，更详细地加以说明，其中R1和R2两者为乙酰胺基甲基，R3为N-叔丁氧基，X为-NHNH2。实施例1Boc-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-OH(X)BocCys(Acm)ONp从BocCys(Acm)OH(Novabiochem，Lufelingen，CH)和对硝基苯酚通过与N，N＇二环己基碳化二亚胺(DCC)在乙酸乙酯中反应制得，无需提纯而将它与H-Pro-OH在DMF/乙酸乙酯/水中于0℃在pH中性时加入Et3N反应制备Boc-Cys(Acm)-Pro-OH(XII)。收率81％。纯度＞95％(TLC).将XII在HCl/HOAC中于室温下除去保护基，将由此得到的粗H-Cys(Acm)-Pro-OH·HCl溶解在DMF中，并用Et3N中和，并加入Boc-AsD-ONp(Novabiochem，Lufelingen，CH)于—5℃并保持pH为中性。得到Boc-Asn-Cys(Acm)-Pro-OH(XIII)以81％的产率分离得XIII。〔α〕D20＝－77。1°(1g/100ml DMF)。四肽衍生物X由XIII和Boc-Gln-ONp(Novabiochem，Laufeligen，CH)以相应于从XII和Boc-Asn-ONp制备XIII的方法来制备。收率78.5％，〔α〕D20＝－89.7°(1g/100ml H2O)。实施例2Mpa(Acm)-Tyr-Phe-NHNH2(XI)通过H-Tyr-OEt·HCl与Mpa(Acm)-OH(Bachem AG，CH)以及DCC在含有1-羟基苯并三唑(HOBt)的DMF中于0℃并维持pH7(用Et3N)进行反应，制备Mpa(Acm)-Tyr-OEt(XIV)。收率48％。通过酯XIV与H-Phe-N2H3在DMF/H2O中用α-糜蛋白酶催化进行反应，制备酰胼XI，收率90％；m.p.240—242℃。实施例3Mpa(Acm)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-OH(VII)(SEQ ID NO1)将Boc-Gln-Asn-Cys(Asm)-Pro-OH(X)(11.7克)溶于56ml三氟乙酸(TFA)中，在室温保持1小时后蒸除三氟乙酸。将残留物溶解在19ml二甲基甲酰胺(DMF)中并冷却之，用Et3N调节至pH7。将Mpa(Acm)-Tyr-Phe-NHNH2(XI；11.0g)溶解在115mlDMF中，将此溶液冷却至-18℃加入HCl/乙酸乙酯(15.8ml；3.2M)，并将此溶液保持在-15℃，加入亚硝酸异戊酯(3.5ml)，并将此溶液在约-10℃搅拌15分钟，冷却至-20℃后将pH用Et3N调节至7。加入除去保持基的四肽在DMF中的溶液，并于-5℃搅拌。在反应实际上完全后(用TLC确定除去保护基的肽有99.5％)，过滤除去析出的盐，通过真空蒸发使体积减少至60ml。加入EtOH(99.5％，21.5ml)并得此溶液加热至60℃。然后冷却至环境温度，将pH用浓盐酸调节至2.5。将沉淀滤出，用99.5％EtOH洗涤，干燥得到17.6克白色结晶，收率85％，m.p.188—191℃。实施例4Boc-D-Arg(HCl)-Gly-NH2(VIII)将H-Gly-NH2·HCl(2.6g)和1-羟基苯并三唑(HOBt；3.3g)悬浮在34ml DMF中，并将此溶液冷却至10℃。加入Et3N(2.0ml)，将此混合物搅拌15分钟。加入Boc-D-精氨酸(HCl)(6.8g)，并将温度降至0℃。将溶解在4.5mlDMF中的DCC(4.5g)加入，并用Et3N调节pH至6.0，转化完全后，过滤除去形成的沉淀，滤液真空蒸发之。将残留物溶解在80ml水中，将此溶液冷却至0℃，并用1M HCl调节pH至3。通过过滤除去HOBt后，该溶液用二氯甲烷萃取。将水相在真空下与丁醇(4X)共沸蒸馏浓缩至20ml的体积，加入BuOH使它的体积成为68ml。此溶液用含1O％NaCl(W/W)和5％丁醇(v/v)的0.1M HCl萃取，然后通过蒸馏将体积减少至一半。用丁醇重复共沸蒸馏，并通过过滤除去NaCl后，将此溶液倾入过量八倍(v/v)的醋酸异丙酯中，通过过滤收集沉淀并用醋酸异丙酯洗涤。得到的化合物VIII为白色无定形粉末；产量6.8克(90％)，〔α〕D20＝4.3°。实施例5Mpa(Acm)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-D-Arg(HCl)-Gly-NH2(IX)，(SEQ ID NO.1)将Boc-D-Arg(HCl)-Gly-NH2(VIII)(6.8g)溶解在23ml乙酸中，并加入20ml HCl/HOAC(2.2M)，于室温下搅拌1.5小时后，在减压下蒸发此溶液，将残留物溶解在30ml DMF中。通过加入二甲苯(31ml)使除去保护基的二肽以油滴析出。倾滗去上层清液后，残留物用二甲苯洗涤，并在真空下除去残存的溶剂。将残留物溶在110ml DMF中，并将此溶液冷却至-10℃，通过加入Et3N将pH调节至7.5。将Mpa(Acm)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-OH(VII)(SEQ ID NO1)(14g)和2.1g HOBt溶解于65ml DMF中，并将在前一步骤中得到的在DMF中的除去保护基的二肽H-D-Arg(HCl)-Gly-NH2和计算量的DCC加入。在90％转化(TLC)后滤除DCU，将滤液体积减少至100ml，加热至60℃，倾入310mlEtOH/EtOAC(85∶15，v/v)中。过滤收集沉淀并用EtOH/EtOAC(85∶15)洗涤。得到的化合物IX为白色粉末(产量15.5克，84.9％)，m.p.182-185℃(纯度94.5％(HPCL)。实施例61-脱氨基-8-D-精氨酸抗利尿激素Mpa-Tyr-Phe-GIn-Asn-Cys-Pro-D-Arg-Gly-NH2(I)(醋酸盐)(SEQ ID NO2)将10克Mpa(Acm)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-D-Arg(HCl)-Gly-NH2(IX)(SEQ ID NO1)溶解在10立升乙酸/水(1∶9，v/v)中。通过滚柱泵加入溶于80ml乙醇的2克碘将被保护的九肽衍生物IX于室温下氧化，进料速度通过紫外监测器控制，以保持反应介质中游离碘的量很低。IX的转化率通过高速HPLC监控。在IX全部消耗后黄色将持续。将含有该产物的反应溶液通过装有1.6立升用含水乙酸平衡的S-Sepharose FF(Pharmacia，瑞典)的短玻璃柱。用0.08M NH4Ac/AcOH缓冲液(24立升，pH4.1；各流份用HPLC监测)洗提1-脱氨基-8-D-精氨酸抗利尿激素(I)。将含DDAVP(I)纯度＞99％(不计缓冲液的成分)的流份合并。含有纯的标题化合物的醋酸盐的溶液通过反渗透浓缩，并冷冻干燥。得到白色松散粉末。DDAVP(I)在Sephader G25上(0.1M乙酸)经凝胶过滤进一步纯化。接着用HPLC分析各个流分，含纯产品的流份合并后冷冻干燥。得到纯度＞99％的DDAVP(I)的二醋酸盐产量约5克，为白色松散粉末，收率53％。实施例7将按照实施例1—6制备的DDAVP与用已知的均相工艺制备的1-脱氨基-8-D-精氨酸抗利尿激素进行比较试验。按照美国专利3,497,491的均相方法，DDAVP的合成总收率(从β-巯基丙酸起)为5.0％。按照本发明方法制备的1-脱氨基-8-D-精氨酸抗利尿激素(I)的总收率〔包括Mpa(Acm)-OH的制备〕为7.0％，提高40％。按照本发明的方法，采用自β-巯基丙酸起始的合成路线〔包括制备Boc-Cys(Acm)-OH〕生产1-脱氨基-8-D-精氨酸抗利尿激素(I)的总收率为10.7％。更重要的是根据本发明在最后三步中得到高的收率即化合物X为38％和化合物VIII为45％。在已知的典型工艺中最后三个步骤的收率约为8.5％—17％或约10—20％的范围，在工艺的经济性方面，在最终几步损失的产物比初始阶段更值钱，因此本发明的方法降低成本为更有效。根据本发明的方法提供的DDAVP不仅在收率上比已知的均相法高得多，而且在纯度上也高得多。在美国专利3,497,491中缺少最终产品纯度的精确信息，它没有提供最终产品纯DDAVP的含量，而仅给出用于确证结构的元素和氨基酸分析的结果。另外，旋光度原则上可以很精确地测量，但其中所述的值〔α〕D25＝－65±2°并无用处。然而，在美国专利3,497,491的表中第3栏中关于升压反应的信息可用于纯度的估计。按照美国专利3,497,491制备的1-脱氨基-8-D-精氨酸抗利尿激素(I)据说具有可测量的升压副反应。最近的研究表明如果经过仔细纯化，1-脱氨基-8-D-精氨酸抗利尿激素(I)实际上不具有这种升压活性。然而，按照目前已知的方法进一步进行这种提纯，可能在收率上作出牺牲。依照已知方法制备的产品中含有的杂质导致的升压副反应，包括药理学并发症如高血压。因此，“纯度”包括二个方面，首先是在最终产物中活性DDAVP的实际含量，其次是没有医学上有害的杂质。按照本发明的方法制备的1-脱氨基-8-D-精氨酸抗利尿激素(I)，实际上是没有这类潜在的有害杂质的。在此已详细说明了本发明，本领域的技术人员可以变更本工艺中的各个步骤，所用的试剂和各种反应条件，并得到类似的结果，而这类变更包括在本发明的范围和精神之内。顺序录(i)一般信息(ii)顺序数2SEQ ID NO1的信息(i)顺序特征(A)长度4个氨基酸(B)类型氨基酸(C)形状线状(ii)分子类型肽(iii)顺序说明SEQ ID NO1Tyr-Phe-Gln-AsnSEQ ID NO2的信息(i)顺序特征(A)长度6个氨基酸(B)类型氨基酸(C)形状线状(ii)分子类型肽(iii)顺序描述SEQ ID NO2Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro权利要求1.合成1-脱氨基-8-D-精氨酸抗利尿激素的方法，其特征在于包括以下步骤(a)制备七肽Mpa(R1)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(R2)-Pro-OH(SEQ ID NO1)式中R1和R2为巯基保护基，(b)将步骤(a)的七肽与二肽(R3)-D-Arg(HCl)-Gly-NH2缩合，式中R3为对酸敏感的氨基的保护基；(c)形成九肽Mpa(R1)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(R2)-Pro-D-Arg-(HCl)-Gly-NH2(SEQ ID NO1)以及(d)将步骤(c)的九肽在质子性溶剂中用碘氧化。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的巯基保护基R1和R2可以相同或彼此独立，可选自包括乙酰胺基甲基，叔丁基，叔丁基亚磺酰基，对甲基苄基，对甲氧基苄基，2-(3-硝基吡啶亚磺酰基)，乙基氨基甲酰基，三苯基甲基和9-芴基甲基的一组基团。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的巯基保护基R1和R2两者都是乙酰胺基甲基。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的氨基保护基R3为N-叔丁氧基。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的制备七肽的步骤包括将三肽Mpa(R1)-Tyr-Phe-X(式中X为在Phe的-COOH中取代羟基的反应性基团)与四肽R3-Gln-Asn-Cys(R2)-Pro-OH发生缩合。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述的反应性基团X选自包括烷氧基、芳氧基和叠氮基的一组基团。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述的烷氧基为琥珀酰亚胺基氧基。8.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述的芳氧基为对硝基苯氧基。9.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的用碘氧化的步骤(d)在pH低于5.0时进行。10.如权利要求9所述的方法，其特征在于所述的用碘氧化的步骤(d)在pHl.5—4.3之间进行。11.如权利要求1所述的方法，其特征在于自步骤(d)所得的含有所述的已被氧化的九肽的反应混合物用经酸平衡的阳离子交换树脂的离子交换色谱法纯化。12.按照权利要求1的方法制备1-脱氨基-8-D-精氨酸抗利尿激素(DDAVP)。13.治疗尿频的方法，其特征在于包括给予治疗剂量的按照权利要求12制备的1-脱氨基-8-D-精氨酸抗利尿激素(DDAVP)。14.按照权利要求1的方法制备的含有如下结构的化合物Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Arg-Gly-NH2(SEQ IDNO2)。15.一种尿频的治疗系统，其特征在于包括使用权利要求14的化合物的一种合适的给药系统。16.治疗尿频的方法，其特征在于包括给予治疗剂量的权利要求14的化合物。全文摘要一种制备1-脱氨基-8-D-精氨酸抗利尿激素(DDAVP)的方法，包括将Mpa(R文档编号C07K1/107GK1125952SQ9419259公开日1996年7月3日 申请日期1994年6月22日 优先权日1993年6月29日发明者B·A·K·拉松, T·B·梅尔白兰特, E·M·B·莫尔斯塔姆, J·A·I·罗斯彻斯特, J·A·舍尔德贝克 申请人:凡林有限公司