一种微生物差异靶向性传感阵列及其在微生物种类检测中的应用

本发明属于微生物检测，具体涉及一种微生物差异靶向性传感阵列及其在微生物种类检测中的应用。

背景技术：

1、抗生素在治疗细菌和真菌方面非常有效，但长期滥用抗生素会导致菌株变异，导致细菌产生耐药性。方便可靠的微生物鉴定可以有效地识别病原体的类型，并给予正确的治疗方案以控制疾病的进展。传统的细菌分析方法包括平板计数法、聚合酶链式反应(pcr)、酶联免疫吸附试验(elisa)、质谱法等。细菌平板计数是一种传统的方法，但耗时长，对具有相似形态的细菌的检测无法区分。pcr技术具有良好的特异性，但操作步骤繁琐，会出现假阳性结果。elisa是识别某些细菌的最流行的免疫测定方法之一，酶联免疫吸附法虽然是一种方便的微生物鉴定方法，但很难获得对所有微生物都具有良好特异性的抗体。质谱分析需要非常昂贵的设备，并且需要专业的技术人员进行数据分析。因此，开发快速可靠的细菌分析方法具有重要意义。

2、荧光成像为可视化细胞形态提供了一种有效便捷的方法，成为生物学研究的有力工具。基于荧光技术的高灵敏度、操作快速简便、实时成像、高分辨率和无创性的优势，荧光成像能够以高分辨率对微生物内环境、生物分子或特定微生物结构进行实时监测。在荧光成像过程中，荧光探针的选择至关重要，与带负电荷的荧光探针相比，带正电荷的荧光探针能够更好地进行微生物成像。革兰氏阴性菌(g-)、革兰氏阳性菌(g+)和真菌的细胞壁带负电，但具有不同的表面结构和化学成分。g-具有致密的外膜作为屏障功能，可以有效防止分子进入细菌。g+具有疏松多孔的细胞壁，是位于质膜外的一层高度交联的肽聚糖。真菌是具有典型细胞壁的真核生物，主要由β-聚糖、几丁质和甘露糖蛋白组成。微生物的不同细胞膜可能在成像过程中发挥重要作用。基于不同的壁结构和微生物的化学成分设计探针有利于诊断细菌的种类。传统的荧光探针分析往往针对单一的被分析物，不适合复杂物质分析。荧光传感器阵列结合了荧光探针的高选择性和高灵敏度，更适用于多目标成像和分析，包括生物大分子、细胞和微生物。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种微生物差异靶向性传感阵列及其在微生物种类检测中的应用。所设计合成的传感阵列具有多色荧光发射和聚集诱导发光特性，所以微生物经染色成像后，不同细胞壁作用机制的正电荷荧光传感阵列能够通过与不同种类的微生物相互作用，每种微生物都会获得系列不同颜色的独特的指纹荧光图像，克服了单色荧光的光谱串扰缺陷。将采集到的指纹荧光图像经过数据集增强处理后输入resnet卷积神经网络，进行网络训练，完全不需要人工提取图像特征，克服了传统机器学习方法客观因素造成的误差。本方法成功实现了复杂微生物的高效快速准确识别。

2、所述的微生物差异靶向性传感阵列由荧光探针tbn、tpn和tpi组成，三种荧光探针的结构式如下：

3、

4、所述荧光探针tbn的制备方法为：

5、(1)将化合物tb、4,7-二溴-2,1,3-苯并噻二唑、k2co3和四(三苯基膦)钯加入无水四氢呋喃中，加入去离子水以溶解k2co3，充入氮气以除去氧气，回流反应4-24h后萃取，有机层经硫酸钠干燥后除去溶剂，最后色谱纯化得到化合物ttbr；

6、(2)将化合物ttbr与化合物bbcl、k2co3和四(三苯基膦)钯加入无水四氢呋喃中，加入去离子水以溶解k2co3，充入氮气以除去氧气，回流反应4-24h后萃取，有机层经硫酸钠干燥后除去溶剂，最后色谱纯化得到化合物ttbcl；

7、(3)将nai与化合物ttbcl按摩尔比≥3加入无水丙酮中，充入氮气以除氧气，回流反应2-4天后萃取，有机层经硫酸钠干燥后除去溶剂，最后色谱纯化得到化合物ttbi；

8、(4)充入氮气除去空气后，将化合物ttbi和三甲胺按摩尔比≥3加入无水四氢呋喃中，-80-0℃反应20-100min，之后转移到室温下继续反应2-4天，最后重结晶得到荧光探针tbn。

9、所述化合物tb的结构式为：

10、所述化合物bbcl的结构式为：

11、所述荧光探针tpi的制备方法为：将化合物tpcho和1,2,3,3-四甲基-3h-吲哚碘化物加入无水乙醇或醋酸酐中，充入氮气以除去氧气，回流反应4-48h后萃取，有机层经硫酸钠干燥后除去溶剂，最后色谱纯化得到荧光探针tpi。

12、所述化合物tpcho的结构式为：

13、一种试剂盒，包含上述微生物差异靶向性传感阵列。用于复杂微生物快速分型。

14、一种微生物种类检测的方法为：

15、(1)将不同种类的微生物分别加入到tbn、tpn、tpi荧光探针溶液中孵育，然后通过激光共聚焦荧光显微镜进行共聚焦成像，采集指纹荧光图像；

16、(2)将采集到的指纹荧光图像经过增强处理后输入resnet卷积神经网络进行网络训练，经过训练的神经网络具有识别步骤(1)中的各个种类的微生物的能力；

17、(3)与步骤(1)相同条件下，将待测微生物分别与tbn、tpn、tpi荧光探针溶液孵育，通过激光共聚焦荧光显微镜进行共聚焦成像，将采集到的指纹荧光图像输入步骤(2)中训练过的神经网络，网络在2秒内输出识别结果。

18、所述荧光探针溶液的浓度为5-20μm，孵育时间为5-30分钟。

19、通过激光共聚焦荧光显微镜进行共聚焦成像采集指纹荧光图像时，激发波段为405-488nm，对应的荧光接收波段涵盖荧光探针的最大发射波长。

20、上述微生物差异靶向性传感阵列在伤口感染处微生物种类检测中的应用。

21、本发明具有以下有益效果：

22、(1)本发明提供不同正电荷基团的多色荧光传感阵列制备方法，该方法合成路径简单且适用性强。

23、(2)本发明通过在聚集诱导发光荧光团四苯乙烯上引入不同正电荷基团，通过范德华力、氢键相互作用实现了荧光探针对微生物的靶向性。除此之外，正电荷的引入调节了分子内的电子转移效应，实现了传感阵列的多色荧光发射。传感阵列中三个探针的最大发射波长从585nm到685nm，保证其用于细胞的多色成像，多色成像避免了传感元件之间的荧光信号的影响，是微生物经过荧光传感阵列染色后能够获得更加精准的荧光信号。

24、(3)本发明所设计的传感阵列通过于商用染料dapi的共定位实验，探究了荧光探针与不同种类微生物产生差异荧光的构效关系。dapi是一种商业染料，能够特异性结合细胞质内的dna。通过与dapi的共定位，研究探针是否能够进入微生物细胞质内。

25、(4)本发明设计的传感阵列具有低的细胞毒性和高的抗光漂白性，在所使用浓度范围内，细胞存活率均高于80％，表明传感阵列具有良好的生物安全性，适用于微生物成像。激光照射300秒之后，其荧光强度均高于80％，表明传感阵列具有良好的光稳定性。良好的光稳定性为细胞的稳定成像分析提供了保障。

26、(5)本发明设计的传感阵能够对不同类型的微生物表现出差异荧光响应，基于不同正电荷基团的多色荧光传感阵列，通过结合深度学习分析，实现了不同种类微生物的识别，训练后的网络实现了对小鼠微生物感染伤口处不同革兰氏种属、不同耐药类型的微生物以及它们的混合物能够快速准确判别，具有操作便捷，成本低，非侵入性，快速准确的优点。对感染类疾病病原微生物的诊断以及指导临床用药具有重要意义。