Eu3+/Tb3+掺杂蛋白质共晶制备氨基酸荧光传感器及方法和应用

本发明涉及纳米功能材料领域，尤其涉及的是一种检测氨基酸浓度的稀土络合物蛋白质共结晶晶体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、蛋白质晶体，作为纳米技术领域的代表性材料，具有一系列优良的性质和广泛的应用前景。晶体材料具有可调节的结构、良好的化学和物理性能，已成为许多科学学科的共同研究对象。蛋清溶菌酶不仅价格低廉，而且已经作为一种模型蛋白进行了研究，目前研究最多的方法是调整蛋白质晶体的大小，装载不同类型的客体材料，并在蛋白质晶体表面进行基团接枝。由于各种优势，人们对共晶越来越感兴趣。溶液共结晶是一种基于溶剂的方法，通过合理控制纯度、尺寸分布、形态和多态性来生产共晶。例如，蛋白质组织纳米粒子提供了合适的支架，可用于催化、生物免疫分析和光活性等研究领域。

2、利用稀土杂化发光的蛋白质共晶晶体检测氨基酸浓度的研究还未见报道。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种eu3+/tb3+掺杂蛋白质共晶制备氨基酸荧光传感器及方法和应用。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种eu3+/tb3+掺杂蛋白质共晶制备氨基酸荧光传感器的方法，以eu3+/tb3+络合物溶液和蛋白质溶液共混，产物析出共结晶的方法获得的eu3+/tb3+掺杂的发光蛋白质晶体etp/tap-hewl，并对所获晶体进行交联以增强其结构。

4、所述的方法，包括以下步骤：

5、步骤(1)：使用反溶剂共结晶方法制备发光蛋白质晶体：将配备的eu(tta)3phen和tb(acac)3phen分别与鸡蛋白溶菌酶溶液混合，得到稀土络合物杂化发光晶体；

6、步骤(2)：稀土络合物杂化发光晶体浸泡入戊二醛中进行晶体交联，获得稳定的发光蛋白质晶体。

7、所述的方法，步骤(1)中，晶体采用反溶剂共结晶方法培养；使用乙醇配制eucl3溶液和tbcl3溶液，使用乙醇配制配体溶液：2-噻吩甲酰三氟丙酮(tta)、邻菲罗啉(phen)、乙酰丙酮(acac)，使用超纯水配制鸡蛋白溶菌酶溶液；镧系离子溶液与配体溶液按比例混合得到稀土络合物溶液；其中乙醇、水这两种溶剂是反溶剂，两种溶剂混合制备共结晶晶体。

8、所述的方法，步骤(1)中，配制的络合物混合溶液中各物质的摩尔浓度比为eucl3：tta：phen＝1:3:1，tbcl3：acac：phen＝1:3:1。

9、所述的方法，步骤(1)中，鸡蛋白溶菌酶用超纯水溶解配制成浓度为0.1-0.001m的溶液，用超声机加速溶解且分散均匀；

10、配制铕络合物溶液：分别配制0.01m eucl3乙醇溶液、0.03m 2-噻吩甲酰三氟丙酮(tta)乙醇溶液和0.01m邻菲罗啉(phen)乙醇溶液；将三种溶液按1:1:1的比例混合制成浓度为0.01m的eu(tta)3phen乙醇溶液；

11、配制铽络合物溶液：分别配制0.01m tbcl3乙醇溶液、0.03m乙酰丙酮(acac)乙醇溶液和0.01m邻菲罗啉(phen)乙醇溶液；将三种溶液按1:1:1的比例混合制成浓度为0.01m的tb(acac)3phen乙醇溶液；

12、制备铕络合物与蛋白质共结晶晶体：将不同浓度的鸡蛋白溶菌酶水溶液与铕络合物乙醇溶液按1:3的溶液体积比例在室温25℃下混合于离心管中，观察到晶体在离心管中生成；

13、制备铽络合物与蛋白质共结晶晶体：将不同浓度的鸡蛋白溶菌酶水溶液与铽络合物乙醇溶液按1:3的溶液体积比例在室温下25℃下混合于离心管中，观察到晶体在离心管中生成；

14、将两种共结晶晶体(etp/tap-hewl)转移到超纯水中洗涤，洗去多余的蛋白质链和稀土络合物。

15、所述的方法，步骤(2)中，首先制备稳定剂：用超纯水配制1.0m的氯化钠、0.05m的乙酸钠(用乙酸调节ph为4.6)、30％w/v聚乙二醇5000单甲醚的溶液，制成ph为4.6的蛋白质稳定剂；然后用稳定剂稀释戊二醛溶液，配制成浓度为4vol％的戊二醛交联剂；最后将晶体转移到戊二醛溶液中交联24小时；交联后的晶体转移到乙醇中，洗涤2-3次，持续一段时间以去除多余的稀土络合物、蛋白质链和戊二醛。

16、任一所述方法制备的eu3+/tb3+掺杂蛋白质共晶制备氨基酸荧光传感器。

17、所述的eu3+/tb3+掺杂蛋白质共晶制备氨基酸荧光传感器的应用，用于检测氨基酸浓度，随着氨基酸浓度的改变，晶体的发光强度发生改变。用氨基酸对共晶晶体中的稀土络合物进行荧光效果改变，以超纯水为溶剂，配制10～100u/l的不同浓度的氨基酸，使用的氨基酸为色氨酸、苏氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、异亮氨酸。将晶体分别加入到氨基酸溶液(10～100u/l)中，10～60分钟后检测荧光强度。将晶体采用浸没方法由低浓度到高浓度(10u/l～100u/l)浸没到溶液中，对同一位置进行显微镜观察及显微微区荧光检测。将8种氨基酸的10个不同浓度对发光晶体的影响趋势作f0/f-氨基酸浓度的浓度对荧光强度影响的图。因为40u/l为人体内氨基酸含量的警戒线，当高于40u/时，人体会产生不健康的症状，所以以氨基酸溶液浓度为40u/l为界，进行分段拟合，最后模拟出各氨基酸不同浓度范围内的拟合公式。

18、本发明的有益效果是：蛋白质晶体可以作为有良好生物相容性的载体，通过与稀土络合物共结晶，得到杂化发光晶体，杂化发光晶体可以有效检测氨基酸浓度，随着氨基酸浓度的改变，晶体的发光强度发生改变。

技术特征：

1.一种eu3+/tb3+掺杂蛋白质共晶制备氨基酸荧光传感器的方法，其特征在于，以eu3+/tb3+络合物溶液和蛋白质溶液共混、产物析出共结晶的方法获得的eu3+/tb3+掺杂的发光蛋白质晶体etp/tap-hewl，并对所获晶体进行交联以增强其结构。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述制备杂化晶体材料的方法，其特征在于，步骤(1)中，晶体采用反溶剂共结晶方法培养；使用乙醇配制eucl3溶液和tbcl3溶液，使用乙醇配制配体溶液：2-噻吩甲酰三氟丙酮(tta)、邻菲罗啉(phen)、乙酰丙酮(acac)，使用超纯水配制鸡蛋白溶菌酶溶液；镧系离子溶液与配体溶液按比例混合得到稀土络合物溶液；其中乙醇、水这两种溶剂是反溶剂，两种溶剂混合制备共结晶晶体。

4.根据权利要求3所述制备杂化晶体材料的方法，其特征在于，步骤(1)中，配制的络合物混合溶液中各物质的摩尔浓度比为eucl3：tta：phen＝1:3:1，tbcl3：acac：phen＝1:3:1。

5.根据权利要求2所述制备杂化晶体材料的方法，其特征在于，步骤(1)中，鸡蛋白溶菌酶用超纯水溶解配制成浓度为0.1-0.001m的溶液，用超声机加速溶解且分散均匀；

6.根据权利要求2所述制备杂化晶体材料的方法，其特征在于，步骤(2)中，首先制备稳定剂：用超纯水配制1.0m的氯化钠、0.05m的乙酸钠(用乙酸调节ph为4.6)、30％w/v聚乙二醇5000单甲醚的溶液，制成ph为4.6的蛋白质稳定剂；然后用稳定剂稀释戊二醛溶液，配制成浓度为4vol％的戊二醛交联剂；最后将晶体转移到戊二醛溶液中交联24小时；交联后的晶体转移到乙醇中，洗涤2-3次，持续一段时间以去除多余的稀土络合物、蛋白质链和戊二醛。

7.根据权利要求1-6任一所述方法制备的eu3+/tb3+掺杂蛋白质共晶制备氨基酸荧光传感器。

8.根据权利要求7所述的eu3+/tb3+掺杂蛋白质共晶制备氨基酸荧光传感器的应用，其特征在于，用于检测氨基酸浓度，随着氨基酸浓度的改变，晶体的发光强度发生改变。

技术总结本发明公开了一种Eu<supgt;3+</supgt;/Tb<supgt;3+</supgt;掺杂蛋白质共晶制备氨基酸荧光传感器及方法和应用，以Eu<supgt;3+</supgt;/Tb<supgt;3+</supgt;络合物溶液和蛋白质溶液共混，产物析出共结晶的方法获得的Eu<supgt;3+</supgt;/Tb<supgt;3+</supgt;掺杂的发光蛋白质晶体ETP/TAP‑HEWL，并对所获晶体进行交联以增强其结构。蛋白质晶体可以作为有良好生物相容性的载体，通过与稀土络合物共结晶，得到杂化发光晶体，杂化发光晶体可以有效检测氨基酸浓度，随着氨基酸浓度的改变，晶体的发光强度发生改变。技术研发人员：唐建国,张敏,邱淼,宋瑞雪,王瑶,巴菲奥,基帕,李军,王世超受保护的技术使用者：青岛大学技术研发日：技术公布日：2024/7/11