多官能化硅纳米颗粒、其制备方法及其在基于电化学发光的检测方法中的用途与流程

本发明涉及新型多官能化硅纳米颗粒、其制备方法及包含该新型多官能化硅纳米颗粒的组合物。本发明还涉及该新型多官能化硅纳米颗粒在基于电化学发光的检测方法和被分析物的体外检测中的用途。特别地，本发明涉及通过使用该新型多官能化硅纳米颗粒的体外方法测量被分析物的方法。发明背景硅纳米颗粒具有高比表面积，提供高载药容量。它们的体内高生物相容性和低毒性使硅纳米颗粒是有吸引力的材料，尤其是对于将药物/化合物递送至细胞中。y.-r.kim等人(y.-r.kim等人,electroanalysis2013,25(4),1056-1063)描述了基于ru(bpy)3)2+-掺杂二氧化硅纳米颗粒和杯[4]冠-5(calix[4]crown-5)自组装单层检测免疫球蛋白g(igg)的基于电致化学发光(ecl)的免疫传感器。wo2013/087734a2描述了硅纳米颗粒及其在放射性核素疗法中的用途，所述硅纳米颗粒用包含治疗相关放射性核素的放射性金属配合物官能化。电致化学发光(也称为电化学发光并缩写为ecl)是在电极处生成的氧化共反应物经历高能电子转移反应以形成发光的激发态的金属配合物的过程。在1960年代中期，hercules和bard等人描述了首次详细的ecl研究。在研究大约50年后，ecl现在已经成为非常有力的分析技术，并广泛应用于例如免疫测定、食品与水的检测和生物战试剂(biowarfareagent)检测的领域。在实践中，大多数基于ecl的免疫测定涉及使用电化学发光化合物作为标记物。标记物质的存在或标记物质在结合反应中的参与通过检测来自ecl标记物的电化学发光测定。对于免疫测定中的更灵敏的检测方法总是有很高的需求。对于基于电化学发光的检测方法也是如此。现在惊奇地发现，可以提供用于基于ecl的免疫测定的新型多官能化硅纳米颗粒，并且出乎意料地，这样的多官能化硅纳米颗粒可以以很大的优势用在这些测定中。发明概述本发明在一个方面涉及一种多官能化硅纳米颗粒，其包含(a)尺寸为1纳米至10纳米的硅芯，(b)端胺的c3-c18氨基烷基、端胺的3-(2-氨基-乙氧基)-丙基、端胺的3-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-丙基或端胺的2-(4-氨基-甲基-苯基)-乙基，其中所述基团共价键合到硅芯，(c)1至10个共价键合到端胺的c3-c18氨基烷基、端胺的3-(2-氨基-乙氧基)-丙基、端胺的3-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-丙基或端胺的2-(4-氨基-甲基-苯基)-乙基的亲合力结合剂，优选通过连接体共价键合，和(d)1至100个共价键合到端胺的c3-c18氨基烷基、端胺的3-(2-氨基-乙氧基)-丙基、端胺的3-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-丙基或端胺的2-(4-氨基-甲基-苯基)-乙基的电化学发光化合物，优选通过连接体共价键合。在一个实施方案中，多官能化硅纳米颗粒对应于式(i)其中n是3至18的整数，x是1至10的整数，y至少为1，z是1至100的整数，l1为连接体，l2为连接体，其中，l1和l2是相同的或不同的，si是尺寸为1纳米至10纳米的硅芯，r是h、具有一个反应性基团的-co-l2、-co-失活l2，其中l2为如上所定义、或由表面修饰试剂得到的残基，和m是电化学发光金属配合物或其盐。在另一个实施方案中，在如上定义的多官能化硅纳米颗粒中，亲合力结合剂选自被分析物、蛋白质、抗体、生物素、生物素类似物、亲和素、链霉亲和素、糖、凝集素、酶、多肽、核酸、核酸类似物、互补核酸、核苷酸、多核苷酸、肽核酸(pna)、多糖、金属离子螯合剂、受体激动剂和受体拮抗剂。在一个优选的实施方案中，亲合力结合剂是核酸、互补核酸、抗原或抗体，或被分析物。在另一个实施方案中，在如上定义的多官能化硅纳米颗粒中，所述亲合力结合剂是亲合力结合对的配偶体或成员。在另一个实施方案中，在如上定义的多官能化硅纳米颗粒中，所述亲合力结合剂是选自核酸和互补核酸、或抗原和抗体的结合对的成员。在另一个实施方案中，在如上定义的多官能化硅纳米颗粒中，n是3、6或11，优选n是3。在另一个实施方案中，在如上定义的多官能化硅纳米颗粒中，x是1至5、1至4、1至3的整数，或为1或2，或1。在另一个实施方案中，在如上定义的多官能化硅纳米颗粒中，y是1至1000的整数，优选y是1至500的整数。在另一个实施方案中，在如上定义的多官能化硅纳米颗粒中，z是1至90，例如，20至90、30至90、40至90、50至90、60至90、70至80、1至80、1至70、1至60、1至50或1至40的整数。在一个优选实施方案中，z是50至100的整数。在一个特别优选的实施方案中，z是50至70的整数。在再一个实施方案中，在如上定义的多官能化硅纳米颗粒中，l1具有直链或支链的未取代或取代的c1-c20烷基链、c1-c20烯基链、或由碳原子、取代的碳原子和/或一个或多个选自o、n和s的原子构成的1至20个原子的链作为主链，或具有其中主链含有一个或多个环或杂环的芳族或非芳族环系的如前所述的链。在另一个实施方案中，在如上定义的多官能化硅纳米颗粒中，l2是通过杂双官能交联剂(heterobifunctionalcrosslinker)的反应形成的连接体，所述杂双官能交联剂是例如分别键合至巯基和氨基的杂双官能交联剂。如本文定义的多官能化硅纳米颗粒的任何实施方案的任何组合被认为在本发明的范围内。在另一个方面，本发明涉及如上定义的多官能化硅纳米颗粒在基于电化学发光的检测方法中的用途。在另一个方面，本发明涉及如上定义的多官能化硅纳米颗粒用于在水溶液中进行电化学发光反应的用途。在另一个方面，本发明涉及如上定义的多官能化硅纳米颗粒在被分析物的体外检测中的用途。在另一个方面，本发明涉及包含如上定义的多官能化硅纳米颗粒的组合物。另一方面，本发明涉及一种通过体外方法测量被分析物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供怀疑或已知含有被分析物的样品，(b)使所述样品与如上定义的多官能化硅纳米颗粒在适于形成被分析物与多官能化硅纳米颗粒的复合物的条件下接触，以获得被分析物-多官能化硅纳米颗粒复合物，和(c)测量在步骤(b)中形成的被分析物-多官能化硅纳米颗粒复合物和从而获得被分析物的量。另一方面，本发明涉及一种通过体外方法测量被分析物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供怀疑或已知含有被分析物的样品，(b)使所述样品与如上定义的多官能化硅纳米颗粒(其中所述纳米颗粒包含被分析物)与被分析物特异性亲合力结合剂在适于形成多官能化硅纳米颗粒和被分析物特异性亲合力结合剂的复合物的条件下接触以获得被分析物特异性亲合力结合剂-多官能化硅纳米颗粒复合物，和(c)测量在步骤(b)中形成的被分析物特异性亲合力结合剂-多官能化硅纳米颗粒复合物和从而获得被分析物的量。附图简述图1示出si-[ru]纳米颗粒的xps谱图。图1(a)示出了全谱扫描。图1(b)示出了si扫描。图1(c)示出了c扫描。图1(d)示出了采用去卷积的n扫描。图2示出si-[ru]纳米颗粒的tem图像。图3(a)示出在水溶液中的si-nh2纳米颗粒、si-[ru]纳米颗粒和rubpy的uv-vis吸收光谱。图3(b)示出在λ激发=375纳米下在水溶液中的si-[ru]纳米颗粒和rubpy-cooh的发射光谱。rubpy的浓度为10-5m。图4示出在procell溶液中的si-[ru]纳米颗粒和rubpy的uv-vis吸收光谱。rubpy的浓度为10-5m。图5(a)示出在procell中的10-5mrubpy(上方的线)和10-5msi-[ru]纳米颗粒(下方的线)以0.05vs-1的扫描速率在循环伏安期间记录的ecl强度。图5(b)示出了在procell中的10-5mrubpy(上方的线)和10-5msi-[ru]纳米颗粒(下方的线)的ecl强度vs时间。图5(c)示出在procell中的10-5mrubpy(上方的线)和10-5msi-[ru]纳米颗粒(下方的线)的ecl光谱。图6(a)示出在0.1mtbapf6dmf溶液中的0.1mmrubpy在0.05vs-1至1vs-1的不同扫描速率下的循环伏安图。图6(b)示出rubpy的ivsv1/2图。图6(c)示出在0.1mtbapf6dmf溶液中的0.1mmsi-[ru]纳米颗粒在0.05vs-1至1vs-1的不同扫描速率下的循环伏安图。图6(d)示出si-[ru]纳米颗粒的ivsv1/2图。图7示出si-[ir]纳米颗粒的xps谱图。图7(a)示出了全谱扫描。图7(b)示出了ir扫描。图7(c)示出了si扫描。图7(d)示出了采用去卷积的n扫描。图8示出si-[ir]纳米颗粒的tem图像。ir配合物的浓度为10-5m。图9示出在dmf溶液中的si-nh2nps、si-[ir]nps和ir配合物的uv-vis吸收光谱。图10示出在procell溶液中的si-[ir]nps和ir配合物的uv-vis吸收光谱。图11(a)示出在procell中的10-5mrubpy(上方的线)、10-5mir配合物(下方的线)和10-5msi-[ir]nps(中间的线)以0.05vs-1的扫描速率在循环伏安法过程中记录的ecl强度。图11(b)示出在procell中的10-5mrubpy(上方的线)、10-5mir配合物(下方的线)和10-5msi-[ir]纳米颗粒(中间的线)的ecl强度vs时间。图11(c)示出在procell中的10-5mrubpy(上方的线)、10-5mir配合物(下方的线)和10-5msi-[ir]纳米颗粒(中间的线)的ecl谱图。图12(a)示出在0.1mtbapf6dmf溶液中的0.1mmsi-[ir]纳米颗粒在0.05vs-1至1vs-1的不同扫描速率下的循环伏安图。图12(b)示出si-[ir]纳米颗粒的ivsv1/2的图。发明详述新型多官能硅纳米颗粒如上所指出的，需要多官能化硅纳米颗粒，其适合用于基于电化学发光的检测方法和被分析物的体外检测，特别是基于ecl的免疫测定，例如基于ecl的夹心免疫测定中。特别地，需要用于基于ecl的免疫测定的硅纳米颗粒，其允许通过优化纳米颗粒的尺寸和表面官能调节(tailor)硅纳米颗粒的物理和化学性质。因此，本发明所解决的问题是提供具有上述所需的特性的多官能化硅纳米颗粒。在一个方面，本发明提供新型多官能化硅纳米颗粒，其包含(a)尺寸为1纳米至10纳米的硅芯，(b)端胺的c3-c18氨基烷基、端胺的3-(2-氨基-乙氧基)-丙基、端胺的3-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-丙基或端胺的2-(4-氨基-甲基-苯基)-乙基，其中所述基团共价键合到硅芯，(c)1至10个共价键合到端胺的c3-c18氨基烷基、端胺的3-(2-氨基-乙氧基)-丙基、端胺的3-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-丙基或端胺的2-(4-氨基-甲基-苯基)-乙基的亲合力结合剂，优选通过连接体共价键合，和(d)1至100个共价键合到端胺的c3-c18氨基烷基、端胺的3-(2-氨基-乙氧基)-丙基、端胺的3-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-丙基或2-(4-氨基-甲基-苯基)-乙基的电化学发光化合物，优选通过连接体共价键合。硅芯的尺寸为1纳米至10纳米，并且包含多个硅原子。在一个实施方案中，硅芯的尺寸为1纳米至9纳米，例如为1纳米至8纳米、1.5纳米至7纳米、2纳米至6纳米、2纳米至5纳米。该端胺的c3-c18氨基烷基、端胺的3-(2-氨基-乙氧基)-丙基、端胺的3-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-丙基和端胺的2-(4-氨基-甲基-苯基)-乙基通过si-c键共价键合到硅芯。如本文所用，包括所附的权利要求，共同使用的术语具有下面的含义。如本文所用，术语“多官能化硅纳米颗粒”是指至少两种不同类型的官能化合物键合到硅纳米颗粒的硅芯的表面上。在一个实施方案中，官能化合物通过连接至端胺的c3-c18氨基烷基、端胺的3-(2-氨基-乙氧基)-丙基、端胺的3-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-丙基或端胺的2-(4-氨基-甲基-苯基)-乙基的连接体键合至硅芯。如本文所用，术语“官能化合物”是指需要用于特定的应用，例如用于靶向特定类型的组织或细胞，或者用于允许在测定中检测的任何化合物。实例包括但不限于亲合力结合剂—任何标记物，例如用于测量目标被分析物的测定中的电化学发光化合物和荧光化合物。在一个实施方案中，包含在多官能化硅纳米颗粒中的至少一种官能化合物是亲合力结合剂并且包含在多官能化硅纳米颗粒中的至少一种化合物是电化学发光化合物。本文中所用的术语“连接体”具有本领域技术人员已知的含义，并涉及用于连接两个或更多个分子的分子或分子基团。连接体的特征在于在柔性或刚性构架(scaffold)上具有两个或更多个化学上正交的(orthogonal)官能团。在本发明的意义上，共价键不是连接体。如本文所用，术语“c3-c18氨基烷基”单独或组合表示h2n-r'-基团，其中r'是c3-c18烷基，并且是具有3至18个碳原子的直链或支链烷基，优选为具有3、6或11个碳原子的直链或支链烷基，特别优选具有3个碳原子的直链烷基。直链c3-c18氨基烷基的实例是氨基丙基、氨基丁基、氨基己基和氨基十一烷基，优选氨基丙基。如本文所用，术语“亲合力结合剂”是指能够由于分子之间的相互吸引作用(这导致稳定的缔合，其中这些分子彼此靠近)而分子键合到另一分子(靶分子或靶)上的分子。分子键合的结果是形成分子复合物。复合物的组分之间的吸引结合通常比共价键弱。在本发明情况下，该结合剂是亲合力结合剂，这意味着其能够形成亲合力结合剂与其靶之间的亲合力复合物。这样的复合物在各条件下，例如在水性介质中在标准条件下是稳定的。可参与分子键合的分子包括，但不限于，蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质和有机小分子，如药物。因此，由于分子键合形成的复合物的类型包括但不限于以下的亲合力结合剂-靶分子复合物：蛋白质-蛋白质、蛋白质-dna、蛋白质-激素、蛋白质-药物、抗原-抗体、受体-配体、生物素–亲和素或链霉亲和素、核酸-互补核酸或受体-受体拮抗剂/激动剂。亲合力结合剂的实例包括，但不限于被分析物、抗原、蛋白质、抗体、生物素、生物素类似物、亲和素、链霉亲和素、糖、凝集素、酶、多肽、核酸、核酸类似物、互补核酸、核苷酸、多核苷酸、肽核酸(pna)、多糖、金属离子螯合剂、受体激动剂或受体拮抗剂。例如，该亲合力结合剂可以是特异性结合对的一个配偶体，其中所述结合对的另一配偶体与细胞表面或细胞内结构上的靶缔合或是细胞表面或细胞内结构上的靶。亲合力结合剂具有至少107l/mol的与其靶的亲合力，例如特异性结合对的一个成员，如抗体，与该特异性结合对的另一成员，如其抗原之间的结合力。亲合力结合剂优选对其靶具有108l/mol或甚至更优选109l/mol的亲合力。如本文所用，术语“被分析物”是指任何无机或有机分子，包括任何目标生物物质。代表本发明意义上的被分析物的合适的生物物质的实例是细胞、病毒、亚细胞颗粒、蛋白质、脂蛋白、糖蛋白、肽、多肽、核酸、寡糖、多糖、脂多糖、细胞代谢物、半抗原、激素、药物物质、生物碱、甾族化合物、维生素、氨基酸和糖。被分析物可以选自多肽、碳水化合物和无机或有机药物分子。多肽或蛋白质是基本上由氨基酸组成并具有由肽键连接的至少两个氨基酸的分子。在作为本文公开的方法中研究的目标被分析物的情况下，所述多肽优选由至少5、6、7、8、9、10、12、15、20、25和30至最高达约10,000个氨基酸构成。优选地，所述多肽包含5至2000，还优选10至1000个氨基酸。在被分析物是核酸的情况下，这些核酸优选是天然存在的dna或rna寡核苷酸。生物素类似物是氨基生物素、亚氨基生物素或脱硫生物素。本文所用的术语“寡核苷酸”或“核酸”通常是指包含至少8个核苷酸和最多大约1000个核苷酸的短的、通常单链的多核苷酸。在一个优选实施方案中，寡核苷酸具有至少9、10、11、12、15、18、21、24、27或30个核苷酸的长度。在一个优选实施方案中，寡核苷酸具有不多于200、150、100、90、80、70、60、50、45、40、35或30个核苷酸的长度。术语寡核苷酸应广义地理解并包括dna和rna及其类似物和变形。核酸类似物可以例如包括在标准碱基脱氧腺苷(da)、脱氧鸟苷(dg)、脱氧胞苷(dc)、脱氧胸苷(dt)、脱氧尿苷(du)处带有取代基的取代的核苷酸。此类取代的核碱基的实例是：5-取代的嘧啶，如5甲基dc、氨基烯丙基du或dc、5-(氨基乙基-3-丙烯酰亚胺基)-du、5-丙炔基-du或-dc、5卤代-du或-dc；n取代的嘧啶，如n4-乙基-dc；n取代的嘌呤，如n6-乙基-da、n2-乙基-dg、8取代的嘌呤，如8-[6-氨基)-己-1-基]-8-氨基-dg或-da、8卤代da或dg、8-烷基dg或da和2取代的da，如2氨基da。核酸类似物可含有核苷酸或核苷酸类似物。即天然存在的核碱基可以通过使用核碱基类似物，如-5-硝基吲哚-d-核糖核苷；3-硝基-吡咯-d-核糖核苷、脱氧肌苷(di)、脱氧黄苷(dx)；7脱氮-dg、-da、-di或-dx；7-脱氮-8-氮杂-dg、-da、-di或-dx；8-氮杂-da、-dg、-di或-dx；d-间型霉素；假du；假异dc；4硫代dt；6硫代dg；2硫代dt；异dg；5-甲基-异dc；n8连接的8-氮杂-7-脱氮-da；5,6-二氢-5-氮杂-dc；和乙烯桥-da(etheno-da)或吡咯并-dc(pyrrolo-dc)进行交换。如技术人员显而易见的，必须选择互补链中的核碱基以使双链体形成是特异性的。例如，如果在一个链(例如(a))中使用5-甲基-异-dc，在互补链(例如(a'))中必须使用异dg。在核酸类似物中，可以修饰寡核苷酸主链以含有取代的糖残基、糖类似物、核苷间(internucleoside)磷酸酯部分中的修饰，和/或是pna。寡核苷酸可以例如含有具有取代的脱氧核糖的核苷酸，如2'-甲氧基、2'-氟、2'-甲基硒代、2'-烯丙氧基、4'-甲基dn(其中n是核碱基，例如a、g、c、t或u)。糖类似物是例如木糖；2',4'桥接核糖，如(2'-o,4'-c亚甲基)-(称为lna的低聚物)或(2'-o,4'-c亚乙基)-(称为ena的低聚物)；l-核糖，l-d-核糖，己糖醇(称为hna的低聚物)；环己烯基(称为cena的低聚物)；阿卓糖醇(称为的ana低聚物)；三环核糖类似物，其中c3'和c5'原子通过亚乙基桥连接，其稠合成环丙烷环(称为tricyclodna的低聚物)；甘油(称为gna的低聚物)；吡喃葡萄糖(称为homodna的低聚物)；碳环核糖(carbaribose)(具有环戊烷而不是四氢呋喃子单元)；羟甲基吗啉(称为吗啉代dna的低聚物)。大量核苷间磷酸酯部分的修饰也已知不干扰杂化性质(hybridizationproperty)，这样的主链修饰也可以与取代的核苷酸或核苷酸类似物组合。实例是硫代磷酸酯寡核苷酸、二硫代磷酸酯寡核苷酸、氨基磷酸酯寡核苷酸和甲基磷酸酯寡核苷酸。pna(具有不含磷酸酯和d-核糖的主链)也可以用作dna类似物。上文提到的修饰核苷酸、核苷酸类似物以及寡核苷酸主链修饰可以按需要在本发明意义上的寡核苷酸中组合。在一个实施方案中，包含在如上定义的多官能化硅纳米颗粒中作为亲合力结合剂的被分析物是低分子量的被分析物，即具有2000道尔顿或更小的分子量的被分析物。包含在这样的多官能化硅纳米颗粒中的优选的被分析物尤其是诊断相关激素和/或代谢物。诊断相关激素或代谢物包括叶酸，尤其是包含在血浆和红细胞二者中的所谓的总叶酸，甾族化合物，如雌二醇、雌酮、孕酮、17-羟孕酮、皮质醇、睾酮、雄烯二酮(androstendione)；以及激素，如25-羟基维生素d3。术语“抗体”在本文中以最广义使用，并明确涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)，以及抗体片段，只要它们表现出所需的生物活性。“分离的”抗体是已经确定和从其天然环境的组分中分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染物组分是干扰该抗体的研究、诊断或治疗应用的材料，并可以包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。在一些实施方案中，将抗体纯化(1)至大于95重量％的抗体，如通过例如lowry法测定，以及在一些实施方案中，纯化至大于99重量％；(2)至足以获得n-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，通过使用例如转杯式测序仪进行，或(3)至均质，通过sds-page在还原或非还原条件下，使用例如考马斯蓝或银染色法进行。分离的抗体包括在重组细胞内的原位抗体，因为该抗体的天然环境的至少一种组分不存在。然而，分离的抗体通常通过至少一个纯化步骤制备。“天然抗体”通常是由两个相同的轻(l)链和两个相同的重(h)链构成的大约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。每个轻链通过一个共价二硫键连接到重链上，而二硫键在不同免疫球蛋白同种型的重链中的数量是变化的。各重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫桥(disulfidebridges)。各重链在一端具有可变域(vh)，接着是多个恒定域。各轻链在一端具有可变域(vl)，在其另一端具有恒定域；轻链的恒定域与重链的第一恒定域对齐，并且轻链的可变域与重链的可变域对齐。特定的氨基酸残基被认为形成轻链与重链可变域之间的界面。抗体的“可变区”或“可变域”是指该抗体的重链或轻链的氨基末端域。重链的可变域可以被称为“vh”。轻链的可变域可以被称为“vl”。这些域一般是抗体的最可变部分并包含抗原结合位点。术语“可变”是指下述事实：在抗体间，可变域的某些部分的序列广为不同，并用于各特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。但是，这种可变性并非均匀遍布在抗体的可变域中。其集中在三个区段中--在轻链和重链可变域中都称为高变区(hvr)。可变域的更高度保守的部分被称为构架区(fr)。天然重链和轻链的可变域各自包含通过三个hvr连接的大多采用β-折叠构型的四个fr区，其形成连接β-折叠结构并在一些情况下形成β-折叠结构的一部分的环。各链中的hvr通过fr区保持靠近在一起，并与来自其它链的hvr一起有助于形成抗体的抗原结合位点(参见kabat等人,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第五版,nationalinstituteofhealth,bethesda,md(1991))。在抗体和抗原的结合中不直接涉及恒定域，而是表现出各种效应子功能，例如在抗体依赖性细胞毒性中的抗体参与。来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可基于它们的恒定域的氨基酸序列归为被称作kappa(κ)和lambda(λ)的两种截然不同的类型之一。根据重链的恒定域的氨基酸序列，抗体(免疫球蛋白)可以被归为不同的类别。存在五种主要类别的免疫球蛋白：iga、igd、ige、igg和igm，且这些中的几种可以进一步分成亚类(同种型)，例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。不同类别的免疫球蛋白的子单元结构和三维构型是公知的，并且通常描述于例如abbas等人,cellularandmol.immunology,第4版,w.b.saunders,co.(2000)。抗体可以是通过抗体与一种或多种其它蛋白质或肽的共价或非共价缔合形成的较大融合分子的一部分。术语“全长抗体”、“完整抗体”和“整个抗体”在本文中可互换地用于指其基本上完整形式的抗体，而不是如下定义的抗体片段。该术语特别是指具有含有fc区的重链的抗体。“抗体片段”包含完整抗体的一部分，其优选包含其抗原结合区。抗体片段的实例包括fab、fab'、f(ab')2、和fv片段；双抗体(diabodies)；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段(称为"fab"片段，各自具有单一抗原结合位点)和剩余的"fc"片段(其名称反映了其容易结晶的能力)。胃蛋白酶处理产生f(ab')2片段，其具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。“fv”是最小抗体片段，其包含完整抗原结合位点。在一个实施方案中，双链fv种类由紧密、非共价缔合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。在单链fv(scfv)种类中，一个重链可变域和一个轻链可变域可以通过柔性肽连接体共价连接，使得轻链和重链可以以类似于双链fv种类的“二聚”结构缔合。在这种构型中各可变域的三个hvr相互作用以限定vh-vl二聚体的表面上的抗原结合位点。总共六个hvr赋予抗体抗原结合特异性。然而，甚至单个可变域(或仅包含对抗原特异性的三个hvr的一半fv)也具有识别和结合抗原的能力，不过以低于整个结合位点的亲合力。该fab片段含有重链和轻链可变域，并还含有轻链的恒定域和重链的第一恒定域(ch1)。fab'片段与fab片段的区别在于在重链ch1域的羧基末端添加一些残基(包括一个或多个来自抗体绞链区的半胱氨酸)。fab'-sh是本文关于fab'的名称，其中恒定域的一个或多个半胱氨酸残基具有游离巯基。f(ab')2抗体片段初始作为之间具有铰链半胱氨酸的fab'片段的对产生。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。“单链fv”或“scfv”抗体片段包含抗体的vh和vl域，其中这些域存在于单多肽链中。一般地，scfv多肽进一步包含在vh和vl域之间的多肽连接体，其使得scfv能够形成用于抗原结合的所需结构。关于scfv的综述，参见例如plueckthun,in:thepharmacologyofmonoclonalantibodies,第113卷,rosenburg和moore(编辑),springer-verlag,newyork(1994)，第269-315页。术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的抗体片段，所述片段包含与相同多肽链(vh-vl)中的轻链可变域(vl)连接的重链可变域(vh)。通过使用太短而不允许在同一链上的两个结构域之间配对的连接体，这些域被迫与另一条链的互补域配对，并且产生两个抗原结合位点。双抗体可以是二价或双特异性的。在例如ep0404097;wo1993/01161;hudson,p.j.等人,nat.med.9(2003)129-134;和holliger,p.等人,pnasusa90(1993)6444-6448中更充分描述了双抗体。三抗体和四抗体也描述在hudson,p.j.等人,nat.med.9(2003)129-134中。本文中所用的术语“单克隆抗体”是指由基本上同质抗体群所获得的抗体，即包含各个抗体的群除了可能少量存在的可能的突变，例如天然存在的突变外是相同的。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征为不是离散抗体的混合物。在某些实施方案中，这样的单克隆抗体通常包括包含结合靶的多肽序列的抗体，其中通过包括从多个多肽序列中选择单个靶结合多肽序列的方法获得靶结合多肽序列。例如，选择过程可以是从许多克隆诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组dna克隆的集合体中选择单一克隆。应当理解，选择的靶结合序列可进一步改变，例如以改善对靶的亲合力、将靶结合序列人源化、改善其在细胞培养物中的产量、降低其在体内的免疫原性、产生多特异性抗体，或在限定位置引入反应性基团如半胱氨酸等；并且包含改变的靶结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，单克隆抗体制备物的各单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体制备物的优势在于它们通常未被其它免疫球蛋白污染。如本文所用的术语“电化学发光化合物”是指任何电化学发光化合物，其可以共价键合(如果适当的话通过连接体)至端胺的c3-c18氨基烷基、端胺的3-(2-氨基-乙氧基)-丙基、端胺的3-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-丙基或2-(4-氨基-甲基-苯基)-乙基。电化学发光(ecl)化合物的实例包括带正电荷的ecl金属配合物、带负电荷的ecl金属配合物和电中性的ecl金属配合物。在一个实施方案中，本发明的多官能化硅纳米颗粒对应于式(i)其中n是3至18的整数，x是1至10的整数，y至少为1，z是1至100的整数，l1为连接体，l2为连接体，其中，l1和l2是相同的或不同的，si是尺寸为1纳米至10纳米的硅芯，r是h、具有一个反应性基团的-co-l2、-co-失活l2，其中l2为如上所定义、或由表面修饰试剂得到的残基，和m是电化学发光金属配合物或其盐。在一个实施方案中，在如上定义的多官能化硅纳米颗粒中，亲合力结合剂选自被分析物、蛋白质、抗体、生物素、生物素类似物、亲和素、链霉亲和素、糖、凝集素、酶、多肽、核酸、核酸类似物、互补核酸、核苷酸、多核苷酸、肽核酸(pna)、多糖、金属离子螯合剂、受体激动剂和受体拮抗剂。在一个优选的实施方案中，亲合力结合剂是核酸、互补核酸、抗原、抗体或被分析物。在另一个实施方案中，亲合力结合剂是一种低分子量的被分析物或其衍生物，优选具有2000道尔顿或更小的分子量的被分析物。包含在本发明的多官能化硅纳米颗粒中的优选被分析物是如本文定义的生理/诊断相关的激素和代谢物。如本文所用，术语“低分子量的被分析物的衍生物”是指具有结合性质(这与样品中的被分析物的结合性质相当)的被分析物的任何衍生物。在另一个实施方案中，在如上定义的多官能化硅纳米颗粒中，所述亲合力结合剂是亲合力结合对配偶体或成员。在另一个实施方案中，在如上定义的多官能化硅纳米颗粒中，所述亲合力结合剂是选自核酸和互补核酸、或抗原和抗体的结合对的成员。在另一个实施方案中，在如上定义的多官能化硅纳米颗粒中，n是3至17，例如3至16、1至15、1至14、3至12或3至11的整数，优选地，n为3、6或11。在一个特别优选的实施方案中，n是3。在另一个实施方案中，在如上定义的多官能化硅纳米颗粒中，x是1至5，例如，1至4、1至3、1或2、或1的整数。在一个特别优选的实施方案中，x是1。在另一个实施方案中，在如上定义的多官能化硅纳米颗粒中，y是1至1000，例如1至900、1至800、1至700、1至600或1至500的整数。在一个特别优选的实施方案中，y是1至500的整数；在另一个实施方案中，在如上定义的多官能化硅纳米颗粒中，z是1至90，例如，20至90、30至90、40至90、50至90、60至90、70至80、1至80、1至70、1至60、1至50或1至40的整数。在一个优选实施方案中，z是50至100的整数。在一个特别优选的实施方案中，z是50至70的整数。在另一个实施方案中，在如上定义的多官能化硅纳米颗粒中，l1具有直链或支链的未取代或取代的c1-c20烷基链、c1-c20烯基链或由碳原子、取代的碳原子和/或一个或多个选自o、n和s的原子构成的1至20个原子的链作为主链，或具有其中主链含有一个或多个环或杂环的芳族或非芳族环系的如前所述的链。如本文所用，术语“烷基”单独或组合表示具有1至20个碳原子的直链或支链烷基，优选具有1至10个碳原子的直链或支链烷基，和特别优选具有1至6个碳原子的直链或支链烷基；或具有1至20个原子，优选具有1至10个原子，包含选自o、n、p和s的1至4个杂原子的杂烷基链。直链和支链基团的实例包括但不限于，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、异构戊基类、异构己基类、异构庚基类、异构辛基类，优选甲基和乙基，最优选甲基。如本文所用，术语“烯基”单独地或组合表示包含烯键和2至20，优选2至10，特别优选2至6个碳原子的直链或支链烃残基。烯基的实例是乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基和异丁烯基。优选实例是2-丙烯基。如本文所用，术语“c1-c10烷氧基”指基团r'o-，其中r'是c1-c10烷基并具有上文所定义的含义。c1-c10烷氧基的实例是甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基和叔丁氧基，优选甲氧基和乙氧基。在另一个实施方案中，在如上定义的多官能化硅纳米颗粒中，l1具有直链或支链的未取代或取代的c1-c12烷基链、c2-c12烯基链或由碳原子、取代的碳原子和/或一个或多个选自o、n和s的原子构成的1至12个原子的链作为主链，或具有其中主链含有一个或多个环或杂环的芳族或非芳族环系的如前所述的链。在一个实施方案中，l1为包含c1-c10烷基链或具有8至20个碳原子的芳基烷基链的连接体。在一个实施方案中，l1是包含c1-c10烷基链、c2-c10烯基链、c1-c10烷氧基链、-c1-c10烷基-conh-、-c1-c10烷基-nhco-、或取代或未取代的5-或6-元芳环的连接体。在一个特别优选的实施方案中，l1为-ch2-ch2-或-ch2-ch2-ch2-。在另一个实施方案中，在如上定义的多官能化硅纳米颗粒中，l2是通过杂双官能交联剂的反应形成的连接体，所述杂双官能交联剂是例如分别键合至巯基和氨基的杂双官能交联剂。优选地，所述杂双官能交联剂选自nhs-马来酰亚胺交联剂，其基于n-羟基琥珀酰亚胺和马来酰亚胺反应性基团；琥珀酰亚胺基-(peg)nnhs-peg-马来酰亚胺交联剂、nhs-卤代乙酰基交联剂；和nhs-吡啶二硫基交联剂。在一个特别优选的实施方案中，杂双官能交联剂是琥珀酰亚胺基-(peg)nnhs-peg-马来酰亚胺交联剂。如本文所定义的术语“反应性基团”是指适合与胺基团反应的任何基团，优选n-羟基琥珀酰亚胺基或马来酰亚胺基团，以将连接体键合至氨基；或适合于第二官能团结合，例如，与sh基团反应，优选马来酰亚胺基团，以将连接体键合至sh基的基团。在一个特别优选的实施方案中，l2是连接体，其通过选自以下的杂异双官能交联剂的反应形成nhs马来酰亚胺交联剂，例如amas(n-α-马来酰亚胺基乙酰-氧基琥珀酰亚胺酯)bmps(n-β-马来酰亚胺基丙酰-氧基琥珀酰亚胺酯)gmbs(n-γ马来酰亚胺基丁酰-氧基琥珀酰亚胺酯)磺基-gmbs(n-γ马来酰亚胺基丁酰-氧基磺基琥珀酰亚胺酯)mbs(间-马来酰亚胺基苯甲酰基-n-羟基琥珀酰亚胺酯)磺基-mbs(间-马来酰亚胺基苯甲酰基-n-羟基磺基琥珀酰亚胺酯)smcc(4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺酯)磺基-smcc(4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸磺基琥珀酰亚胺酯)emcs(n-ε-马来酰亚胺基己酰-氧基琥珀酰亚胺酯)磺基-emcs(n-ε-马来酰亚胺基己酰-氧基磺基琥珀酰亚胺酯)smpb(4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸琥珀酰亚胺酯)磺基-smpb(4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸磺基琥珀酰亚胺酯)smph(6-(β-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸琥珀酰亚胺酯)lc-smcc(4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-(6-酰胺基己酸琥珀酰亚胺酯))磺基-kmus(n-κ-马来酰亚胺基十一烷酰基-氧基磺基琥珀酰亚胺酯)。琥珀酰亚胺基-(peg)n-马来酰亚胺或nhs-peg-马来酰亚胺交联剂，例如sm(peg)2(peg基化smcc交联剂)nhs-pegn-马来酰亚胺琥珀酰亚胺基-([n-马来酰亚胺基丙酰胺基]-二-乙二醇)酯sm(peg)4(peg基化smcc交联剂)nhs-pegn-马来酰亚胺琥珀酰亚胺基-([n-马来酰亚胺基丙酰胺基]-四-乙二醇)酯sm(peg)6(peg基化长链smcc交联剂)nhs-pegn-马来酰亚胺琥珀酰亚胺基-([n-马来酰亚胺基丙酰胺基]-六-乙二醇)酯sm(peg)8(peg基化长链smcc交联剂)nhs-pegn-马来酰亚胺琥珀酰亚胺基-([n-马来酰亚胺基丙酰胺基]-八-乙二醇)酯sm(peg)12(peg基化长链smcc交联剂)nhs-pegn-马来酰亚胺琥珀酰亚胺基-([n-马来酰亚胺基丙酰胺基]-十二-乙二醇)酯sm(peg)24(peg基化长链smcc交联剂)nhs-pegn-马来酰亚胺琥珀酰亚胺基-([n-马来酰亚胺基丙酰胺基]-二十四-乙二醇)酯。nhs-卤代乙酰基交联剂，例如sia(碘代乙酸琥珀酰亚胺酯)sbap(3-(溴代乙酰胺基)丙酸琥珀酰亚胺酯)siab((4-碘代乙酰基)氨基苯甲酸琥珀酰亚胺酯)磺基-siab((4-碘代乙酰基)氨基苯甲酸磺基琥珀酰亚胺酯)和nhs-吡啶二硫基交联剂，例如spdp3-(2-吡啶二硫基)丙酸琥珀酰亚胺酯lc-spdp6-[3(2-吡啶二硫基)丙酰胺基]己酸琥珀酰亚胺酯磺基-lc-spdp(6-[3'-(2-吡啶二硫基)丙酰胺基]己酸磺基琥珀酰亚胺酯smpt(4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α(2-吡啶二硫基)甲苯)peg4-spdp(peg基化长链spdp交联剂)peg12-spdp(peg基化长链spdp交联剂)和α-[3-(o-吡啶二硫基)丙酰胺基]-ω-(丙酸琥珀酰亚胺酯)十六(乙二醇)。在一个实施方案中，在如上定义的多官能化硅纳米颗粒中，r是h、具有一个反应性基团的-co-l2、-co-失活l2，其中l2如上所定义、或由nhs-pegn-ome表面修饰试剂所得的残基。如本文所定义，术语“具有一个反应性基团的-co-l2”是指具有一个反应性基团，即n-羟基琥珀酰亚胺基团的连接体，该反应性基团由杂双官能交联剂的一个反应性基团的反应得到，经由酰胺基团-co-nh-连接至端胺的c3-c18氨基烷基、端胺的3-(2-氨基-乙氧基)-丙基、端胺的3-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-丙基或端胺的2-(4-氨基-甲基-苯基)-乙基。如本文所定义，术语“-co-失活l2”是指由淬灭连接体的剩余活化基团，例如用半胱氨酸淬灭马来酰亚胺得到的连接体。表面修饰试剂可以例如选自以下试剂：o-[(n-琥珀酰亚胺基)琥珀酰基-氨基乙基]-o-甲基聚乙二醇和在一个实施方案中，m是电化学发光(ecl)钌、锇、铼、铕、铽、镝或铱配合物。在一个优选的实施方案中，m是电化学发光(ecl)钌或铱配合物。本发明中的术语ecl配合物是本领域技术人员公知的，并包括带正电荷的ecl配合物、带负电荷的ecl配合物和电中性ecl配合物。由于金属离子在配位金属配合物中的阳离子性质，标记物分子的电中性通过一个或多个抗衡离子来实现。在一个实施方案中，m是具有带正电荷的发光体的ecl配合物，其选自通过引用全文并入本文的wo2003/002974a2、美国专利no.5221605和no.6316607所公开的ecl配合物，抗衡离子为氯离子、六氟磷酸根等。在一个实施方案中，m是具有带负电荷的发光体的ecl配合物，其选自通过引用全文并入本文的美国专利no.6808939所公开的ecl配合物，抗衡离子为，例如，钠离子或质子。在一个实施方案中，m为电中性ecl钌配合物，其选自通过引用并入本文的us2016/0146826a1中公开的ecl配合物。在一个实施方案中，m是选自通过引用并入本文的wo2012/107419a1、wo2012/107420a1、wo2014/019707a2、wo2014/019708a2、wo2014/019709a2、wo2014/019710a2和wo2014/019711a2中公开了的ecl配合物的ecl铱配合物。在一个优选的实施方案中，m是具有选自以下的芯结构的ecl配合物或。在一个特别优选的实施方案中，l1-m可获自下列金属配合物之一：ru(bpy)2-bpyco-osu(cas登记号137323-76-3，=钌(2+)双(2,2'-联吡啶-κn1,κn1')[1-[4-(4'-甲基[2,2'-联吡啶]-4-基-κn1,κn1')-1-氧代丁氧基]-2,5-吡咯烷二酮]-，(oc-6-33)ru(bpy)2-bpyco2h的反应性酯(=bpru或ru-bpy)，cas登记号115239-59-3))；或磺基bprunhs酯(=cas登记号482618-42-8，在本领域中也被称为钌酸(2-)双[[2,2'-联吡啶]-4,4'-二甲烷磺酸根合(2-)-κn1,κn1'][1-[4-(4'-甲基[2,2'-联吡啶]-4-基-κn1,κn1')-1-氧代丁氧基]-2,5-吡咯烷二酮]-钠(1：2)，(oc-6-31)，或ir(6-苯基菲啶)2-吡啶-2-甲酸或其衍生物，包括但不限于，例如ir(6-苯基菲啶)2-3-羟基吡啶-2-甲酸、ir(6-苯基菲啶)2-4-(羟甲基)吡啶-2-甲酸、ir(6-苯基菲啶)2-2-(羧乙基-苯基)吡啶-2-甲酸、ir(6-苯基菲啶)2-5-(甲氧基)吡啶-2-甲酸或ir(6-苯基菲啶)2-2-(羧乙基-苯基)吡啶-2-甲酸酯，或其衍生物，如与被一个或多个磺酸取代的配体的铱配合物，或例如cas登记号1556730-07-4(=ib3/47，在本领域也被称为铱酸(3-)[5-[4-(2-羧基乙基)苯基]-2-吡啶羧酸根合(2-)-κn1,κo2]双[2-(6-菲啶基-κn)-5-(3-磺酸根合丙氧基)苯基-κc]-铯氢(1：2：1)或其n-羟基琥珀酰亚胺酯；或与两个苯基菲啶配体的铱配合物，其具有两个磺酸根合丙氧基取代基，两个磺基甲基，包括2,9-菲啶二甲磺酸，6-苯基-，钠盐(cas登记号1554465-50-7)，或具有两个聚乙二醇取代基，或具有每种三个，或它们的组合。在一个实施方案中，本发明的多官能化硅纳米颗粒对应于式(i)其中n是3；x是1，y至少为1，z是1；l1为-ch2-ch2-或-ch2-ch2-ch2-，l2为如上定义的连接体，其中，l1和l2是相同的或不同的，si是尺寸为1纳米至10纳米的硅芯r是h、具有一个反应性基团的-co-l2、-co-失活l2，其中l2为如上所定义、或由如上定义的表面修饰试剂得到的残基，和m是电化学发光金属配合物或其盐，具有选自以下的芯结构：和。任何如上定义的实施方案的任何组合被认为是本发明的主题。制备本发明的多官能化硅纳米颗粒的方法本发明的一个问题是提供制备多官能化硅纳米颗粒的方法，其允许根据免疫测定的所需用途调节多官能化硅纳米颗粒。因此，本发明在一个方面涉及一种用于制备多官能化硅纳米颗粒的新方法。根据本发明的多官能化硅纳米颗粒例如可以通过以下两种方法来制备。方法i：在亲合力结合剂是低分子量被分析物或其衍生物的情况下，本发明的方法包括至少以下步骤：(a)使端胺的c3-c18氨基烷基硅纳米颗粒、端胺的3-(2-氨基-乙氧基)-丙基硅纳米颗粒、端胺的3-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-丙基硅纳米颗粒或端胺的2-(4-氨基-甲基-苯基)-乙基硅纳米颗粒与包含活化的连接体的电化学发光化合物，如果合适的话在溶剂的存在下，并且如果合适的话在偶联试剂的存在下反应，以获得在每种情况下通过连接体共价键合至1至100个电化学发光化合物的端胺的c3-c18氨基烷基硅纳米颗粒、端胺的3-(2-氨基-乙氧基)-丙基硅纳米颗粒、端胺的3-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-丙基硅纳米颗粒或端胺的2-(4-氨基-甲基-苯基)-乙基硅纳米颗粒，连接体和(b)使根据方法步骤(a)获得的官能化硅纳米颗粒与至少一种亲合力结合剂反应，所述亲合力结合剂共价键合到活化的连接体，如果合适的话在溶剂的存在下，并且如果合适的话在偶合试剂的存在下进行，从而得到如本文描述的本发明的多官能化硅纳米颗粒，其中所述亲合力结合剂为如本文所定义的低分子量被分析物或它们的衍生物。在一个实施方案中，在方法i中，作为亲合力结合剂包含在如本文定义的多官能化硅纳米颗粒中的被分析物是低分子量被分析物，即，它具有2000道尔顿或更小的分子量。包含在这样的多官能化硅纳米颗粒中的优选的被分析物是生理/诊断相关激素或代谢物。生理/诊断相关的激素或代谢物包括叶酸，尤其是包含在血浆和红细胞中的所谓的总叶酸、甾族化合物如雌二醇、雌酮、孕酮、17-羟孕酮、皮质醇、睾酮、雄烯二酮、激素如25-羟基维生素d3。方法ii：在亲合力结合剂包含氨基的情况下，例如，如果所述亲合力结合剂是蛋白质，本发明的方法包括至少以下步骤：(a)使端胺的c3-c18氨基烷基硅纳米颗粒、端胺的3-(2-氨基-乙氧基)-丙基硅纳米颗粒、端胺的3-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-丙基硅纳米颗粒或端胺的2-(4-氨基-甲基-苯基)-乙基硅纳米颗粒与包含活化的连接体的电化学发光化合物反应，如果合适的话在溶剂的存在下，并且如果合适的话在偶联试剂的存在下进行，以获得在每种情况下通过连接体共价键合至1至100个电化学发光化合物但仍包含末端氨基的端胺的c3-c18氨基烷基硅纳米颗粒、端胺的3-(2-氨基-乙氧基)-丙基硅纳米颗粒、端胺的3-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-丙基硅纳米颗粒或端胺的2-(4-氨基-甲基-苯基)-乙基硅纳米颗粒，连接体(b)使根据方法步骤(a)得到的官能化硅纳米颗粒与包含第一反应性基团(以键合至氨基)和第二反应性基团(以键合至例如sh基团)的杂双官能交联剂反应，从而将连接体经由第一(胺-)反应性基团键合至一个或多个末端氨基以获得包含1至100个电化学发光化合物以及一个或多个还包含第二反应性基团(例如sh反应性官能团)的活化的连接体的官能化硅纳米颗粒，以及(c)使根据方法步骤(b)获得的官能化硅纳米颗粒与蛋白质反应，由此将蛋白质经由第二反应性基团结合至亲合力结合剂，以得到本文定义的本发明的多官能化硅纳米颗粒的一个实施方案。用作方法i和ii的方法步骤(a)的起始材料的端胺的c3-c18氨基烷基硅纳米颗粒、端胺的3-(2-氨基-乙氧基)-丙基硅纳米颗粒、端胺的3-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-丙基硅纳米颗粒和端胺的2-(4-氨基-甲基-苯基)-乙基硅纳米颗粒可以通过如例如m.rosso-vasic,journalofmaterialschemistry(2009),19(33),5926-5933所述的方法制备。或者，它们可以如wo2013/087734a2或y.zhong,journalofamericanchemicalsociety(2013),135,8350-8356中所述获得。用于制备端胺的硅纳米颗粒的合适的单体包括但不限于2-丙烯-1-胺、3-丁烯-1-胺、4-戊烯-1-胺、5-己烯-1-胺、6-庚烯-1-胺、7-辛烯-1-胺、8-壬烯-1-胺、9-癸烯-1-胺、10-十一碳烯-1-胺、11-十二碳烯-1-胺、17-十八碳烯-1-胺、2-(2-丙烯-1-基氧基)-乙胺、2-[-(2-丙烯-1-基氧基)乙氧基]-乙胺和4-乙烯基苯甲胺。用作方法i和ii的方法步骤(a)中的起始材料的包含活化连接体的电化学发光化合物是本领域技术人员公知的并且是市售的或可以根据现有技术所描述的方法制备。包含活化连接体的电化学发光化合物例如公开在us2016/0146826a1、wo2014/019707a2、wo2014/019708a2、wo2014/019709a2、wo2014/019710a2和wo2014/019711a2中，其通过引用全文并入本文。在一个实施方案中，包含活化连接体的电化学发光化合物选自ru(bpy)2-bpyco-osu，ru(bpy)2-bpyco2h的反应性酯(=bpru，其是cas登记号为115239-59-3的n-羟基-琥珀酰亚胺酯，在本领域中也称为钌(1+)双(2-,2'-联吡啶-κn1,κn1')(4'-甲基[2,2'-联吡啶]-4-丁酸根合-κn1,κn1')-，(oc-6-33)-，六氟磷酸氢盐(1-)(1：1：2)，也称为钌(1+)双(2,2'-联吡啶-n,n')(4'-甲基[2,2'-联吡啶]-4-丁酸根合-n1,n1')-，-(oc-6-33)-，六氟磷酸氢盐(1-)(1：1：2))，或磺基-bprunhs酯(=cas登记号482618-42-8，在现有技术中也称为钌酸(2-)双[[2,2'-联吡啶]-4,4'–二甲磺酸根合(2-)-κn1,κn1'][1-[4-(4'-甲基[2,2'-联吡啶]-4-基-κn1,κn1')-1-氧代丁氧基]-2,5-吡咯烷二酮]-钠(1：2)，(oc-6-31)，进一步称为钌酸(2-)双[[2,2'-联吡啶]-4,4'-二甲磺酸根合(2-)-κn1,κn1'][1-[4-(4'-甲基[2,2'-联吡啶]-4-基-κn1,κn1')-1-氧代丁氧基]-2,5-吡咯烷二酮]-二钠，(oc-6-31)-(9cl))，和ir(6-苯基菲啶)2-吡啶-2-甲酸的反应性nhs酯或其衍生物，包括但不限于，例如，ir(6-苯基菲啶)2-3羟基吡啶-2-甲酸、ir(6-苯基菲啶)2-4-(羟甲基)吡啶-2-甲酸、ir(6-苯基菲啶)2-2-(羧乙基-苯基)吡啶-2-甲酸、ir(6-苯基菲啶)2-5-(甲氧基)吡啶-2-甲酸、或ir(6-苯基菲啶)2-2-(羧乙基-苯基)吡啶-2-甲酸酯，或其衍生物，如与被一个或多个磺酸取代的配体的铱配合物，或例如cas登记号1556730-07-4(=ib3/47，在本领域也被称为铱酸(3-)[5-[4-(2-羧基乙基)苯基]-2-吡啶羧酸根合(2-)-κn1,κo2]双[2-(6-菲啶基-κn)-5-(3-磺酸根合丙氧基)苯基-κc]-铯氢(1：2：1)或其n-羟基琥珀酰亚胺酯；或与两个苯基菲啶配体的铱配合物，其具有两个磺酸根合丙氧基取代基，两个磺基甲基，包括2,9-菲啶二甲磺酸，6-苯基-，钠盐(cas登记号1554465-50-7)，或具有两个聚乙二醇取代基，或具有每种三个，或它们的组合。方法ⅰ和ⅱ的方法步骤(a)在标准偶联条件下进行。适当的溶剂和适当的偶联试剂是本领域技术人员公知的。共价键合至用作方法ⅰ的方法步骤(b)中的起始材料的活化连接体的亲合力结合剂是本领域技术人员公知的。或者，它们可以通过使亲合力结合剂与可商购的杂双官能交联剂，例如与上述的任何杂双官能交联剂反应来制备。共价键合到活化的连接体的亲合力结合剂的实例包括但不限于下面的被分析物-活化连接体：睾酮-3-羧基甲肟-n-羟基琥珀酰亚胺酯，睾酮-3-二甲基-羧基甲肟-n-羟基琥珀酰亚胺酯，雌二醇-3-羧基甲基醚-n-羟基琥珀酰亚胺酯，睾酮-17-琥珀酸单-n-羟基琥珀酰亚胺酯，和。方法i和ii的方法步骤(b)和方法(c)的方法步骤(c)在标准偶联条件下进行。适当的溶剂和适当的偶联试剂是本领域技术人员公知的。适当的溶剂和适当的偶联试剂是本领域技术人员公知的。在实施方案中，制备式(i)的多官能化硅纳米颗粒的方法i包括至少以下步骤：其中n、x、y、z、l1、l2、si、m和亲合力结合剂如上所定义和r是h，(a)使式(ii)的端胺硅纳米颗粒与z个式(iii)的活化的连接体-ecl-金属配合物反应其中n、x、y、z和si如上所定义，其中，l1和m如上所定义，且lg1-co-是用于键合至氨基的反应性基团，优选lg1-co是琥珀酰亚胺基-o-co基团，如果适当的话在溶剂的存在下，并且如果适当的话在偶联剂的存在下进行，以得到式(iv)的官能化硅纳米颗粒其中n、y、si、l1和m如上所定义，和(b)使式(iv)的官能化硅纳米颗粒与x个式(v)的活化的连接体-亲合力结合剂反应其中l2和亲合力结合剂如上定义和lg2是用于键合至氨基的反应性基团，优选lg2-co是琥珀酰亚胺基-o-co基团，以获得如上定义的式(i)的多官能化硅纳米颗粒，其中r是h。在方法i中，lg1和lg2可以是相同的或不同的。用作方法步骤(a)中的起始材料的式(ii)的端胺的硅纳米颗粒可以通过如例如m.rosso-vasic,journalofmaterialschemistry(2009),19(33),5926-5933所述的方法来制备。或者，它们可以如wo2013/087734a2和y.zhong,journalofamericanchemicalsociety(2013),135,8350-8356中所述获得。用于制备式(ii)的端胺的硅纳米颗粒的合适的单体包括但不限于2-丙烯-1-胺、3-丁烯-1-胺、4-戊烯-1-胺、5-己烯-1-胺、6-庚烯-1-胺、7-辛烯-1-胺、8-壬烯-1-胺、9-癸烯-1-胺、10-十一碳烯-1-胺、11-十二碳烯-1-胺、17-十八碳烯-1-胺、2-(2-丙烯-1-基氧基)-乙胺、2-[-(2-丙烯-1-基氧基)乙氧基]-乙胺和4-乙烯基苯甲胺。用作方法步骤(a)中的起始材料的式(iii)的活化的连接体-ecl-金属配合物是本领域技术人员公知的。式(iii)的活化的连接体-ecl-金属配合物例如公开在通过引用全文并入本文的us2016/0146826a1、wo2014/019707a2、wo2014/019708a2、wo2014/019709a2、wo2014/019710a2和wo2014/019711a2中。方法步骤(a)在标准偶联条件下进行。适当的溶剂和适当的偶联试剂是本领域技术人员公知的。在一个优选实施方案中，n,n-二甲基甲酰胺(dmf)用作溶剂。实施例2和3示出了可以如何通过方法步骤(a)获得式(iv)的官能化硅纳米颗粒。式(iv)的官能化硅纳米颗粒是新的。因此，在一个方面，本发明涉及如上定义的式(iv)的官能化硅纳米颗粒。用作方法步骤(b)中的起始材料的式(v)的活化的连接体-亲合力结合剂是本领域技术人员公知的。或者，它们可以通过使如上定义的亲合力结合剂与市售的杂双官能交联剂，例如与上述的任何杂双官能交联剂反应制备。式(v)的活化的连接体-亲合力结合剂的实例包括但不限于上述被分析物-活化的连接体。方法步骤(b)也在标准偶联条件下进行。适当的溶剂和适当的偶联试剂是本领域技术人员公知的。在一个实施方案中，所述方法i进一步包括以下步骤(c)使如上定义的式(i)的多官能化硅纳米颗粒(其中r是h)与式(vi)的化合物反应，其中co-lg3是用于键合至氨基的反应性基团，优选lg3-co是琥珀酰亚胺基-o-co基团，和r''-co-是如上定义的l2、如上定义的失活l2或如上定义的表面修饰试剂，优选通过与nhs-pegn-ome表面修饰试剂反应产生，以得到式(i)的多官能化硅纳米颗粒，其中r是如上定义的l2、如上定义的失活l2或如上定义的表面修饰试剂的残基。用作方法步骤(c)的起始材料的式(vi)的化合物是本领域技术人员公知的。如上所指出的-在亲合力结合剂包含氨基的情况下，必须采用方法ii所述的方法。因此，在一个实施方案中，用于制备式(i)的多官能化硅纳米颗粒的方法ii包括至少以下步骤：其中n、x、y、z、l1、l2、si、m如前文所定义，所述亲合力结合剂如上文所定义并且包含氨基，和r是h、具有一个反应性基团的-co-l2、-co-失活l2，(a)使式(ii)的端胺的硅纳米颗粒与z个式(iii)的活化的连接体-ecl-金属配合物反应其中n、x、y、z和si如上所定义，其中，l1和m如上所定义，且lg1-co-是用于键合至氨基的反应性基团，优选lg1-co是琥珀酰亚胺基-o-co基团，如果适当的话在溶剂的存在下，并且如果适当的话在偶联剂的存在下进行，以得到式(iv)的官能化硅纳米颗粒其中n、x、y、z、si、l1和m如上所定义，(b)使式(iv)的官能化硅纳米颗粒与x个式(vii)的杂双官能化交联剂反应其中lg4是用于键合至氨基的反应性基团，优选lg4-co是琥珀酰亚胺基-o-co基团，且rg为适合键合例如至sh基团的反应性基团，如果适当的话在溶剂的存在下，并且如果适当的话在偶联剂的存在下进行，以得到式(viii)的官能化硅纳米颗粒其中n、x、y、z、l1、l2、si，m和rg如上所定义，(c)使根据方法步骤(b)得到的式(viii)的官能化硅纳米颗粒与包含例如巯基的亲合力结合剂，例如与蛋白质反应(如果适当的话在溶剂的存在下)以得到式(i)的多官能化硅纳米颗粒，其中n、x、y、z、l1、l2、si和m如上所定义，所述亲合力结合剂如上所定义并且包含氨基，且r为h、具有一个反应性基团的-co-l2、-co-失活l2。用作方法步骤(a)的起始材料的式(ii)的端胺的硅纳米颗粒可以通过如上所述的方法制备。用作方法步骤(a)的起始材料的式(iii)的活化的连接体-ecl-金属配合物如上所述。在一个实施方案中，方法ii进一步包括以下步骤(d)使如上定义的式(i)的多官能化硅纳米颗粒(其中r是h)与式(vi)的化合物反应：其中co-lg3是用于键合至氨基的反应性基团，优选lg3-co是琥珀酰亚胺基-o-co基团，和r''-co-是如上定义的l2、如上定义的失活l2或如上定义的表面修饰试剂，优选通过与nhs-pegn-ome表面修饰试剂反应产生，以得到式(i)的多官能化硅纳米颗粒，其中r是如上定义的l2、如上定义的失活l2或如上定义的表面修饰试剂的残基。方法步骤(a)、(b)、(c)和(d)也在标准偶联条件下进行。适当的溶剂和适当的偶联试剂是本领域技术人员公知的。本发明的多官能化硅纳米颗粒的用途本发明人现已令人惊讶地和出乎意料地发现，如上定义的多官能化硅纳米颗粒具有相当有利的性质。例如，多官能化硅纳米颗粒显示出高的ecl效率。与仅在有机溶剂中进行分析时显示高的ecl效率的许多ecl标记物相比，如果相应的测量在水性体系中进行，这种高效率也存在。例如，许多电化学发光分子通常在乙腈中分析，并且或者不溶于水溶液或者如果可溶，在水溶液中不显示有效电化学发光。此外，已经发现的是，可以调整多官能化硅纳米颗粒，以满足基于ecl的免疫测定的需要，因为可以根据测试形式的需要调节多官能化硅纳米颗粒的物理和化学性质。因此，在一个方面，本发明涉及如上定义的多官能化硅纳米颗粒在基于电化学发光的检测方法中的用途。在另一个方面，本发明涉及如上定义的多官能化硅纳米颗粒用于在水溶液中进行电化学发光反应的用途。水溶液是包含至少90重量％的水(重量/重量)的任何溶液。显然，这样的水溶液可以包含附加成分，如缓冲化合物、洗涤剂和例如叔胺如三丙胺作为ecl反应的电子供体，例如市售procell溶液。在另一个方面，本发明涉及如上定义的多官能化硅纳米颗粒在如本文定义的被分析物的体外检测中的用途。在另一个方面，本发明涉及包含如上定义的多官能化硅纳米颗粒的组合物。该组合物可用于检测样品中存在的目标被分析物。使用本发明的多官能化硅纳米颗粒测量被分析物的方法另一方面，本发明涉及一种通过体外方法测量被分析物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供怀疑或已知含有被分析物的样品，(b)使所述样品与如上定义的多官能化硅纳米颗粒在适于形成被分析物与多官能化硅纳米颗粒的复合物的条件下接触以获得被分析物-多官能化硅纳米颗粒复合物，和(c)测量在步骤(b)中形成的被分析物-多官能化硅纳米颗粒复合物，从而获得被分析物的量。另一方面，本发明涉及一种通过体外方法测量被分析物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供怀疑或已知含有被分析物的样品，(b)使所述样品与如上定义的多官能化硅纳米颗粒(其中所述纳米颗粒包含被分析物)与被分析物特异性亲合力结合剂在适于形成多官能化硅纳米颗粒和被分析物特异性亲合力结合剂的复合物的条件下接触以获得被分析物特异性亲合力结合剂-多官能化硅纳米颗粒复合物，和(c)测量在步骤(b)中形成的被分析物特异性亲合力结合剂-多官能化硅纳米颗粒复合物和从而获得被分析物的量。在一个实施方案中，测量被分析物指的是检测样品中的被分析物的量。在一个实施方案中，上述检测被分析物的方法中的测量通过使用基于电化学发光的检测程序进行。在一个优选的实施方案中，本发明的方法在水溶液中实施。使用如上定义的本发明的多官能化纳米颗粒测量被分析物的方法可根据现有技术程序实践。这样的方法可以本领域已知的各种形式构建，例如夹心测定和竞争性结合测定(参见，例如以下参考文献：nonradioactivelabelinganddetectionofmolecules,kessler,c.编辑,springer-verlag:berlin1992;theimmunoassayhandbook,wild,d.编辑,stacktonpress:newyork1994;keller,g.h.和manak,m.m.dnaprobes,第二版,macmillanpublishersltd.:london,1993;tietztextbookofclinicalchemistry，第二版,burtis等人编辑,w.b.saunders和co.:philadelphia,1994)。如本领域技术人员容易认识到，被分析物的测量通常通过产生信号、测量产生的信号、和由被分析物的标准曲线计算所述被分析物的浓度，即，从而测量所述被分析物进行。通常与标记物连接的测定组分，即如上定义的多官能化纳米颗粒包含被分析物特异性结合剂(夹心型测定)或所述被分析物(竞争型测定)。在测量多官能化纳米颗粒中包含的电化学发光标记物之前，通常将在这样的方法中结合至固相的如上定义的多官能化纳米颗粒与未结合至固相的多官能化纳米颗粒分离。在一个实施方案中，本发明的方法以夹心测定形式实施。在典型的夹心型测定中，结合至结合对的第二配偶体的被分析物特异性结合剂以及可检测地标记的被分析物特异性结合剂分别各自在不同的和非重叠表位结合至被分析物。第一被分析物特异性结合剂(例如抗体)共价地或被动地(passively)结合至固体表面。固体表面典型地是玻璃或聚合物，最常用的聚合物是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。所述固体载体可以是管、珠、微孔板的盘或适于进行免疫测定的任何其它表面的形式。结合方法是本领域中公知的，并且通常包括交联共价键合或物理吸附，在测试样品的制备中洗涤聚合物-抗体复合物。然后将待测试的等分样品添加到固相复合物中并培育足够的时间(例如2-40分钟或如果更方便的话，过夜)，并在合适的条件(例如，室温至40℃，例如25℃至32℃，包括端点)下进行，以允许所述第一或捕获抗体和相应的抗原之间的结合。在培育期后，可以洗涤包含第一或捕获抗体和与其结合的抗原的固相，并且与结合到抗原上的另一表位的第二或标记的抗体一起培育。所述第二抗体连接至用于指示所述第二抗体结合至第一抗体和目标抗原的复合物的报告分子。后者代表如本文所公开的多官能化硅纳米颗粒的一个具体实施方案。一种非常通用的替代夹心测定形式包括使用涂覆有结合对的第一配偶体的固相，例如顺磁性链霉亲和素涂布的微粒。将这样的微粒与结合到结合对的第二配偶体(怀疑包含或包含被分析物的样品)的被分析物特异性结合剂混合并培育，其中所述结合对的第二配偶体结合到所述被分析物特异性结合剂和被可检测地标记的第二被分析物特异性结合剂(例如本文公开的多官能化硅纳米颗粒)。对于本领域技术人员显而易见的是，将这些组分在适当的条件下培育足够的时间以将多官能化颗粒通过所述被分析物，(结合至)所述结合对的第二配偶体的被分析物特异性结合剂和所述结合对的第一配偶体结合至固相微粒。如果适当，这样的测定可包括一个或多个洗涤步骤。在典型的夹心型测定中，结合到结合对的第二配偶体的被分析物特异性结合剂和可检测地标记的被分析物特异性结合剂分别各自在不同的和非重叠表位结合至被分析物。在一个实施方案中，以竞争型测定形式实施本发明的方法。一种典型的竞争型测定形式使用可检测地标记的被分析物。包含被分析物作为亲合力结合剂的多官能化硅纳米颗粒代表根据本公开的一个实施方案。在一种竞争型测定形式中，包含在待分析的样品中的被分析物和可检测地标记的被分析物竞争结合至亲合力结合剂，例如至结合蛋白质、受体或抗体。如本领域技术人员认识到，可以使用被分析物本身并结合到硅纳米颗粒，然而，也可以在这样的程序中使用被分析物的类似物，例如被分析物的相关的物质或片段，只要亲合力结合剂结合至待研究的样品中的结合的被分析物类似物和游离被分析物二者。通常，亲合力结合剂直接或间接结合至固相。在结合-游离分离之后，通常分析结合的级分，并且将产生的信号间接正比于样品中的被分析物的浓度，即样品中的被分析物浓度越高，测量的信号越低。提供以下实施例以辅助理解本发明，本发明的真实范围在后附的权利要求中阐述。应当理解，可以在不背离本发明精神的情况下对阐述的程序做出修改。本文中引用的所有专利和出版物通过引用全文并入本文。实施例x射线光电子能谱(xps)、透射电子显微镜(tem)、动态光散射(dls)、zeta电位测量、uv-vis吸收测量、光致发光测量、ecl和计时电流测量使用标准的测量装置进行。实施例1：起始材料的合成1.1端胺的硅纳米颗粒的合成如m.rosso-vasic等人,small(2008),4(10),1835-1841中所述制备烷基官能化硅纳米颗粒。如j.h.warner等人,angewandtechemie(2005),117,4626-4630;m.rosso-vasic,journalofmaterialschemistry(2009),19(33),5926-5933;和y.zhong,journalofamericanchemicalsociety(2013),135,8350-8356中所述制备端胺的3-氨基丙基硅纳米颗粒。实施例2：制备和表征[ru]标记的硅纳米颗粒和其ecl性能2.1[ru]-标记的硅纳米颗粒的制备将rubpy-osu(cas登记号115239-59-3，57.6毫克，54.5微摩尔)在25毫升烧瓶中溶解在5毫升无水dmf中。将端胺的3-氨基丙基硅纳米颗粒(1.8ml，在h2o中，40毫克)缓慢加入到该溶液中。此后，将该反应混合物在氩气气氛下在室温下搅拌2天。然后，将该溶液浓缩至约2ml溶剂。通过相对水的渗析(mwco:1000)纯化粗产物6小时。每两小时更换水。其后，将渗析袋中剩余的溶液转移到分液漏斗中并用二氯甲烷洗涤，直至二氯甲烷层为无色。最后，浓缩水层，以得到13毫升(1.68毫克/毫升)si-[ru]纳米颗粒(si-[ru]nps)。2.2si-[ru]纳米颗粒的表征2.2.1x射线光电子能谱(xps)通过x射线光电子能谱表征si-[ru]纳米颗粒。通过xps测量确定si-[ru]nps的化学组成。如图1(a)中所示，si-[ru]纳米颗粒含有以下元素：c、n、o、p、ru、f和si(参见表1)。si2p的结合能为101.53ev并对应于si-c键。没有观察到痕量二氧化硅的形成(约104ev)。此外，如图1(d)中所示进行n扫描的去卷积并在表2中总结。n扫描的去卷积表明，si-[ru]纳米颗粒含有三种不同类型的氮：来自联吡啶钌的吡啶n、来自3-氨基丙基硅纳米颗粒的胺n、和来自端胺的3-氨基丙基硅纳米颗粒和钌配合物的偶联的酰胺n，其证明了钌配合物共价键合到3-氨基丙基硅纳米颗粒。表1.si-[ru]纳米颗粒的xps数据峰值，evfwhm，ev原子比％c1s284.802.9463.24n1s399.462.9310.93o1s531.223.1613.87p2p136.091.631.10ru3d5280.532.200.56f1s685.742.886.36si2p101.532.933.94表2.n扫描中的si-[ru]纳米颗粒的xps数据峰值，evfwhm，ev原子比％吡啶n398.501.9948.38胺n399.411.3443.619酰胺n400.051.078.432.2.2透射电子显微镜(tem)图像图2示出si-[ru]纳米颗粒的tem图像。图2表明，si-[ru]纳米颗粒的尺寸为约4纳米并具有结晶结构。2.2.3动态光散射(dls)和zeta电位动态光散射(dls)测量的结果显示si-[ru]纳米颗粒的流体力学半径为约51.7纳米，zeta电位为27.05毫伏。表3动态光散射和zeta电位si-[ru]nps流体力学半径51.7±13.3nmzeta电位27.05mv2.2.4光物理性质为了将si-[ru]纳米颗粒与标准rubpy比较，进行uv-vis吸收，以监测吸光度，这是达到相同的吸收必需的。由于缺乏硅纳米颗粒在400至500纳米范围内的吸收，当两个吸光度相等时可以直接拟合联吡啶钌的mlct吸收带，以具有与si-[ru]纳米颗粒和rubpy中的钌配合物相同的浓度。如图3(a)所示，在水溶液中以10-5m测量rubpy，在245、253和286纳米的吸收带归属于配体ππ*跃迁，在456纳米的吸收带归属于mlct带。si-[ru]纳米颗粒的吸光度被调节到等于在456纳米的rubpy(mlct带)以达到10-5m。在245、256、286和456纳米的吸收峰归属于rubpy并且低于250纳米的吸收强度增加是由于si纳米颗粒的存在。在10-5m下在水溶液中记录发射光谱并示于图3(b)中。rubpy和si-[ru]纳米颗粒都显示出相同的发射曲线，强度和峰值集中在630纳米。此外，rubpy和si-[ru]纳米颗粒的寿命相同，这表明在si-[ru]纳米颗粒中没有发射淬灭。rubpy和si-[ru]纳米颗粒都显示出发射量子产率3.5％。此外，为了检测ecl效率，如图4中所示，进行这两种化合物在procell溶液中在10-5m下的uv-vis吸收。光物理数据总结于表4中。表4sinps、si-[ru]纳米颗粒和rubpy在水溶液中的光物理数据a.λ激发=375纳米，b.λ发射=451纳米，c.λ发射=630纳米，d.使用积分球进行量子产率的测量。2.3电化学发光(ecl性能)图5(c)显示si-[ru]纳米颗粒的ecl发射具有与rubpy标准相同的曲线，但具有较低的强度。相比于rubpy(100％)，ecl效率为70％。此外，进行计时电流测量并计算ecl效率。在3个不同日期进行九个实验，每天3个实验。误差小于10％。相比于rubpy(100％)，在计时电流测量中的si-[ru]纳米颗粒的ecl效率是67％。全部ecl数据总结于表5中。表5si-[ru]纳米颗粒的ecl数据procellrubpysi-[ru]nps计时电流法1.000.67ecl发射光谱1.000.70rubpy用作参考(ecl效率=1.00)。对于计时电流测量，进行9个实验(每天3次和3个不同日期)，误差小于10％。2.4计算扩散系数为了研究si-[ru]纳米颗粒的低ecl效率，通过在不同的扫描速率下的循环伏安法计算扩散系数。这些循环伏安法的结果显示在图6(a)和6(c)中。此外，图6(b)和6(d)表明，该电流正比于扫描速率的根，这表明传质行为是扩散控制的和并遵循randles-sevcik方程，其允许计算扩散系数。结果总结于表6中。相比于rubpy，si-[ru]纳米颗粒的这种较低的扩散系数导致较低的ecl效率。所有数据总结于表6中。表6rubpy和si-[ru]纳米颗粒的ecl效率和扩散系数的比较procellrubpysi-[ru]nps计时电流法1.000.67ecl发射光谱1.000.70扩散系数(cm2/s)1.11×10-69.43×10-7实施例3：制备和表征[ir]标记的硅纳米颗粒及其ecl性能3.1[ir]标记的硅纳米颗粒的制备将ir配合物(52.9毫克，54.5微摩尔)(cas登记号1393128-57-8)、edc(16.9毫克，0.109毫摩尔)和nhs(12.5毫克，0.109毫摩尔)在25毫升烧瓶中溶解在7毫升无水dmf中，并在室温下在ar气氛下搅拌1小时。此后，将端胺的3-氨基丙基硅纳米颗粒(1.8ml，在h2o中，40mg)和二异丙基乙胺(10μl)缓慢加入到该溶液中，并将该反应物在室温下在氩气气氛下搅拌2天。然后在真空下除去溶剂。将粗产物用水和二氯甲烷洗涤以除去未反应的ir配合物和未反应的端胺的3-氨基丙基硅纳米颗粒。将产物分散在15mldmf中，以得到4.12毫克/毫升si-[ir]nps。3.2si-[ir]纳米颗粒的表征3.2.1x射线光电子能谱(xps)通过x射线光电子能谱表征si-[ir]nps。通过xps测量确定si-[ir]nps的化学组成。如图7(a)中所示，si-[ir]纳米颗粒含有以下元素：c、n、o、ir和si(参照表7)。si2p的结合能为102.00ev并对应于si-c键。确定没有痕量的二氧化硅的形成(约104ev)。此外，如图7(d)中所示进行n扫描的去卷积并总结在表7中。n扫描的去卷积表明si-[ir]纳米颗粒包含四种不同类型的氮：来自rubpy的吡啶氮、来自端胺的3-氨基丙基硅纳米颗粒的胺n和铵n，和来自端胺的3-氨基丙基硅纳米颗粒与铱配合物的偶联的酰胺n，这证明所述铱配合物共价键合到硅纳米颗粒。表7si-[ir]纳米颗粒的xps数据峰值，evfwhm，ev原子比％c1s284.802.7976.47o1s531.843.0711.17n1s399.973.187.30si2p102.002.631.96ir4f62.062.851.12表8n扫描中的si-[ir]纳米颗粒的xps数据峰值，evfwhm，ev原子比％吡啶n398.940.8110.14胺n399.791.0762.9酰胺n400.660.693.73铵n401.791.3723.233.2.2透射电子显微镜(tem)图像图8示出si-[ir]纳米颗粒的tem图像。图8表明，si-[ir]纳米颗粒的尺寸为约4纳米并具有结晶结构。3.2.3光物理性质为了将si-[ir]纳米颗粒与ir配合物相比，进行uv-vis吸收，以监测吸光度，这是达到与ir配合物相同的吸收所必需的。由于缺乏sinps在400至500纳米的范围内的吸收，当两个吸光度相等时，可以直接拟合ir配合物的mlct吸收带，以具有与si-[ir]nps和ir配合物中的ir配合物相同的浓度。如图9中所示，在dmf溶液中以10-5m测量ir配合物，在288、350、358和380纳米的吸收带归属于配体ππ*跃迁，在430和468纳米的吸收带归属于mlct带。si-[ir]nps的吸光度被调节到等于在mlct带的ir配合物以达到10-5m。在288、350、358、430和468纳米的吸收峰归属于ir配合物。此外，为了检测ecl效率，如图10中所示，进行这两种化合物在procell溶液中在10-5m下的uv-vis吸收。3.3电化学发光(ecl)性能图11(c)表示si-[ir]nps的ecl发射具有与ir配合物相同的曲线，但具有较低的强度。相比于rubpy(100％)，ecl效率为28％。也进行计时电流测量并计算ecl效率。在3个不同日期进行九个实验，每天3个实验。误差小于10％。相比于rubpy(100％)，si-[ir]nps在计时电流测量中的ecl效率是31％。所有ecl数据总结于表9中。表9si-[ir]nps的ecl数据procellrubpyirsi-[ir]nps计时电流法1.001.320.31ecl发射光谱1.001.770.28rubpy用作参考(ecl效率=1.00)。对于计时电流方法，进行9个实验(每天3次和3个不同日期)，误差小于10％。3.4计算扩散系数由于ecl仅在电极表面上产生，重要的是被分析物至电极表面的质量扩散速率。为了研究si-[ir]nps的较低ecl效率，如图12(a)中所示，通过在不同扫描速率下的循环伏安法计算扩散系数。在图12(b)中，电流正比于扫描速率的根，表示传质行为是扩散控制的并遵循randles–sevcik方程，其允许扩散系数的计算并总结于表10中。si-[ir]nps的较低ecl效率是由于在均匀条件下3.21x10-7cm2s-1的较慢扩散系数。所有的数据总结于表10中。表10rubpy和si-[ir]nps的ecl效率和扩散系数的的比较procellrubpysi-[ir]nps计时电流法1.000.31ecl发射光谱1.000.28扩散系数(cm2/s)1.11x10-63.21x10-7实施例4：[ru]-标记的硅纳米颗粒的官能化4.1杂双官能连接体与[ru]-标记的硅纳米颗粒的反应将用60个钌配合物官能化的si-np(r1)(1.68毫克，在1ml溶液中)和3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-丙酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(r2)在10ml烧瓶中混合。将该反应物在室温下搅拌过夜。然后，将红色溶液通过渗析使用1kda膜纯化以除去过量的r2。渗析2天后，将红色溶液冻干，以得到红色固体。将红色固体再悬浮在2毫升水中，并过滤该悬浮液以除去不溶性残余物。收率：2ml的最终溶液：橙色溶液通过uv(λ最大：456，ε：14600)测得的ru在溶液中的平均浓度：0.52浓度：3.510-05m的钌配合物。4.2用杂双官能连接体官能化的[ru]-标记的硅纳米颗粒与抗体的缀合如us7,521,541中所述进行该缀合程序。通过使用工程半胱氨酸的位点特异性缀合将用钌配合物官能化的马来酰亚胺官能化的硅纳米颗粒与来自mab<tn-t>chim-5d8-igg的fab片段缀合(thiomab技术)，并通过凝胶过滤纯化(superdex200)。4.3修饰的被分析物与[ru]-标记的硅纳米颗粒的反应将用60个钌配合物官能化的si-np(r1)(1.68毫克，在1ml溶液中)和睾酮-3-羧基甲肟-nhs酯在10ml烧瓶中混合。将该混合物在室温下搅拌过夜。然后，将红色溶液通过渗析使用1kda膜纯化以除去过量的r2。渗析2天后，将红色溶液冻干，以得到红色固体。将红色固体再悬浮在2毫升水中，并过滤该悬浮液，以除去不溶性残余物。当前第1页12