一种新型固态亚纳米孔的制备及其在蛋白质测序中的应用

本发明属于蛋白质测序领域，具体公开了一种新型固态亚纳米孔的制备及其在蛋白质测序中的应用。

背景技术：

1、自1962年诺贝尔生理学或医学奖授予了三位揭示了核酸结构与功能的科学家后，人们对基因测序相关技术的兴趣与需求不断增强。最早的dna测序技术突破取得于1975-1977年间的桑格法(sanger’schain-termination method)，是一种“合成测序”，但这种方法即便后续实现了自动化改进，但仍低效、昂贵，且依赖样本扩增技术以及读长过短(500-800bp)。从1996年开始，科研实验室率先探索采用一种完全不同的测序方法：利用电泳驱动rna或dna单链穿过生物纳米孔(j.kasianowicz等人1996，proc.natl.acad.sci.usa93:13770-13773；a.meller等人2001，physical review letter86:3435-3438)，并在此技术的基础上逐渐开发出了第三代dna测序技术-纳米孔单分子测序技术，并快速成为市场主流(minion,oxford nanopore technologies inc.,2014；c.ip等人2015，f1000 research4:1075)。得益于纳米孔基因测序技术的长读长优势(30-100kbp)，2022年4月“端粒到端粒联盟”宣布完整人类基因组首次无间隙地被破译出来(s.nurk等人2022，science 376:44-53)。在有效破译了此前人类基因组计划(the human genome project)留下的、主要由高度重复和复杂的dna片段组成的约8％(2亿碱基对)的空隙后，纳米孔单分子测序技术已经开始向蛋白质组学进军(c.dekker等人2018，nature nanotechnology13:786-796)。

2、目前，已知的适合开展基因测序的生物纳米孔收缩区的孔径大小约为1.5纳米，与组成核酸单元的核苷酸单体的横截面大小相仿，测序效果好。蛋白质测序的本质是读取蛋白质的一级结构，也就是说测量肽链上的氨基酸排列顺序。但组成肽链单元的氨基酸的体积仅约为核苷酸的十分之一，因此原有的纳米孔将不可避免地因为孔径过大而在蛋白质测序时丢失信噪比，从而难以复制其在基因测序中的成功。此外，从结构上看，绝大部分纳米孔的感应区深度都在2-5纳米或更长，以至于每采集一个电信号都是由核酸链在孔内跨膜易位时相邻多个核苷酸综合作用的结果，这在dna测序中可以通过动态规整算法来破译，但在蛋白质测序中这个难度将以指数级增长，因为组成核酸的碱基只有4种，但蛋白氨基酸却有20种之多。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明公开了一种新型固态亚纳米孔的制备及其在蛋白质测序中的应用。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种新型固态亚纳米孔的制备方法，包括以下步骤：

4、1)将5nm厚的纯硅薄膜窗口放入扫描透射电子显微镜中；

5、2)设置加速电压300kv，束光栏孔径为70μm，通过调整光束强度，降低放大倍数可看到光束穿过薄膜；

6、3)将放大倍数调整到sa34000x，通过调整zheight以消除聚焦光束时产生的光晕；

7、4)点击eucentricfocus，切换到stem模式，关闭diffraction，打开beamshift，调整multifunctionx、y将光束移到中心，调节defocus使光束聚集到一个小的点上；

8、5)点击done，打开diffraction，点击search，通过调整zheight使光束聚焦于薄膜表面；

9、6)关闭search，点击blank挡住光束并关闭柱阀，等待20min，使样品薄膜稳定；

10、7)击search开始预览，将放大倍数调整到320kx，进一步调整zheight使光束聚焦于薄膜表面，停止预览，此时电子束汇聚到薄膜上的一点开始钻孔；斑点尺寸为6，电流为0.429-0.51na，钻孔时间24-30s；

11、8)切换到tem模式下，利用透射电子显微镜的高分辨率成像功能获得一张固态亚纳米孔的照片，测量其孔径大小。

12、进一步的，上述新型固态亚纳米孔的制备方法，还包括验证步骤，所述验证步骤如下：

13、a)利用dr.probe多层图像仿真软件对亚纳米孔的tem图像进行模拟；

14、b)确定透射电镜成像与多层图像仿真图像高度相似后，在原子尺度上三维重建孔的空间结构。

15、进一步的，上述新型固态亚纳米孔的制备方法，所述步骤a)具体包括以下步骤：

16、一.仿真程序从创建一个原子模型开始，首先在一个5×5×5nm3(x–y–z)的正方体中随机填充合理数量的硅原子，创建一个无定形纯硅薄膜的局部模块,原子间隙小于0.2nm的个别原子被从结构中移除；原子被有选择地从由以下数学模型定义的边界内的体积中提取：

17、

18、其中a＝a0+tan(α)|z-2.5|，b＝b0+tan(α)|z-2.5|，x、y和z表示每个原子的坐标；α是锥角，单位°，a/b是椭圆的主/次轴长度，a0/b0为纳米孔腰部横截面的主/次轴长度，单位nm，c是偏心率；

19、二.利用多层切片算法对亚纳米孔的结构模型进行tem图像仿真模拟，使用dr.probe命令行工具中的celslc程序创建物体结构的相位光栅，将该模型沿z方向划分为40个等距切片，在x和y方向具有512×512像素的网格上计算300kv入射电子的切片相位光栅，使用吸收形式因子和德拜沃勒因子来说明原子的热运动；

20、三.电子衍射的计算，使用msa程序计算出口面波函数，最后利用wavimg程序从出口面的波函数中计算出高分辨率的tem图像。

21、进一步的，上述一种新型固态亚纳米孔的制备方法，所述步骤b)具体包括以下步骤：

22、将亚纳米孔的关键几何参数代入到有限元多物理场的建模中，模拟了孔内的电场分布，其中沿z轴方向的场强曲线的半高全宽被用来揭示感应区深度，最后计算亚纳米孔的电导率，电流计算公式为：

23、

24、其中n为离子数量，f为法拉第常数，ni为离子通量，zi为离子化合价，ds表示离子通过截面的面积，通过对该截面上的离子通量进行积分，求得电流i；

25、进一步的，上述一种新型固态亚纳米孔的制备方法，步骤1)中的纯硅薄膜窗口型号为us100-a05q00。

26、进一步的，上述一种新型固态亚纳米孔的制备方法，步骤1)中的扫描透射电子显微镜的型号为fei titan 80-300。

27、进一步的，一种新型固态亚纳米孔，由上述方法制备获得，孔径大小为0.3-0.7nm。

28、进一步的，上述新型固态亚纳米孔在蛋白质测序中的应用，所述测序为蛋白质单分子从头测序。

29、进一步的，上述新型固态亚纳米孔在蛋白质测序中的应用，包括以下步骤：

30、i.将含有一个孔径约为0.3-0.7nm的新型固态亚纳米孔的纯硅芯片嵌入到一个多端口微流控装置中，它允许两个ag/agcl电极独立地进入薄膜两侧的顺式侧和反式侧；

31、ii.为了测量离子电流，将亚纳米孔浸在0.25m氯化钠中，施加600mv的跨膜电压，并通过亚纳米孔形成开孔电流i0；

32、iii.在将变性蛋白(的表面均匀附着表面活性剂阴离子后，添加到微流控设备的待测区域，随后观察到与单分子跨膜易位相关的剩余电流ib；使用膜片钳放大器multiclamp700b配合数模转换器axon digidata 1550b实现对于离子电流的高精度记录，且bypass低通滤波提高带宽；

33、iv.在进行事件选取前，首先使用贝塞尔滤波器对原始数据进行20khz的低通滤波处理，相较于变化平缓的开孔电流，有许多持续时间不等的阻塞电流出现，一一对应每个蛋白质单分子的跨膜易位事件；通过调用open nanopore软件，从原始电流信号中提取蛋白质单分子的跨膜易位事件：

34、v.完成事件提取后，通过对由阻塞电流持续时间与电流阻塞比构成的特征热图进行分析后选取典型事件构成后续处理的数据集；

35、vi.使用机器学习算法判断无标记的蛋白质单分子通过纳米孔进行跨膜易位方向性，判断其n端先进还是c端先进；

36、vii.统一易位事件方向性后，对所有典型事件求均值得到共识电流序列consensus，其中的波动模式与构成该蛋白质一级结构的氨基酸的体积模型kmer＝1高度线性相关，即皮尔逊相关系数，pcc>0.6。

37、本发明具有以下有益效果：

38、本发明在目前可从市场上获得的最薄无机薄膜上加工亚纳米孔，并进一步验证其在蛋白质单分子测序技术上的应用前景。由于纯硅薄膜在与空气或水接触后，其表面会发生一定程度的氧化，形成一层氧化硅薄膜，而氧化硅表面的羟基令其具有亲水性，能够促进蛋白质单分子在孔内的滑动，相较于其它材料，例如疏水的氮化硅，这一优点有助于提高后续测序实验数据采集的通量。如图1(a-h)所示，本发明的技术方案具体为：在5nm厚的纯硅薄膜上简单可靠地加工出直径小于1nm的孔，并通过透射电镜成像与多层图像仿真对比，在原子尺度上三维重建孔的空间结构，再将关键的几何参数代入到有限元多物理场的建模中，模拟孔内的电场分布，计算亚纳米孔的电导率，从而评估这种制备方法在蛋白质单分子测序中的应用潜力与性能。

39、目前广泛应用于dna单分子测序中的生物纳米孔感应区(收缩区)深度普遍在2-5nm，而在相似的扫描透射电镜电子束溅射加工条件下，在传统的10-30nm厚无机薄膜上加工出的固态纳米孔的感应区深度约为1.5-2nm或更高。因此，在对蛋白质测序过程中，通过这些纳米孔所采集到的每个离子电流数据点是由任意一段肽链中相邻的4个或更多的氨基酸综合作用所产生的。然而本发明的这种新型纳米孔的感应区深度可低于1nm，说明它在开发具有单点残基特异性(kmer＝1)的蛋白质从头测序技术中比其他同类型的纳米孔更具优势，为蛋白质变体的单位点残基特异性检测提供了新的思路。