一种家蚕血液免疫黑化中PO和DDC作用差异研究方法

本发明涉及家蚕血液免疫黑化研究，具体为一种家蚕血液免疫黑化中po和ddc作用差异研究方法。

背景技术：

1、桑蚕又称家蚕，简称蚕，是以桑叶为食料的吐丝结茧的经济昆虫之一。桑蚕属鳞翅目，蚕蛾科，学名为bombyx mori linnaeus。桑蚕起源于中国，由古代栖息于桑树的原始蚕驯化而来，与中国现今食害桑树的野桑蚕同源，染色体都是28对。

2、血液黑色素化作为昆虫体液免疫的一个重要组成部分，在昆虫防御各种病原物侵染中占据着极其重要的位置，是家蚕抵御细菌、真菌以及病毒的重要手段，但是目前，鲜有研究对家蚕面对各种病原物所产生的黑色素化程度进行一个系统的分类，因此本发明提供一种家蚕血液免疫黑化中po和ddc作用差异研究方法来研究酚氧化酶与多巴脱羧酶在血液免疫黑化中功能的共通之处与不同之处。

技术实现思路

1、(一)技术方案

2、本发明提供如下技术方案：一种家蚕血液免疫黑化中po和ddc作用差异研究方法，包括以下步骤：

3、s1、病原体选择

4、s101、配置试剂

5、用分析天平称取nacl 8g、kcl 0.2g、na2hpo41.44g、kh2po40.24g

6、，将药品倒入锥形瓶中，加入800mlddh2o，搅拌均匀直至完全溶解，使用盐酸或氢氧化钠调节溶液的ph值至7.4，然后用容量瓶定容至1000ml，放高压灭菌锅灭菌后放4℃备用，用分析天平称取1mg左旋多巴样品，用1ml灭菌水稀释为1mg/ml制成母液备用，放4℃备用，用分析天平称取1mglps样品，用1ml灭菌水稀释为1mg/ml制成母液备用，放4℃备用，将无水乙醇与depc水按75：25的比例用移液器加入至rnase free离心管中，于-20℃存放备用，配制出lb液体培养基与lb固体培养基进行备用，称取氯化钠0.54g，柠檬酸一水0.43g，氢氧化钠0.20g，edta0.25g，调节ph至4.5，加ddh2o定容至50ml，转入瓶中高压灭菌后4℃保存备用；

7、s102、病原物的处理与侵染

8、取出冻存的菌液加入新鲜加入600ullb液体培养基，37℃、220rpm活化12h，取200ul活化后的菌液加入20mllb液体培养基中过夜培养，将过夜培养的原始菌液进行1到1000倍的梯度稀释后取100ul涂布于lb无抗平板，37℃倒置培养12h后选择菌落数在30-300之间的平板进行计数，按照公式：原始菌液浓度＝菌落数×稀释倍数×10cfu/ml计算原始菌液浓度为1.24×109cfu/ml，使用前离心收集菌体，用pbs重悬为2×108cfu/ml，4℃保存备用，注射时每头蚕注入5ul，合1x106cfu/头，参照大肠杆菌，最终得到原始菌液浓度为6.5×107cfu/ml，使用前离心收集菌体，用pbs重悬为2×108cfu/ml，4℃保存备用，注射时每头蚕注入5ul，合1×106cfu/头，刮取生长适龄期的白僵菌孢子于0.05％吐温-80中，菌悬液用四层灭菌后的擦镜纸过滤，将其中较大的菌丝除去，利用血细胞计数板进行孢子计数，计算孢子悬液浓度为8.2×107孢子/ml，进一步用0.05％吐温-80稀释至1×107孢子/ml，注射时每头蚕注入5ul，即5×104孢子/头，用磁珠振荡破坏培养的金黄色葡萄球菌液，然后在4℃下以800g离心10分钟获得上清液，在通过在4℃下以13000g离心10分钟，从培养的上清液中获得沉淀，然后用0.5％sds轻轻重悬沉淀，在60℃中孵育30分钟，并在室温下以13000g离心10分钟，用ddh2o洗涤收集的沉淀以去除sds，然后将沉淀用含有10mmcacl2的1mtris-hcl重悬，用于胰蛋白酶处理，在37℃下孵育12小时，孵育后，通过以13000g离心10分钟收集沉淀，然后用含有1mnacl的1mtris-hcl洗涤，然后用ddh2o洗涤三次，残留物用浓盐酸在37℃下处理12小时，然后通过13000g离心10分钟收集不溶性lys型pg，残留物再次用ddh2o洗涤5次，最后放-20℃保存，随机挑选生长发育状况基本相同的5龄3天d9l品系家蚕90头，分组进行病原物侵染，用微量注射器吸取制备好的待注射液5ul，采用气孔注射法从家蚕的气孔注入家蚕体内，注射前需要用75％的酒精给注射器消毒，并用无菌水润洗干净；

9、s103、家蚕基因提取

10、用取血针扎穿实验用蚕的第一对腹足,并将血液收集至装有等量抗凝血剂的rnase free离心管中备用，取出待测血浆，加入600μl裂解液，试剂剧烈震荡15min后，4℃静置30min，于12000rpm，4℃离心15min，将上清转入新的1.5mlrnasefree离心管内，加入200-250μl提前预冷的氯仿，剧烈震荡1min，4℃静置15min，于12000rpm，4℃离心15min，将上清吸入新的1.5mlrnasefree离心管内，加入与吸取上清液等量的提前预冷的异丙醇，颠倒混匀5-6次，-20℃静置30min，12000rpm，4℃离心20min，弃上清后，加入1ml预冷过的75％乙醇悬浮沉淀，涡旋振荡1min，12000rpm，4℃离心15min，弃上清，重复上述操作一次，弃上清后，倒置晾干，加入50μl的depc水溶解沉淀，进行琼脂糖凝胶电泳检测rna质量，紫外分光光度计测定rna浓度；

11、s104、家蚕cdna链合成

12、使用pcr仪进行配制反转录体系，使用琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物是否具有bmactin3基因条带；

13、s105、定量pcr分析

14、根据定量引物设计原则设计出bmpla2-s4基因序列的引物，在家蚕基因组数据库中检验引物的特异性，选择具有高度特异性的引物送公司合成，qpcr反应以家蚕bmactin3基因为内参；

15、s106、ppo酶活性测定

16、量取50μl待测血液，加入3mlpbs缓冲液与0.01mol/l的l-3，4-二羟基苯丙氨酸，混合均匀，用酶标仪在490nm波长下，测定1min内吸光度的增大值，6次重复，酶活力单位用u表示，1u＝a490/50μl/min；

17、s2、抑制酶活性对家蚕血液免疫黑化的效果分析

18、s201、配置试剂

19、按步骤s101中的方法配制出pbs缓冲液、左旋多巴溶液、无水乙醇以及抗凝血缓冲液，用分析天平称取0.0022g卡比多巴样品，用1ml灭菌水稀释为10mm制成母液备用，放4℃备用，用分析天平称取0.0016g苯基硫脲样品，用1ml灭菌水稀释为10mm制成母液备用，放4℃备用，用分析天平称取0.001g苯基硫脲样品，用1ml灭菌水稀释为1mg/ml制成母液备用，放-20℃备用，用分析天平称取kh2po4:2.72g，将药品倒入锥形瓶中，加入800mlddh2o，搅拌均匀直至完全溶解，使用盐酸或氢氧化钠调节溶液的ph值至4.5，然后用容量瓶定容至1000ml，放高压灭菌锅灭菌后放4℃备用，称取氯化钠0.54g，柠檬酸一水0.43g，氢氧化钠0.20g，edta0.25g，苯基硫脲0.0821g，调节ph至4.5，加ddh2o定容至50ml，转入瓶中高压灭菌后4℃保存备用；

20、s202、病原物的侵染与抑制剂的注射

21、根据步骤s102，对大肠杆菌进行处理，随机挑选生长发育状况基本相同的5龄3天d9l品系家蚕90头，分组进行病原物侵染，用微量注射器吸取制备好的待注射液5ul，采用气孔注射法从家蚕的气孔注入家蚕体内，注射前需要用75％的酒精给注射器消毒，并用无菌水润洗干净，在注射大肠杆菌后5.5h后,分别注射稀释后的卡比多巴溶液、苯基硫脲溶液以及pbs；

22、s203、酚氧化酶与多巴脱羧酶酶活性的检测

23、量取50μl待测血淋巴，加入3mlpbs缓冲液与0.01mol/l的l-3，4-二羟基苯丙氨酸，混合均匀，用酶标仪在490nm波长下，测定1min内吸光度的增大值，6次重复，酶活力单位用u表示，1u＝a490/50μl/min，称取1mg样本，用甲醇配成1mg/ml的母液备用，随后用超纯水分别稀释为0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml，将配置的标品超声20min，过0.22μm滤膜，hplc上机检测，检测器为dad紫外检测器，高效液相色谱仪配备hypersiltmods c18色谱柱和dad紫外检测器，检测条件：流动相100％甲醇︰1‰hac溶液＝20︰80，流速1ml/min，柱温30℃，上样量10μl，检测波长为280nm，吸取适量已收集的待测家蚕血淋巴于离心管中，加入适量苯基硫脲溶巴溶液，于37℃恒温培养箱里孵育30分钟，随后煮沸2分钟，加入氯仿后涡旋充分混匀，于12000rpm，4℃离心10min，取上清液过0.22μm滤膜，于hplc上机检测；

24、s204、表型观察

25、每种试剂注射10头5l3d的家蚕,在注射大肠杆菌5.5h后注射相应试剂，然后于0.5h后取家蚕血液，吸取各组等量已收集的待测家蚕血淋巴于离心管中，于37℃恒温培养箱静置孵育0.5h、1h、2h、3h、6h、9h、12h、24h，拍照取样，每种试剂注射10头5l3d的家蚕,在注射大肠杆菌5.5h后注射相应试剂，然后于0.5h后取家蚕血液，用正视显微镜看血细胞形态表征；

26、s205、定量pcr分析

27、根据步骤s103，提取rna，随后根据步骤s104对家蚕的cdna链进行合成，并根据步骤s105进行定量pcr分析，实用2-δδct法处理分析数据，计算基因间的相对表达水平；

28、s206、测定实验

29、吸取200μl待测血淋巴，用酶标仪在490nm波长下，测定吸光度，3次重复，测定黑色素含量，取5龄3天的家蚕血液并相应加入e.coli与pbs、ptu和carbidopa，于室温下孵育3h后涂无抗固体培养基，过夜培养15h计数拍照，取家蚕5l3d血液，离心提取血细胞并放于grace培养基内保存，并相应加入ni-nta琼脂糖珠与pbs、carbidopa溶液以及多巴胺溶液，于室温下加入大肠杆菌菌液孵育2h后于荧光倒置显微镜下观察血细胞包封情况，取家蚕5l3d血液，离心提取血细胞并放于grace培养基内保存，并相应加入e.coli与pbs、ptu和carbidopa，于室温下孵育3h后于荧光倒置显微镜下观察血细胞吞噬情况并计数。

30、优选的，所述步骤s101中，lb液体培养基包括胰蛋白胨2g、酵母粉1g、nacl2g、ddh2o200ml，lb固体培养基包括胰蛋白胨1g、酵母粉0.5g、nacl1g、琼脂粉1g、ddh2o100ml。

31、优选的，所述步骤s104中，配制反转录体系包括总rna 2-5μl、olig(dt)2μl、5x m-mlv buffer 5μl、super m-mlv 0.5μl、dntps 3μl、rnase free h2o 25μl，且pcr仪设置反转录程序为42℃，2h以及70℃，5min，10℃保存。

32、优选的，所述步骤s104中，以家蚕bmactin3基因作为内参pcr检测体系包括cdna模板1μl、2x taq master mix 7.5μl、正向引物0.7μl、反向引物0.7μl以及ddh2o 15μl，其pcr反应程序为，94℃、4min，94℃、40s，55℃、50s，循环28次，72℃、50s，72℃、10min，10℃、∞。

33、(二)有益效果

34、与现有技术相比，本发明提供了一种家蚕血液免疫黑化中po和ddc作用差异研究方法，具备以下有益效果：

35、该家蚕血液免疫黑化中po和ddc作用差异研究方法，通过各种病原物以及病原物的模式识别分子(pamp)对家蚕进行侵染，利用酶标仪估量不同病原物所造成家蚕的黑色素化程度，并利用qpcr评估个别常见病原物模式识别分子对黑化关键酶的影响，从而出确定所使用的病原物，为了了解酚氧化酶与多巴脱羧酶的蛋白酶活性对于血液黑化的影响，分别用两种酶的特异性抑制剂来对家蚕进行注射并研究，进而对比出po和ddc家蚕血液免疫黑化中的影响作用。