一种健胃消食片及其入血成分的检测方法、健胃消食片的质量标准、靶点分析方法及应用与流程

本发明属于药物成分分析，涉及一种健胃消食片及其入血成分的检测方法、健胃消食片的质量标准、靶点分析方法及应用。

背景技术：

1、功能性消化不良(functional dyspepsia，fd)是以餐后饱胀不适、早饱感、上腹痛或上腹烧灼感等为主要临床表现，但经全面检查并未发现消化系统器质性病变的一种常见的功能性胃肠病。功能性消化不良的发病率高、反复发作且难以治愈，严重降低患者的生活质量，给患者带来沉重的负担。目前用于治疗功能性消化不良的主要药物包括促胃肠动力药物、抑酸剂、抗抑郁药和抗幽门螺杆菌药物等。此外，中药在治疗功能性消化不良方面也具有重要作用。

2、中药具有多成分、多靶点、副作用小的特点，与西药相比具有独特的优势。然而目前中药普遍面临着“成分不清，作用机制不明”的难题。近年来，超高效液相色谱-质谱联用技术(uplc-ms)的出现和兴起为中药复杂成分的分析提供了强有力的工具。uplc-ms极高的分辨率、优异的灵敏度和强大的色谱分离能力可以高质量地完成复杂基质中痕量成分的定性分析，被广泛应用于中药的物质基础研究中。

3、健胃消食片主要由太子参(radix pseudostellariae)、陈皮(pericarpium citrireticulatae)、山药(rhizoma dioscoreae)、炒麦芽(fired hordei fructus germinatus)和山楂(crataegi fructus)组成，是一种用于治疗功能性消化不良的常用药物，具有良好的治疗效果，但其物质基础和作用机制均尚不明确。

4、然而，现有技术均未能实现健胃消食片的超高效液相色谱-质谱联用分析，并提供健胃消食片及其入血成分和潜在作用机制的研究方法。

技术实现思路

1、有鉴于此，针对有技术均未能实现健胃消食片的超高效液相色谱-质谱联用分析，并提供健胃消食片及其入血成分和潜在作用机制的研究方法的问题，本发明的目的是提供一种健胃消食片及其入血成分的检测方法、健胃消食片的质量标准、靶点分析方法及应用。

2、为实现上述发明目的，一方面，本发明提供一种健胃消食片的检测方法，包括以下步骤：

3、s1、提取：将待测样品、太子参、陈皮、山药、炒麦芽和山楂分别与溶剂混合，提取，分别得待测样品提取液、太子参提取液、陈皮提取液、山药提取液、炒麦芽提取液和山楂提取液；

4、s2、超高效液相色谱-质谱分析：将步骤s1得到的待测样品提取液、太子参提取液、陈皮提取液、山药提取液、炒麦芽提取液和山楂提取液分别进行超高效液相色谱-质谱分析，依次分别得到数据1、数据2、数据3、数据4、数据5和数据6；

5、s3、建立专属性本地成分数据库：检索太子参、陈皮、山药、炒麦芽和山楂中含有的成分及其分子式、单同位素质量数和质谱二级碎片信息，建立专属性本地成分数据库；

6、s4、获得潜在成分列表：将步骤s2得到的数据2、数据3、数据4、数据5和数据6与步骤s3得到的专属性本地成分数据库进行数据匹配，获得潜在成分列表；

7、s5、数据分析核对：依据步骤s4得到的潜在成分列表，调取步骤s2得到的数据1进行数据分析核对。

8、优选地，步骤s1中，所述待测样品为健胃消食片。

9、优选地，步骤s1中，所述待测样品、太子参、陈皮、山药、炒麦芽和山楂的形态为粉末。

10、优选地，步骤s1中，所述溶剂为甲醇、乙醇、丙酮中的至少一种。

11、更优选地，且作为本发明的实例，步骤s1中，所述溶剂为甲醇。

12、优选地，步骤s1中，所述待测样品、太子参、陈皮、山药、炒麦芽和山楂分别与溶剂混合具体如下：

13、将待测样品粉末0.5mg、太子参粉末0.5mg、陈皮粉末0.5mg、山药粉末0.5mg、炒麦芽粉末0.5mg、山楂粉末0.5mg分别与2ml甲醇混匀。

14、优选地，步骤s1中，所述提取包括浸泡、超声提取、离心取上清液、过滤。

15、更优选地，且作为本发明的实例，步骤s1中，所述提取具体如下：

16、浸泡过夜后超声提取1小时，13000rpm离心后收集上清液，使用0.22μm滤膜过滤。

17、优选地，步骤s2中，所述超高效液相色谱的色谱条件包括：

18、色谱柱：c18色谱柱；

19、柱温：38-42℃；

20、流速：0.33-0.37ml·min-1；

21、流动相a：质量分数0.1％的甲酸水溶液；流动相b：乙腈。

22、更优选地，且作为本发明的实例，步骤s2中，所述超高效液相色谱的色谱条件如下：

23、超高效液相色谱仪：vanquish duo uhplc液相系统；

24、色谱柱：hypersil gold c18 2.1mm×100mm，1.9μm；

25、柱温：40℃；

26、流速：0.35ml·min-1；

27、流动相a：质量分数0.1％的甲酸水溶液；流动相b：乙腈；

28、进样量：5μl；

29、梯度洗脱方案：0-1min，90％流动相a+10％流动相b；1-2min，90％-85％流动相a+10％-15％流动相b；2-8min，85％-80％流动相a+15％-20％流动相b；8-15min，80％-72％流动相a+20％-28％流动相b；15-40min，72％-36％流动相a+28％-64％流动相b；40-41min，36％-2％流动相a+64％-98％流动相b；41-43min，2％流动相a+98％流动相b；43-44min，2％-90％流动相a+98％-10％流动相b；44-46min，90％流动相a+10％流动相b。

30、优选地，步骤s2中，所述质谱的质谱条件包括：

31、鞘气流速：37-39arb；

32、辅助气体流速：10arb；

33、毛细管温度：318-322℃；

34、辅助气体加热器温度：295-305℃；

35、喷雾电压：3.88-3.92kv；

36、扫描模式：full ms/dd-ms2。

37、更优选地，且作为本发明的实例，步骤s2中，所述质谱的质谱条件为：

38、质谱仪：正离子模式的q exactive plus q-orbittap质谱仪；

39、鞘气流速：38arb；

40、辅助气体流速：10arb；

41、毛细管温度：320℃；

42、辅助气体加热器温度：300℃；

43、喷雾电压：3.9kv；

44、扫描模式：full ms/dd-ms2；

45、扫描范围：m/z 100-1500；

46、全扫描分辨率：70000；agc目标值：106；最大注入时间：100ms；

47、ms2扫描分辨率：17500；agc目标值：105；最大注入时间：50ms；

48、归一化碰撞能量：20％、40％和60％。

49、优选地，步骤s3中，所述检索选自学术文献检索、tcmsp数据库检索、hmdb数据库检索中的至少一种。

50、更优选地，且作为本发明的实例，步骤s3中，所述检索为学术文献检索、tcmsp数据库检索和hmdb数据库检索。

51、优选地，且作为本发明的实例，步骤s3中，所述建立专属性本地成分数据库具体为：

52、基于检索到的太子参、陈皮、山药、炒麦芽和山楂中含有的成分及其分子式、单同位素质量数和质谱二级碎片信息，利用tracefinder软件分别建立太子参、陈皮、山药、炒麦芽和山楂的专属性的本地成分数据库。

53、优选地，步骤s4中，所述数据匹配具体为：采用一级质谱匹配、二级质谱匹配和同位素峰匹配的方式进行数据匹配。

54、优选地，步骤s5中，所述数据分析核对具体为：

55、将步骤s2步骤中获得的数据1导入到tracefinder软件，选择步骤s3中建立专属性本地成分数据库进行数据匹配，匹配项目包括一级质谱匹配、二级质谱匹配和同位素峰匹配；依据步骤s4中获得的潜在成分列表对健胃消食片的成分匹配结果作进一步核对和确认。

56、另一方面，本发明提供了一种健胃消食片的质量标准，根据上述的检测方法对健胃消食片进行检测，对检测结果进行分析获取健胃消食片中成分名称、保留时间及成分来源。

57、优选地，所述健胃消食片中成分名称、保留时间及成分来源包括：

58、

59、更优选地，所述健胃消食片中成分名称、保留时间及成分来源还包括：

60、

61、

62、

63、

64、其中，#表示该成分存在同分异构体。

65、再一方面，本发明提供了上述检测方法、上述质量标准在健胃消食片成分检测中的应用。

66、再一方面，本发明提供了一种健胃消食片入血成分的检测方法，包括以下步骤：

67、t1、取受试者服用健胃消食片前的血浆，与溶剂混合，提取，得上清液a；

68、t2、取步骤t1所述受试者服用健胃消食片后的血浆，与溶剂混合，提取，得上清液b；

69、t3、将步骤t1得到的上清液a和步骤t2得到的上清液b分别作为待测样品上清液，采用上述的检测方法进行检测，依次分别得到结果a和结果b；

70、t4：基于健胃消食片的体外成分分析结果，对比步骤t3得到的结果a和结果b，得到健胃消食片入血成分。

71、其中，所述受试者包括但不限于小鼠、大鼠、家猫、兔子、人，等。

72、优选地，步骤t1中，所述受试者为大鼠。

73、再一方面，本发明提供了一种健胃消食片的靶点分析方法，包括以下步骤：

74、e1、采用权利要求11所述的检测方法对健胃消食片入血成分进行检测，得健胃消食片入血成分；

75、e2、收集步骤e1得到的健胃消食片入血成分对应的靶点得入血成分靶点集合，检索功能性消化不良相关靶点得功能性消化不良靶点集合，将所述入血成分靶点集合与所述功能性消化不良靶点集合取交集，得到入血成分-消化不良相关靶点集合；

76、e3、利用步骤e2得到的入血成分靶点集合、功能性消化不良靶点集合和入血成分-消化不良相关靶点集合构建可视化网络，利用步骤e2得到的入血成分-消化不良相关靶点集合进行蛋白-蛋白作用分析；

77、e4、利用步骤e2得到的入血成分-消化不良相关靶点集合进行通路富集分析。

78、优选地，步骤e1中，所述健胃消食片入血成分包括：

79、对香豆素、落干酸、阿魏酰胍丁胺、芸香柚皮苷、夏佛塔苷、柚皮苷、橙皮苷、阿格拉宾、太子参环肽甲、异樱花素、枸橘苷、太子参环肽乙、单羟基-六甲氧基黄酮、异橙黄酮、太子参环肽b、橙皮内酯、橙黄酮、山药素iii、5,7,3',4'-四甲氧基黄酮、川陈皮素、5,6,7,4'-四甲氧基黄酮、3,5,6,7,8,3',4'-庚氧基黄酮、橘皮素。

80、优选地，步骤e2中，所述收集具体为：通过在tcmsp数据库和swisstargetprediction数据库搜集和预测入血成分的相关靶点；所述检索具体为：通过omim-gene map数据库，drugbank数据库，ttd数据库，genecards数据库和disgenet数据库进行功能性消化不良相关靶点检索。

81、优选地，步骤e3中，所述构建可视化网络具体为：利用cytoscape软件，构建成分-靶点-疾病可视化网络；所述蛋白-蛋白作用分析具体为：将所述入血成分-消化不良相关靶点集合导入sting网站进行蛋白-蛋白相互作用分析，筛选健胃消食片治疗功能性消化不良的核心靶点。

82、优选地，步骤e4中，所述通路富集分析具体为：将所述入血成分-消化不良相关靶点导入到david数据库进行go通路分析和kegg通路富集分析，确定健胃消食片治疗功能性消化不良的关键信号通路。

83、优选地，所述核心靶点包括：

84、组胺受体h2、5-羟色胺受体4、5-羟色胺受体1a、多巴胺受体d4、多巴胺受体d2和炎症相关靶点。

85、更优选地，所述关键信号通路包括以下通路中的至少一种：pi3k-akt信号通路、mapk信号通路、tnf信号通路、血清素能突触、t细胞受体信号通路、钙离子信号通路、mtor信号通路、toll样受体信号通路、b细胞受体信号通路、camp信号通路、il-17信号通路、胆碱能突触、ampk信号通路、nf-κb信号通路和多巴胺能突触。

86、再优选地，所述关键信号通路包括：pi3k-akt信号通路、mapk信号通路、tnf信号通路、血清素能突触、t细胞受体信号通路、钙离子信号通路、mtor信号通路、toll样受体信号通路、b细胞受体信号通路、camp信号通路、il-17信号通路、胆碱能突触、ampk信号通路、nf-κb信号通路和多巴胺能突触。

87、再一方面，本发明还提供了上述靶点分析方法在生产治疗功能性消化不良产品中的应用。

88、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

89、(1)本发明提供了一种采用超高效液相色谱检测健胃消食片成分的方法，实现了健胃消食片中多种有效成分的同时高效鉴别与检测。

90、(2)本发明依据5种单味药材的体外成分鉴定结果，明确了健胃消食片的体外成分组成，并分析其入血成分，进一步明确健胃消食片的潜在药效物质基础。

91、(3)本发明基于入血成分，采用网络药理学研究方法探索了健胃消食片治疗功能性消化不良的潜在作用机制，首次全面地阐释了健胃消食片的物质基础，初步探索了健胃消食片的潜在作用机制，为健胃消食片的进一步研究提供了基础和依据。