一种动物组织基因组提取试剂盒及方法与流程

本发明涉及分子生物学领域，具体为一种动物组织基因组提取试剂盒及方法。

背景技术：

1、小鼠具有成熟期短、繁殖能力强、体型小巧、易于饲养和便于观察实验结果等优势成为实验中最常用的模式动物。采用分子生物学方法从小鼠组织提取核酸，其基因组的完整性、纯度和浓度的提取对后续的分子实验至关重要，其实验结果也是开展临床实验前的重要参考依据。

2、目前生物技术实验采用的dna提取方法主要是sds法、碱裂解法，其步骤繁琐，提取过程冗长，所需样本量较大，提取高纯的dna具有一定难度，其主要难点在于动物组织中rna含量高、蛋白组分复杂、杂质难以清除，因此迫切需要一种可以有效降低组织中rna含量、去除杂蛋白的提取方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种动物组织基因组提取试剂盒及方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

2、为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

3、一种动物组织基因组提取试剂盒，由以下组分组成：

4、裂解液s1、裂解液s2、蛋白酶k、缓冲液w2、漂洗液、洗脱液、磁珠；所述磁珠为硅羟基磁珠或羧基化硅羟基磁珠。

5、进一步的，所述裂解液s1为tris、硼酸、ctab、nacl、edta·2na和pvp混合溶液；裂解液s2为sds溶液；蛋白酶k为蛋白酶k；缓冲液w2为乙酸甲和pvp混合溶液；漂洗液为浓度70％的乙醇溶液；洗脱液为nacl和peg8000混合溶液；磁珠粒径大小为200nm。

6、进一步的，所述裂解液s1中tris浓度为120～125mm，硼酸浓度为95～100mm，ctab浓度为80～85mm，nacl浓度为310～315mm，edta·2na浓度为25～30mm，pvp浓度为1-5mm；裂解液s2中sds浓度为690～695mm；蛋白酶k浓度为20mg/ml；缓冲液w2中乙酸甲的浓度为1～5m，pvp的浓度1～5mm；洗脱液中nacl浓度为5～10mm，peg8000浓度为1～5mm。

7、进一步的，所述羧基化硅羟基磁珠按如下方法制备：

8、s1：将fecl2·4h2o加入去离子水中通入n2，超声溶解；加入氨水搅拌，观察到有fe3o4粒子生成后缓慢加入油酸，加热反应，清洗得到磁性纳米颗粒；

9、s2：将磁性纳米颗粒加入乙醇溶液中，超声分散，加入氨水和甲基三甲氧基硅烷，超声分散，搅拌反应，过滤，洗涤，干燥，得到硅羟基磁珠；

10、s3：将硅羟基磁珠分散于无水甲苯中，加入γ-氨丙基三乙氧基硅烷，加热回流反应，洗涤，磁吸分离，干燥后移至反应容器内；将n，n-二甲基酰胺加入反应容器中搅拌均匀，搅拌状态下缓慢滴入丁二酸酐的n，n-二甲基酰胺溶液，搅拌反应，洗涤，过滤，干燥，得到羧基化硅羟基磁珠。

11、进一步的，所述步骤s2中，每1g磁性纳米颗粒，乙醇加入量为1000ml，氨水加入量为10ml，甲基三甲氧基硅烷加入量为8ml。

12、进一步的，所述步骤s3中，每1g硅羟基磁珠，γ-氨丙基三乙氧基硅烷加入量为40ml，n，n-二甲基酰胺加入量为150ml，丁二酸酐的n，n-二甲基酰胺溶液浓度为7g/l，丁二酸酐的n，n-二甲基酰胺溶液加入量为250ml；加热回流反应温度为110～120℃，加热回流反应时间为18～20h。

13、一种动物组织基因组提取试剂盒提取动物组织dna的方法，

14、s5：将研磨充分的动物组织样本加入到裂解液s1中，颠倒混匀，加入裂解液s2和蛋白酶k，颠倒混匀，水浴加热后室温冷却，加入缓冲溶液w2，在低温下离心，得到动物组织基因组溶液；

15、s6：取动物组织基因组溶液上清液，加入异丙醇，加入磁珠，震荡摇匀后静置；置于磁力架或磁铁上磁分离，吸弃废液；加入漂洗液，磁分离，吸弃废液，漂洗液，磁分离，吸弃废液三个步骤重复两次；加入洗脱液，水浴加热后磁分离，吸取上清液，得到dna溶液。

16、进一步的，所述步骤s5中，每50mg动物组织样本，裂解液s1加入量为480μl，裂解液s2加入量为150μl，蛋白酶k加入量为20μl，缓冲液w2加入量为500μl，水浴加热温度为65℃，水浴加热时间为40min，室温冷却时间为5min，低温离心温度为4℃，离心转速为12000rpm，低温离心时间为10min。

17、进一步的，所述步骤s6中，每600μl上清液，异丙醇加入量为600μl，磁珠加入量为50μl，漂洗液加入量为600μl，洗脱液加入量为100μl，水浴加热温度为56℃，水浴加热时间为10min。

18、上述组分的功效是：

19、裂解液s1：裂解组织细胞，去除杂质；

20、裂解液s2：去除蛋白质，促进磁珠吸附；

21、蛋白酶k：降解膜蛋白；

22、缓冲液w2：去除蛋白质和离子杂质；

23、漂洗液：进一步去除离子杂质；

24、洗脱液：将dna从吸附珠上洗脱；

25、磁珠：吸附dna。

26、与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：硅羟基磁珠在一定条件下对目的dna具有很强的亲和力，当条件改变时，磁珠释放吸附的dna能够达到快速分离纯化dna的目的。整个提取过程安全、便捷，提取的dna纯度高，为后续分子实验夯实材料基础。

27、本发明在甲基三甲氧基硅烷作用下形成表面硅羟基包覆的磁性微球的外层再包覆一层由丁二酸酐作用的羧基化硅羟基磁珠。与传统的硅羟基磁珠相比，羧基化硅羟基磁珠具有双层包覆结构，使得其同时具备亲水性和疏水性的特征，既能在水系溶液中保持湿润性和悬浮性，又可以避免在有机体系中磁珠粒子集合和稠化现象的发生，应用范围广；而传统的硅羟基磁珠其只具备了单一的亲水性或疏水性，应用范围窄。

28、本发明中羧基化硅羟基磁珠的双亲性包覆结构，使得颗粒表面能降低，同时减轻磁珠颗粒之间的相互作用，使其在磁分离下，团聚现象减轻，分散性能得到提高，具有更好的dna提取效果，dna的提取纯度高；而传统的硅羟基磁珠比表面积大，表面能高，在磁分离下容易发生颗粒团聚现象。

29、本发明中羧基化硅羟基磁珠的双亲性包覆结构能够和裂解液s2中的sds通过电性吸引和疏水键结合形式，增加磁珠表面的负电荷量，双亲性包覆结构中的阴离子借由钠离子与sds中的阴离子形成盐桥结构，使dna被更容易吸附到羧基化硅羟基磁珠的表面，提高了dna的提取纯度。

30、本发明中试剂盒的优点如下：1.本试剂盒不含氯仿、β-巯基乙醇等有害化学试剂，不会对伤害实验人员及污染环境造成；2.所用试剂均为常规试剂，成本低同时兼具采购方便；3.dna完整性好、操作简单安全等优势。

技术特征：

1.一种动物组织基因组提取试剂盒，其特征在于：由以下组分组成：

2.根据权利要求1所述的一种动物组织基因组提取试剂盒，其特征在于：裂解液s1为tris、硼酸、ctab、nacl、edta·2na和pvp混合溶液；裂解液s2为sds溶液；缓冲液w2为乙酸甲和pvp混合溶液；漂洗液为浓度70％的乙醇溶液；洗脱液为nacl和peg8000混合溶液。

3.根据权利要求2所述的一种动物组织基因组提取试剂盒，其特征在于：裂解液s1中tris浓度为120～125mm，硼酸浓度为95～100mm，ctab浓度为80～85mm，nacl浓度为310～315mm，edta·2na浓度为25～30mm，pvp浓度为1-5mm；裂解液s2中sds浓度为690～695mm；蛋白酶k浓度为20mg/ml；缓冲液w2中乙酸甲的浓度为1～5m，pvp的浓度1～5mm；洗脱液中nacl浓度为5～10mm，peg8000浓度为1～5mm。

4.根据权利要求1所述的一种动物组织基因组提取试剂盒，其特征在于：羧基化硅羟基磁珠按如下方法制备：

5.根据权利要求4所述的一种动物组织基因组提取试剂盒，其特征在于：步骤s2中，每1g磁性纳米颗粒，乙醇加入量为1000ml，氨水加入量为10ml，甲基三甲氧基硅烷加入量为8ml。

6.根据权利要求4所述的一种动物组织基因组提取试剂盒，其特征在于：步骤s3中，每1g硅羟基磁珠，γ-氨丙基三乙氧基硅烷加入量为40ml，n，n-二甲基酰胺加入量为150ml，丁二酸酐的n，n-二甲基酰胺溶液浓度为7g/l，丁二酸酐的n，n-二甲基酰胺溶液加入量为250ml；加热回流反应温度为110～120℃，加热回流反应时间为18～20h。

7.根据权利要求1-6中任意一项所述的一种动物组织基因组提取试剂盒提取动物组织dna的方法，其特征在于：

8.根据权利要求7所述的一种动物组织基因组提取试剂盒提取动物组织dna的方法，其特征在于：步骤s5中，每50mg动物组织样本，裂解液s1加入量为480μl，裂解液s2加入量为150μl，蛋白酶k加入量为20μl，缓冲液w2加入量为500μl，水浴加热温度为65℃，水浴加热时间为40min，室温冷却时间为5min，低温离心温度为4℃，离心转速为12000rpm，低温离心时间为10min。

9.根据权利要求7所述的一种动物组织基因组提取试剂盒提取动物组织dna的方法，其特征在于：步骤s6中，每600μl上清液，异丙醇加入量为600μl，磁珠加入量为50μl，漂洗液加入量为600μl，洗脱液加入量为100μl，水浴加热温度为56℃，水浴加热时间为10min。

技术总结本发明公开了一种动物组织基因组提取试剂盒及方法；其中动物组织核酸提取试剂盒由以下成分组成：裂解液S1：Tris、硼酸、CTAB、NaCl、EDTA·2Na和PVP混合溶液；裂解液S2：SDS溶液；缓冲液W2：乙酸甲和PVP混合溶液；漂洗液：一定浓度的乙醇溶液；洗脱液：NaCl和PEG8000混合溶液；吸附珠为硅羟基磁珠或羧基化硅羟基磁珠。该试剂盒优点如下：1.本试剂盒不含氯仿、β‑巯基乙醇等有害化学试剂，不会对伤害实验人员及污染环境造成及污染环境；2.所用试剂均为常规试剂，成本低同时兼具采购方便；3.DNA完整性好、操作简单安全等优势。技术研发人员：王笑笑,王佩佩,王建国,卢文翔受保护的技术使用者：江苏幸福基因技术有限公司技术研发日：技术公布日：2024/8/5