含八氢番茄红素的油树脂和组合物的制作方法

发明领域本发明涉及包含高浓度八氢番茄红素的油树脂，并涉及包含所述八氢番茄红素以及荷荷巴油的组合物。本发明还涉及所述含八氢番茄红素的组合物在预防和管理由暴露于空气污染或紫外线辐射引起的皮肤损伤中的用途。发明背景八氢番茄红素是在许多不同种类的果实中发现的基本无色的类胡萝ト素。除了充当其它生物活性类胡萝ト素的生物合成中的关键中间体外，八氢番茄红素本身还具有几种生物学性质，包括抗炎、抗氧化和紫外线吸收活性。这些性质，加上其没有颜色，已经导致开发用于治疗或预防各种皮肤状况的包含八氢番茄红素的局部和化妆品制剂。在us 8,398,958中描述了可用于增亮或增白肤色的这种制剂的一个实例。八氢番茄红素可获自许多不同的来源，包括各种水果物种(例如番茄)、藻类(例如杜氏藻属物种)和霉菌，其中最值得注意的是三孢布拉氏霉(blakeslea trispora)。三孢布拉氏霉(b.trispora)是一种热带植物病原体，但对动物和人类无害。该物种已被广泛用于研究类胡萝ト素合成途径，因为已经发现其产生重要的类胡萝ト素，如番茄红素、β-胡萝ト素、八氢番茄红素和六氢番茄红素。此外，如乌克兰专利ua85489中所述，已经发现借助菌株选择和生长条件有可能由三孢布拉氏霉生产大量八氢番茄红素。此外，ua86556公开了一种在ua85489中描述的菌株温育后获得含八氢番茄红素的生物质的方法。近年来，空气污染的致病作用已经成为越来越关注的问题。尽管空气传播的污染物对心脏和呼吸健康的影响早已为人所知，但是现在越来越清楚的是，皮肤经常是这些污染物的目标并受到不利影响。因此，已经发现在空气污染的增加与人类痤疮、特应性皮炎、荨麻疹和其它皮肤状况的新病例数之间存在明显的相关性。此外，空气污染也被认为是加速或过早皮肤老化的加剧因素。最后，越来越多的知识体系将空气污染与各种皮肤癌的发病率和/或严重程度联系起来。尽管空气污染可能来自许多不同的来源，但是考虑到很大比例的世界人口每天暴露于这样的污染，机动车废气中包含的污染物特别重要。特别关注的是柴油发动机排放的废气中包含的污染物。柴油机废气含有非常大量的化合物，其中许多与显著的健康风险相关联。除了由溶解在气相中的化合物造成的负面影响外，柴油机废气还含有显著浓度的柴油机颗粒物(dpm)。以各种不同尺寸范围存在的这些颗粒对于肺癌和其它严重的肺部疾病受到特别关注。但是，最近的研究还显示皮肤细胞暴露于dpm与各种皮肤状况(如上文提到的那些)之间的直接联系。此外，已经公开了描述空气传播颗粒物(包括dpm)对皮肤细胞的影响的若干研究。一个这样的实例是ryu等人的研究[experimental&molecular medicine 51：108；2019]，其中作者描述了由暴露于空气传播颗粒物引起的角质形成细胞衰老的根本生化变化。其它研究还描述了当培养的细胞暴露于dpm时，细胞因子和白细胞介素，包括il-8的水平增加。因此，例如，reynolds等人(2011)[environmental health perspective 119(3)：332-336]描述了当上皮细胞暴露于dpm时所见的il-8分泌增加的根本生化途径。需要一种安全的天然来源的组合物，其可用于预防、缓解或治疗由暴露于空气传播污染物(特别是在柴油机废气中发现的那些)引起或与其相关的皮肤状况以及与阳光暴露相关的皮肤状况。发明概述在本发明的一个方面，本发明人已经发现有可能制造由霉菌物种三孢布拉氏霉获得的无溶剂的非gmo油树脂，其包含浓度比先前获得的高得多(例如，高20-30倍)的八氢番茄红素。此外，出乎意料地发现，与用于获得所述组合物的生物质相比时，在本公开的油树脂中选择性富集植物甾醇麦角甾醇。这种富集八氢番茄红素的油树脂在某些实施方案中用作用于制备下文更详细公开和描述的组合物和剂型的起始材料。在进一步方面，本发明人已经发现，包含八氢番茄红素以及西蒙得木(荷荷巴)籽油的组合物特别有利地用于保护皮肤免受由空气传播污染物(如柴油机颗粒物(dpm))和紫外线辐射引起的损伤，以及用于维持和改善皮肤品质。因此，本发明主要涉及一种由三孢布拉氏霉获得的无溶剂的非gmo油树脂，其包含10-40％(w/w)的浓度的八氢番茄红素。在一个优选的实施方案中，所述油树脂中的八氢番茄红素浓度在20-40％(w/w)的范围内。在另一优选实施方案中，所述油树脂中的八氢番茄红素浓度在20-30％(w/w)的范围内。在许多情况下，上文公开的油树脂包含一种或多种植物甾醇。该油树脂中存在的主要植物甾醇之一是麦角甾醇，其通常以在大约0.5至1％(w/w)的范围内的浓度存在。在一个优选的实施方案中，麦角甾醇浓度为大约0.6％(w/w)。要指出的是，在本公开通篇使用术语“大约”(关于百分比浓度值)以指示与指定值相差最多+/-0.5％的浓度包括在由指定浓度值或范围限定的范围内。在另一个方面，本发明涉及一种由三孢布拉氏霉获得的无溶剂的非gmo油树脂，其包含20-30％(w/w)的浓度的八氢番茄红素，其通过包含以下步骤的方法获得或可获得：a)培养霉菌物种三孢布拉氏霉；b)由所述培养的三孢布拉氏霉获得生物质；c)对所述生物质施以在300至450巴之间的操作压力和大约50℃-65℃的操作温度下进行的超临界二氧化碳流体提取，由此产生含八氢番茄红素的油树脂。优选地，在上文公开的方法的步骤(a)中培养的三孢布拉氏霉霉菌是phyt 1+/phyt 1-菌株。通常，通过这种方法获得的油树脂包含20至30％(w/w)的浓度的八氢番茄红素和一种或多种植物甾醇。在大多数实施方案中，所述一种或多种植物甾醇包含麦角甾醇作为主要组分。所述油树脂中的麦角甾醇浓度通常在0.5至1％(w/w)的范围内。在一个优选实施方案中，所述油树脂中的麦角甾醇浓度为大约0.6％(w/w)。在进一步方面，本发明涉及一种组合物，其包含如上文公开的含八氢番茄红素的油树脂以及获自西蒙得木(荷荷巴)的籽油。在一个优选实施方案中，所述组合物中的八氢番茄红素浓度在0.01至10％(w/w)的范围内。在一个特别优选的实施方案中，八氢番茄红素浓度在1至2％(w/w)的范围内，更优选在1至1.5％(w/w)的范围内。在一些优选实施方案中，所述组合物中的八氢番茄红素浓度为大约1％(w/w)。在再进一步方面，本发明涉及一种剂型，其包含上文公开的含八氢番茄红素的组合物以及一种或多种药学可接受、营养食品可接受或化妆品可接受的赋形剂。在另一个方面，本发明涉及一种剂型，其包含上文公开的含八氢番茄红素的油树脂以及一种或多种药学可接受、营养食品可接受或化妆品可接受的赋形剂。下文提供关于所述剂型(口服和局部形式)的进一步细节。本发明还包括用于改善或维持皮肤品质和/或保护皮肤免受环境损害(例如，由于空气传播污染物或紫外线辐射)的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者施用如上文公开的组合物或剂型。在一个优选实施方案中，受试者是人类受试者。下文提供关于这些方法的进一步细节。附图简述图1呈现了概括由三孢布拉氏霉培养物获得富含八氢番茄红素的生物质的方法的流程图。图2是概括用于制备本发明的含八氢番茄红素的油树脂的各种方法步骤的流程图。图3以图形方式呈现了显示用柴油机颗粒物处理后培养的角质形成细胞中的il-8生成增加和用本发明的八氢番茄红素组合物的稀释液处理培养的细胞时对这种效应的抑制的结果。图4是显示本发明的含八氢番茄红素的组合物对培养的角质形成细胞暴露于柴油机颗粒物后的其中活性氧物质(ros)水平的抑制作用的柱状图。图5是显示本发明的含八氢番茄红素的组合物对培养的角质形成细胞暴露于uvb辐射后的其中的il-8水平的抑制作用的柱状图。图6以图形方式呈现了显示当用本发明的含八氢番茄红素的组合物的稀释液处理所述细胞时在人工皮肤模型中抑制皮肤细胞产生il-1α的结果。图7以图形方式显示含八氢番茄红素的组合物稀释液在人工皮肤模型中对il-6产生的抑制作用。图8呈现了显示由本发明的组合物的局部施用引起的皮肤增亮增加的数据。图9呈现了显示由本发明的组合物的局部施用引起的皮肤发红减少的数据。图10呈现了显示由本发明的组合物的局部施用引起的皮肤紧致度(firmness)增加的数据。图11呈现了显示由本发明的组合物的局部施用引起的皮肤弹性增加的数据。图12呈现了显示由本发明的组合物的局部施用引起的皮肤光滑度增加的数据。图13呈现了显示在局部施用本发明的组合物后各种皮肤皱纹参数的改善的数据。图14呈现了显示由本发明的组合物的局部施用引起的经表皮失水减少的数据。图15呈现了显示在局部施用本发明的组合物后皮肤刺激减少的数据。发明详述如上文解释，在一个方面，本发明涉及一种由霉菌物种三孢布拉氏霉获得的无溶剂的非gmo油树脂，其包含10-40％(w/w)的浓度的八氢番茄红素。在一些优选实施方案中，该油树脂的八氢番茄红素浓度在20-30％(w/w)的范围内。在一个优选实施方案中，该油树脂中的八氢番茄红素浓度为大约20％(w/w)。要指出的是，术语“油树脂”通常被理解为是指包含精油和/或脂肪油以及其它主要疏水性化合物的半固体(或粘性液体)提取物。过去，这样的油树脂完全通过生物材料(例如，微生物发酵后获得的植物材料或生物质)的溶剂提取和随后除去所述溶剂获得。但是，在涉及完全无溶剂的组合物的本发明的情况下，油树脂借助超临界流体提取，优选超临界二氧化碳提取获得。此外，如上文提到，该油树脂是“非gmo”油树脂，即，其不是获自转基因生物。在本发明的这个方面的一些实施方案中，油树脂进一步包含附加的生物活性化合物，尤其是植物甾醇。在一些情况下，油树脂的主要植物甾醇组分是麦角甾醇。如上文解释，根据ua85489和ua 86556的教导由三孢布拉氏霉菌株获得富含八氢番茄红素的生物质。这种方法概括在图1中提供的流程图中。然后对该生物质(通常含有5至7％(w/w)的八氢番茄红素和大约40％-50％油)施以在300至450巴之间的操作压力下进行的超临界二氧化碳流体提取。该提取在大约50℃-65℃的温度下进行。在这种提取之后，获得含有通常在20至30％(w/w)之间的浓度的八氢番茄红素和大约0.6％(w/w)的浓度的植物甾醇混合物(其中麦角甾醇是主要组分)的油树脂(如上文所述)。这种方法的概览显示在图2中呈现的流程图中。如上所述，本发明还提供了包含八氢番茄红素和植物甾醇的组合物。在一个优选实施方案中，所述组合物包含1％(w/w)八氢番茄红素和0.02％(w/w)植物甾醇。在另一优选实施方案中，所述组合物包含0.1％(w/w)八氢番茄红素和0.002％植物甾醇。在上文公开的方法的一个实施方案中，施用的组合物中存在的八氢番茄红素包含15-顺式-八氢番茄红素。在一些实施方案中，所述组合物中大于50％(w/w)的八氢番茄红素是15-顺式-八氢番茄红素。在另一些实施方案中，大于90％(w/w)的八氢番茄红素是15-顺式-八氢番茄红素。如上文提到，本发明在其范围内包括包含上文公开的含八氢番茄红素的组合物以及一种或多种药学可接受、营养食品可接受或化妆品可接受的赋形剂的剂型。如下文更详细描述，所述剂型可以配制用于局部施用或口服施用。此外，本发明提供包含如本文公开和描述的含八氢番茄红素的油树脂以及一种或多种药学可接受、营养食品可接受或化妆品可接受的赋形剂的剂型。可以制备这样的剂型，以使它们适合局部施用。但是，在一个优选实施方案中，这种类型的剂型适合口服施用。在一个优选实施方案中，该剂型适合局部施用(即，施用于受试者的皮肤或粘膜)。例如，所述组合物可以配制为乳膏、洗剂、软膏、凝胶、泡沫、油膏、悬浮液、油或溶液。替代性地或附加地，该组合物可以吸附到适合安置在皮肤或粘膜表面上或粘附到皮肤或粘膜表面的垫或其它递送装置中。在一些实施方案中，局部剂型可以配制为乳剂，如水包油或油包水乳剂。在另一些情况下，疏水性八氢番茄红素可以在天然来源的生物相容性稀释剂，如植物油(例如橄榄油、葵花油、番茄油、荷荷巴油等)、液体石蜡或其它常规亲脂性稀释剂(例如角鲨烯)中稀释。在一些优选实施方案中，局部剂型中的八氢番茄红素浓度在0.01至0.5％(w/w)的范围内。在一些优选实施方案中，八氢番茄红素浓度为0.1％。在另一些优选实施方案中，八氢番茄红素浓度为0.02％(w/w)。在另一实施方案中，如上文公开的本发明的剂型是适合口服施用的剂型。优选地，这样的口服剂型选自片剂、囊片、胶囊、锭剂、咀嚼片剂、悬浮液、糖浆、油或溶液。在一些实施方案中，口服组合物为软凝胶胶囊的形式。在一些实施方案中，口服组合物为饮料、小丸(shot)、软糖(gummy)或粉末的形式。在一些实施方案中，将口服组合物混合或融合到食品，如巧克力、冰淇淋等中。这样的单位剂型包含安全有效量的该组合物。适于制备用于口服施用的单位剂型的可药用载体是本领域熟知的。在一些实施方案中，片剂通常包含常规的药学相容的辅助剂作为惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠、甘露糖醇、乳糖和纤维素；阻碍剂(hinders)，如淀粉、明胶和蔗糖；崩解剂，如淀粉、海藻酸和交联羧甲基纤维素；润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸和滑石。在一个实施方案中，助流剂如二氧化硅可用于改善粉末混合物的流动特性。在一个实施方案中，可以为了外观而添加着色剂，如fd&c染料。甜味剂和调味剂，如阿斯巴甜、糖精、薄荷醇、薄荷和水果香精，是可用于咀嚼片剂的辅助剂。胶囊通常包含一种或多种固体稀释剂。在一些实施方案中，载体组分的选择取决于次要考虑因素，如味道、成本和储存稳定性，它们对本发明而言不是关键的，并且可以由本领域技术人员容易地进行。在一个实施方案中，口服剂型包含预定释放曲线。在一个实施方案中，本发明的口服剂型包含缓释(extended-release)片剂、胶囊、锭剂或咀嚼片剂。在一个实施方案中，本发明的口服剂型包含慢释(slow-release)片剂、胶囊、锭剂或咀嚼片剂。在一个实施方案中，本发明的口服剂型包含速释(immediate release)片剂、胶囊、锭剂或咀嚼片剂。在一个实施方案中，根据如本领域技术人员已知的药物活性成分的所需释放曲线配制口服剂型。如上所示，除了八氢番茄红素和存在于本发明的组合物中的其它任选活性成分外，本文提供的剂型通常进一步包含一种或多种赋形剂。这些可以包括例如增稠剂、润湿剂、稳定剂、着色剂、稀释剂、填充剂(bulking agents)、控释聚合物等。可用于配制本发明的组合物的各种剂型类型是本领域技术人员熟知的，并且进一步的细节可在标准参考著作中获得，如remington′s pharmaceutical sciences，mackpublishing co，easton，pa，usa，第21版(2006)。如上文解释，本发明还包括用于改善或维持皮肤品质和/或保护皮肤免受环境损害(例如，由于空气传播污染物或紫外线辐射)的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者施用如上文公开的组合物或剂型。因此，在一个实施方案中，本发明涉及一种保护暴露于空气传播污染物的受试者的皮肤的方法，其包括向需要这种保护的受试者施用包含八氢番茄红素的组合物。通常，在这一实施方案中，本发明的组合物或含有所述组合物的剂型可以局部施用于受试者的皮肤，以作为预防措施或用于缓解或治疗由暴露于柴油机颗粒物(dpm)或其它空气传播污染物引起的现有病变。该组合物可以施用短时间(例如，几天或几周)以防止形成新的污染物相关的皮肤病变，例如当受试者知道他们将待在存在此类污染物的环境中时。或者，该组合物可以施用更长的时间(例如，几周至几个月)。在将该组合物配制为乳膏、凝胶、软膏或其它相对粘稠的剂型的情况下，将少量(例如大约0.5至大约10cm的乳膏)揉擦到受试者皮肤表面上的目标部位中。这种治疗的频率可以是每周一次至每天三次或更多次，取决于制剂中的八氢番茄红素和/或其它活性成分的精确浓度、受试者的年龄和/或施用所述制剂的原因(例如，用于预防新病变、预防过早皮肤老化或用于治疗现有病变)。在这种方法的另一些实施方案中，本方法的组合物可以口服施用于有需要的受试者。要指出的是，短语“保护暴露于空气传播污染物的受试者的皮肤”应理解为是指预防、缓解或治疗受试者皮肤的疾病、障碍和过早老化的一种或多种。这些疾病和障碍可以是由空气传播污染物引起或加剧的任何皮肤状况。但是，在一些实施方案中，所述疾病和障碍选自痤疮、特应性皮炎、荨麻疹、皮肤癌和过早皮肤老化。本发明还涉及一种预防、缓解或治疗由暴露于空气传播污染物引起或与暴露于空气传播污染物相关的皮肤状况的方法，其中所述方法包括向人类(或非人类哺乳动物)受试者施用本发明的组合物或剂型。在一个实施方案中，上文提到的皮肤状况是至少部分由细胞因子il-1α、il-8和/或il-6介导的炎性状况。如上文公开的两种方法中使用的术语“空气传播污染物”应理解为包括可能存在于室内或室外空气中的所有类型的有害化合物、物质和试剂。所述有害化合物、物质和试剂可能分散或溶解在空气中，或作为液滴、气溶胶或作为固体颗粒物存在。在后一种情况下，颗粒物可能具有吸附在其表面上的另外的液体或气体组分。在本发明的一个实施方案中，上文公开的方法特别涉及在机动车辆，特别是由柴油发动机提供动力的此类车辆中的废气中排放的空气污染物。在一个实施方案中，上文公开的方法特别涉及柴油机废气中存在的颗粒物(即dpm)。在本公开的方法的另一些实施方案中，空气传播污染物由其它形式的运输工具(例如，飞机和柴油火车发动机)或由工业设施和工厂排放。尽管任何合适的含八氢番茄红素的组合物可用于实施本发明的上文公开的方法，但在一个优选实施方案中，所述组合物包含无溶剂的非gmo的天然来源的八氢番茄红素。在另一实施方案中，本发明涉及一种保护暴露于紫外线辐射的受试者的皮肤的方法，其包括向需要这种保护的受试者施用包含八氢番茄红素的组合物。术语“紫外线辐射”是指所有频率的紫外线辐射，特别是人类受试者的皮肤暴露于的阳光中存在的那些，如uva和uvb范围内的辐射。在再进一步的实施方案中，本发明涉及一种改善皮肤品质的一个或多个方面的方法，其包括向需要这种保护的受试者施用包含八氢番茄红素的组合物。通过这种方法可以改善皮肤品质的许多不同方面。但是，在一个优选实施方案中，皮肤品质的所述方面选自均匀和平衡肤色、减少皱纹、增强弹性、保护天然皮肤屏障功能和改善皮肤外观。在另一个方面，本发明提供用作药剂的如上文公开的组合物。在一个优选实施方案中，所述药剂用于保护暴露于空气传播污染物的受试者的皮肤。在另一实施方案中，所述药剂用于保护暴露于紫外线辐射的受试者的皮肤。在再进一步的实施方案中，所述药剂用于改善皮肤品质的一个或多个方面，其中所述改善优选选自均匀和平衡肤色、减少皱纹、增强弹性、保护天然皮肤屏障功能和改善皮肤外观。在上文公开的方法和用途的一些优选实施方案中，包含八氢番茄红素的组合物是如上文定义和下文要求保护的组合物。在这些方法和用途的一些实施方案中，包含八氢番茄红素的组合物通过局部施加于受试者的皮肤和/或粘膜而施用。在另一些实施方案中，包含八氢番茄红素的组合物通过口服途径施用于受试者，优选配制为口服剂型，例如配制为上文定义的口服剂型之一。如上文公开，在上文公开的方法中使用的组合物包含获自霉菌物种三孢布拉氏霉的八氢番茄红素。在一个特别优选的实施方案中，所述三孢布拉氏霉为phyt 1+/phyt 1-菌株，例如公开在ua85489中并以保藏号f-100053保藏在depository of the institute ofmicrobiology and virology(以dk zabolotny命名)，nas ofukraine的菌株。优选地，上文公开的方法中使用的组合物中包含的八氢番茄红素获自根据ua86556的教导生产的生物质。下面提供这种方法的进一步细节。ua85489和ua 86556的教导整体并入本文。在一个优选实施方案中，在上文公开的方法中施用的组合物包含浓度在0.01％(w/w)至10％(w/w)之间的八氢番茄红素。在一个更优选的实施方案中，该组合物中的八氢番茄红素浓度在0.1至2.5％(w/w)的范围内。在一个进一步优选的实施方案中，该组合物中的八氢番茄红素浓度为大约0.1％(w/w)。在再进一步优选的实施方案中，八氢番茄红素浓度为大约1％(w/w)。在本发明方法的一些实施方案中，施用的组合物进一步包含一种或多种植物甾醇。在一个实施方案中，所述一种或多种植物甾醇包括麦角甾醇。本发明进一步包括如本文定义的非gmo、无溶剂的含八氢番茄红素的组合物在药剂或药妆或营养制剂的制造中的用途。在一个实施方案中，本发明涉及如本文定义的非gmo、无溶剂的含八氢番茄红素的组合物在用于保护暴露于空气传播污染物的受试者的皮肤的药剂或药妆或营养制剂的制造中的用途。在另一实施方案中，本发明涉及如本文定义的非gmo、无溶剂的含八氢番茄红素的组合物在用于预防、缓解或治疗由暴露于空气传播污染物引起或与暴露于空气传播污染物相关的皮肤状况的药剂或药妆或营养制剂的制造中的用途。在进一步实施方案中，本发明涉及如本文定义的非gmo、无溶剂的含八氢番茄红素的组合物在用于保护暴露于紫外线辐射的受试者的皮肤的药剂或药妆或营养制剂的制造中的用途。在再进一步的实施方案中，本发明涉及如本文定义的非gmo、无溶剂的含八氢番茄红素的组合物在用于改善皮肤品质的一个或多个方面的药剂或药妆或营养制剂的制造中的用途。在一个优选实施方案中，所述改善选自均匀和平衡肤色、减少皱纹、增强弹性、保护天然皮肤屏障功能和改善皮肤外观。结合上文公开的方法描述的所有各种技术特征同样适用于本文公开的不同的用途方面。现在将在以下非限制性实施例中举例说明本要求保护的发明的各种特征。实施例1通过本发明的组合物抑制培养细胞中的dpm诱导的il-8产生介绍：这一研究的目的是调查八氢番茄红素是否能够抑制培养的角质形成细胞中的dpm诱导的促炎细胞因子11-8产生的增加。这种体外系统充当在暴露于空气传播污染物后发生皮肤病变和加速皮肤老化的受试者中观察到的皮肤细胞中的炎症反应的模型。方法：hacat系的自发转化的成人角质形成细胞在补充有100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素和10％fbs的过滤dmem中生长和维持。将细胞的等分试样(浓度为大约2.5x105个细胞/ml)接种在含有170μl/孔的上述培养基的96孔板中。每个接种孔含有大约42,500个细胞。然后将板在37℃、5％co2下温育24小时。此后，吸出培养基并替换为含有56ppm的最终八氢番茄红素浓度的本发明的含八氢番茄红素的组合物(“试验”)的1％(w/w)稀释液或以下三种对照物：-媒介物对照(图3中的“对照”)-dpm刺激的对照(“dpm”)-阳性对照：地塞米松(“dex”)用于制备dpm、dex和试验溶液的媒介物是含有100μg/ml柴油机颗粒物(dpm)的pbs。所有试验项和对照物一式三份铺板。然后将板在37℃、5％co2下温育另外24小时。在该温育期结束时，吸出培养基并以250x g离心5分钟，以除去颗粒物。澄清的上清液然后在-70℃下冷冻直至可以进行il-8分析。使用商业elisa试剂盒(elisa max deluxe set for human il-8，由enco提供，目录号b287549)进行定量il-8分析。结果：这一研究的结果显示在图3中，其表明与仅媒介物对照(阴性对照)相比，单独用dpm处理导致il-8产量增加为大约2倍。地塞米松阳性对照没有导致未受刺激的细胞的基础水平il-8产量的显著变化。但是可以看出，与仅dpm组相比时，本发明的组合物(“试验”)导致对dpm刺激的il-8产量的明显且统计学上显著的(p<0.05)抑制。使用培养的人角质形成细胞模型获得的这些结果表明八氢番茄红素能够减少暴露于空气传播污染物如dpm的皮肤细胞中的至少一些炎症反应。实施例2通过本发明的组合物抑制培养细胞中的dpm诱导的活性氧物质(ros)产生介绍：来自化石燃料燃烧(如dpm)的空气传播颗粒组分可以通过生成与气道炎症和哮喘强相关的活性氧物质(ros)诱导氧化应激。ros实体包括自由基和非自由基氧中间体(过氧化物)，包括超氧自由基(o2·-)、过氧化氢(h2o2)、羟基自由基(oh·)和单线态氧(1o2)。在这一研究中，调查本发明的组合物对响应培养的角质形成细胞暴露于dpm而产生nos的影响。方法：如上文实施例1中所述使hacat系的自发转化的成人角质形成细胞生长、维持、铺板并暴露于对照和试验物质。这一研究中使用的对照物质是：-媒介物对照(图4中的“对照”)-dpm-n-乙酰半胱氨酸(nac；阳性对照)所用的试验物质是本发明的组合物的稀释液(即，含有非gmo、无溶剂的八氢番茄红素和荷荷巴油)，以产生56ppm的最终八氢番茄红素浓度。使用市售试剂盒进行处理的细胞上清液和对照细胞上清液的ros含量的定量分析，所述试剂盒使用测量羟基、过氧基和其它细胞内活性氧物质ros活性的荧光染料(dcfda)。结果：从图4中看出，尽管dpm处理将ros水平提高到未受刺激的对照物的大约40倍，但本发明的组合物(“试验”)在非常显著的程度上抑制ros浓度的这种提高，并且有效性仅略低于nac阳性对照。实施例3通过本发明的组合物抑制培养细胞中的uvb诱导的il-8产生介绍：在这一研究中，调查本发明的组合物对uvb暴露的培养的角质形成细胞中的il-8产生的影响。方法：如上文实施例1中所述使hacat系的自发转化的成人角质形成细胞生长、维持、铺板并用对照和试验物质处理。使用uvb灯照射培养的细胞以在培养的细胞中生成炎症反应。这一研究中使用的对照物质是：-媒介物对照(图5中的“对照”)-仅uvb暴露(“未处理”)-4-氨基苯甲酸(“paba”；阳性对照)所用的试验物质是本发明的组合物的稀释液(即，含有非gmo、无溶剂的八氢番茄红素和荷荷巴油)，以产生56ppm的最终八氢番茄红素浓度。如上文实施例1中所述测量培养细胞上清液的il-8浓度。结果：从图5中看出，与媒介物对照相比，uvb暴露引起il-8产量的大幅增加。还注意到，本发明的试验组合物引起这种uvb刺激的il-8产生的显著减少，其程度大于由阳性对照(商业防晒剂组分paba)引起的抑制。实施例4在3d重建皮肤模型中的dpm诱导的炎症反应的抑制介绍：为了进一步研究上文实施例1中给出的体外结果，使用重建人表皮(rhe)模型作为测试平台。下面在这一实施例中描述的实验中使用的重建皮肤(其可以以商品名“epiderm”购得)是由在插入式细胞培养器上培养的正常的人源性表皮角质形成细胞组成的高度分化的3d组织模型。这些插入式培养器允许在空气-液体界面处培养重建组织，由此能够容易地评估皮肤上的局部施用试剂。方法：epiderm重建皮肤系统获自供应商mattek(目录号epi-200)，并根据制造商的说明书处理组织。简言之，在递送后，将组织从其琼脂培养基中取出，洗涤，然后在5％co2环境中在37℃下静置以恢复过夜。然后，在存在或不存在以0.1％、1％和2.5％的浓度在荷荷巴油蜡中稀释至最终体积30μl的八氢番茄红素油树脂的情况下，用局部施用的dpm(100μg/ml在pbs中，10μl/样品)处理组织。还建立以下对照组：原始组织(未处理的对照)、媒介物(荷荷巴蜡)、dpm刺激的组织和n-乙酰半胱氨酸(nac；阳性对照)。在添加试验物质和对照物之后，将重建皮肤培养物在5％co2环境中在37℃下温育另外48小时。在处理期结束时，从组织对照植入物收集培养基，并以250x g离心5分钟，以除去颗粒物。然后将澄清的上清液在-70℃下冷冻，然后进行细胞因子分析。使用商业elisa试剂盒(elisa max deluxe set human il-1α目录号b265424；elisa max deluxe set human il-6目录号b2852558；都由enco提供)根据制造商的说明书测定解冻培养基中的il-1α和il-6水平。结果：这一研究的结果显示在图6和7中。图6中给出的柱状图表明，在epiderm人工皮肤模型中，含八氢番茄红素的油树脂的一些但不是所有稀释液都引起皮肤细胞产生的il-1α的减少。要指出的是，这种试验物质的1％浓度引起的il-1α产生的减少与由抗炎阳性对照(n-乙酰半胱氨酸；nac)引起的减少程度在数量上相当。此外，与仅dpm样品和仅媒介物样品相比时，由这种浓度的试验物质引起的il-1α水平的减少都是统计学上显著的(p<0.05)。图7呈现il-6产生的结果。从该图中可以看出，与仅dpm的样品相比时，测试的所有浓度的含八氢番茄红素的油树脂稀释液都引起il-6产生的显著减少(p<0.05)。这些数据证明，体内皮肤模型暴露于dpm导致炎症介质的产生增加，并且用本发明的含八氢番茄红素的组合物治疗能够抑制炎症反应的这个方面。这些结果因此强烈表明，本发明的组合物可能在预防、减轻或治疗由于皮肤暴露于环境污染物和刺激物(如dpm)引起的皮肤损伤方面具有价值。实施例5本发明的组合物对皮肤品质的各种方面的影响的临床研究介绍：在用本技术的组合物局部治疗之前和之后，在一组健康志愿者中研究以下皮肤品质特征：-肤色-皮肤发红-皮肤紧致度-皮肤弹性-皮肤光滑度-皱纹状况-皮肤屏障功能-舒缓效果方法和结果：为这一研究随机选择一组33名女性志愿者(平均年龄50岁)。通过每天两次施用本发明的组合物(在荷荷巴油中含有1.5％(w/w)八氢番茄红素)来处理志愿者的面部皮肤最多28天。使用mexametermx 18装置(由courage+khazaka electronic gmbh，germany提供)评估肤色，以评估受试者的黑色素水平。从图8中所示的结果看出，施用本发明的组合物14天导致黑素指数平均降低6％，而处理28天导致平均降低10％，表明由于这种处理，皮肤增亮显著增加。使用mexametermx 18装置评估皮肤发红。图9表明与治疗前的初始测量相比，治疗后在14天和28天时间点的红斑显著减少。使用基于抽吸的装置，cutometermpa 580(由courage+khazaka electronicgmbh，germany分销)评估皮肤紧致度和皮肤弹性。图10显示在14天和28天时间点的皮肤紧致度都提高(即，皮肤可变形性的深度降低)。类似地，如图11中所示，在这两个时间点观察到皮肤弹性的显著提高。使用primos 3d lite系统(由canfield scientific，new jersey，usa分销)评估皮肤光滑度。如图12中所示，在14天和28天时间点都观察到光滑度的显著提高。使用primos 3d lite系统进行皱纹分析。图13表明，尽管测量的各种参数(即，皱纹长度、深度、计数、体积和面积)都在28天处理后有所改善，但在皱纹数量方面看到最显著的变化(减少20％)。皮肤屏障功能 使用皮肤水合作用作为皮肤屏障功能的量度，并使用经表皮失水(tewl)装置进行评估。如图14中所示，用本发明的组合物处理导致在14天和28天时的水分流失都显著减少。皮肤舒缓 在将10％乳酸溶液施加于皮肤表面后，使用受试者生成的评分来评估本发明的组合物舒缓受刺激皮肤的能力。如图15中所见，用本发明的组合物处理14天导致刺激减少大于20％。在28天处理后，这种皮肤舒缓效果甚至更加显著，报告的刺激减少45％。实施例6包含本发明的组合物的面霜制剂将如上文所述制备并总结在图1中的本发明的含八氢番茄红素的油树脂与由上表中总结的成分制备的面霜制剂混合。该制剂的最终八氢番茄红素浓度为0.1％(w/w)。实施例7包含本发明的组合物的发乳制剂将如上文所述制备并总结在图1中的本发明的含八氢番茄红素的油树脂与由上表中总结的成分制备的发乳制剂混合。该制剂的最终八氢番茄红素浓度为0.1％(w/w)。实施例8含有本发明的八氢番茄红素组合物的可口服施用的软凝胶胶囊根据技术人员已知的标准程序制备八氢番茄红素油树脂软凝胶胶囊。各胶囊含有根据本发明制备的油树脂，以使所述胶囊中的八氢番茄红素的最终浓度在0.01-10％(w/w)的范围内。实施例9八氢番茄红素油树脂组合物对保护健康皮肤免受紫外线诱导的光氧化损伤的效果方法学一项双盲、安慰剂对照的平行组临床生物研究。在5周的导入期(在此期间限制摄入富含八氢番茄红素的食物和抗氧化剂补充剂)后，将受试者随机分配为每天接受制剂1软凝胶胶囊或作为安慰剂的相同外观的软凝胶胶囊，持续12周。受试者数量(计划和分析)60名受试者完成研究并进行分析。诊断和主要纳入标准健康男性和女性，20至65岁龄，fitzpatrick皮肤类型i至iv，bmi≤30kg/m2和健康饮食习惯。试验产品、剂量和施用模式每天口服施用1粒软凝胶胶囊(如上文的实施例8中所述)。参考疗法、剂量和施用方案每天口服施用安慰剂。治疗持续时间12周通过比色法测量的抗红斑保护比色法是使用比色计测量皮肤颜色的方法。使用l*a*b*标度测量皮肤的颜色，其中l*反映灰度标上的颜色明度，a*反映红色度vs.绿色度，并且b*反映蓝色度vs.黄色度。对受试者测试对uv照射诱导的红斑的保护。每个受试者在其皮肤区域上进行uv照射，并在照射后24小时测量红斑的发展。对于该分析，δa*被定义为在补充前在uv照射后24小时的红斑发展水平与在补充后在uv照射后24小时的红斑发展水平之间的差异。在制剂1和安慰剂组之间预料到红斑形成方面的统计学显著变化。细胞因子水平通过聚合酶链反应(pcr)评估平均il-1α、il-6、il-10和tnf-α水平。测定参与临床研究的受试者的il-1α、il-6、il-10和tnf-α水平。在随机化之前在uvb照射后和在用制剂1或安慰剂治疗12周后进行的uvb照射后获得样品。预期结果：来自皮肤活检的细胞因子mrna的分析在治疗组之间具有统计学显著性差异。实施例10本发明的组合物减少来自受刺激的嗜中性粒细胞的降解酶的分泌为了研究本发明的组合物对可能引起胶原蛋白损伤的酶的释放的影响，本发明人首先测定从活化的嗜中性粒细胞释放这些酶的动力学。嗜中性粒细胞被皮肤细胞在暴露于紫外线的过程中释放并活化的100ng/ml tnfa或100ng/ml il8活化。此外，用5x 107fmlp活化嗜中性粒细胞以供比较。嗜中性粒细胞被tnfa或il8活化4小时并被fmlp活化30分钟，以研究本发明的含八氢番茄红素的组合物对mmp-9或mpo释放的影响。在活化之前在37℃下将该组合物添加到嗜中性粒细胞中持续10分钟。测量对从受刺激的嗜中性粒细胞释放细胞因子的抑制，并且预期剂量依赖性抑制。实施例11本发明的含八氢番茄红素的组合物减少成纤维细胞-嗜中性粒细胞共培养物中的胶原蛋白损失为了研究本发明的组合物对由活化的嗜中性粒细胞诱导的胶原蛋白-3损伤的影响，本发明人使用培养的成纤维细胞和嗜中性粒细胞的最佳条件。将1x 105个成纤维细胞铺板24小时以获得铺满培养物。在每次处理中测量细胞活力。嗜中性粒细胞用本发明的组合物在37℃下温育10分钟，然后添加到培养物中24小时。通过密度测定法测定培养物中的胶原蛋白-3水平的定量。预计本发明的组合物在共培养物中的存在具有剂量依赖性的分泌前胶原-3的增加。用50mm h2o2处理nhdf细胞导致胶原蛋白lal分泌减少为大约1/10倍。预计本发明的组合物将完全消除胶原蛋白分泌的减少，表明该组合物在体内增加皮肤胶原蛋白水平和减少皮肤老化中的作用。

背景技术：

技术实现思路