Nf2、Wwc1和Wwc2基因敲除小鼠动物模型以及Ⅱ型神经纤维瘤原代细胞系的构建方法及应用

本发明涉及生物医药，尤其涉及nf2、wwc1和wwc2基因敲除小鼠动物模型以及ⅱ型神经纤维瘤原代细胞系的构建方法及应用。

背景技术：

1、ⅱ型神经纤维瘤(neurofibromatosis type 2)是一种遗传性神经系统肿瘤综合征，其主要致病因素是22号染色体上的neurofibromin 2(nf2)基因失活变异，但nf2功能缺失致病分子机制尚不明确。该疾病的发病率为每3万人中1人，是一种罕见病。目前针对该疾病的标准治疗方法主要是手术治疗和放疗。然而，手术治疗具有较高的神经组织损伤风险，并可能发生耳聋或死亡等并发症。现有治疗方法，包括贝伐单抗，虽然在神经纤维瘤的治疗中显示出一定的疗效，但是长期使用也伴随高血压、疲劳和头疼等副作用。因此，迫切需要开发新型的靶向治疗方法。

2、动物肿瘤模型和原代肿瘤细胞系对于药物开发以及开展临床前研究具有重要意义，现有研究通过在小鼠的施旺细胞中特异性敲除nf2基因进行神经纤维瘤的动物肿瘤模型。然而，单纯的nf2基因缺失所引起的神经纤维瘤进展十分缓慢，往往在小鼠生命晚期才发生，并且发病率也较低，这大大限制了该类小鼠模型以及相应原代肿瘤细胞系在临床前研究中的应用。开发能够快速发生的、致病率高的小鼠神经纤维瘤模型以及相应的肿瘤细胞系具有重要价值与意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供nf2、wwc1和wwc2基因敲除小鼠动物模型以及ⅱ型神经纤维瘤原代细胞系的构建方法及应用。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

3、本发明第一方面是提供一种nf2、wwc1和wwc2基因敲除小鼠动物模型的构建方法，包括如下步骤：

4、步骤一，采用es细胞打靶的方式，分别构建nf2、wwc1、wwc2的条件性敲除小鼠，获得各自的纯合f1代小鼠后，再分别将3种基因的小鼠进行杂交，经过多代杂交后最终获得基因型为nf2-/-；wwc1-/-；wwc2-/-的小鼠；

5、步骤二，利用施旺细胞特异性的cre工具小鼠plp1-creert2，将所述cre工具小鼠与所述基因型为nf2-/-；wwc1-/-；wwc2-/-的小鼠进行杂交，最终获得nf2-/-；wwc1-/-；wwc2-/-；plp1-creert2小鼠。

6、进一步地，所述nf2-/-；wwc1-/-；wwc2-/-；plp1-creert2小鼠在经过tamoxifen诱导plp1-cre表达后，即可以实现在小鼠施旺细胞中同时敲除nf2、wwc1和wwc2这3种基因。

7、本发明第二方面是提供一种ⅱ型神经纤维瘤原代细胞系的构建方法，nf2-/-；wwc1-/-；wwc2-/-；plp1-creert2小鼠在经过tamoxifen诱导plp1-cre表达7-8月后自发形成皮下神经鞘瘤，通过对皮下神经鞘瘤的分离和原代培养即可以获得ⅱ型神经纤维瘤原代细胞系。

8、本发明第三方面是提供上述nf2、wwc1和wwc2基因敲除小鼠动物模型在制备和筛选治疗ⅱ型神经纤维瘤药物中的应用。

9、本发明第四方面是提供上述ⅱ型神经纤维瘤原代细胞系在制备和筛选治疗ⅱ型神经纤维瘤药物中的应用。

10、本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

11、本发明在小鼠施旺细胞中同时特异性敲除nf2、wwc1和wwc2这3个基因，构建了快速发生的神经纤维瘤小鼠模型，该模型稳定性强稳定遗传，与人类ⅱ型神经纤维瘤表现类似，可为制备和筛选治疗ⅱ型神经纤维瘤药物提供经济、简单、可靠的动物模型。此外，由该小鼠模型衍生的原代肿瘤细胞系能够表达人类ⅱ型神经纤维瘤的特异性分子标志，有利于在临床前研究中进行药物筛选及分子机制的研究。

技术特征：

1.一种nf2、wwc1和wwc2基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，采用es细胞打靶的方式，分别构建nf2、wwc1、wwc2的条件性敲除小鼠。

4.一种ⅱ型神经纤维瘤原代细胞系的构建方法，其特征在于，nf2-/-；wwc1-/-；wwc2-/-；plp1-creert2小鼠在经过tamoxifen诱导plp1-cre表达7-8月后自发形成皮下神经鞘瘤，通过对皮下神经鞘瘤的分离和原代培养即可以获得ⅱ型神经纤维瘤原代细胞系；其中，所述nf2-/-；wwc1-/-；wwc2-/-；plp1-creert2小鼠由权利要求1-3任一项所述的构建方法构建得到。

5.nf2、wwc1和wwc2基因敲除小鼠动物模型在制备和筛选治疗ⅱ型神经纤维瘤药物中的应用，所述nf2、wwc1和wwc2基因敲除小鼠动物模型由权利要求1-3任一项所述的构建方法构建得到。

6.ⅱ型神经纤维瘤原代细胞系在制备和筛选治疗ⅱ型神经纤维瘤药物中的应用，所述ⅱ型神经纤维瘤原代细胞系由权利要求4所述的构建方法构建得到。

技术总结本发明公开了Nf2、Wwc1和Wwc2基因敲除小鼠动物模型以及Ⅱ型神经纤维瘤原代细胞系的构建方法及应用。Nf2、Wwc1和Wwc2基因敲除小鼠动物模型包括如下步骤：步骤一，分别构建Nf2、Wwc1、Wwc2的条件性敲除小鼠，获得各自的纯合F1代小鼠后，再分别将3种基因的小鼠进行杂交，经过多代杂交后最终获得基因型为Nf2‑/‑；Wwc1‑/‑；Wwc2‑/‑的小鼠；步骤二，将Cre工具小鼠与基因型为Nf2‑/‑；Wwc1‑/‑；Wwc2‑/‑的小鼠进行杂交，最终获得Nf2‑/‑；Wwc1‑/‑；Wwc2‑/‑；Plp1‑CreERT2小鼠。本发明在小鼠施旺细胞中同时特异性敲除Nf2、Wwc1和Wwc2这3个基因，构建了快速发生的神经纤维瘤小鼠模型，该模型稳定性强稳定遗传，与人类Ⅱ型神经纤维瘤表现类似，可为制备和筛选治疗Ⅱ型神经纤维瘤药物提供经济、简单、可靠的动物模型。技术研发人员：余发星,王雪莹,朱锐受保护的技术使用者：复旦大学技术研发日：技术公布日：2024/8/27