一种芍药甘草汤复方制剂和/或白芍及其制剂中化学成分的分离方法或者指纹图谱的构建方法与流程

本发明属于中药的质量检测，具体涉及一种芍药甘草汤复方制剂和/或白芍及其制剂中化学成分的分离方法或者指纹图谱的构建方法。

背景技术：

1、芍药甘草汤始载于东汉医家张仲景所著《伤寒论》，由芍药、甘草两味药组成，临床应用历史悠久，安全性高，疗效确切。该方配伍精简，具有和营散逆，舒挛止痛的功效。经典名方对药材来源、饮片炮制、配伍比例、制备工艺等进行了严格要求。由于经典名方成分复杂，建立经典名方的质量标准，将经典名方中有效成分量化，更有利保证传统古方的质量及疗效。根据芍药甘草汤的主治，方中芍药为白芍，白芍味苦酸、微寒，入肝经，酸能收敛、微寒养血滋阴。中医认为肝主筋，所以白芍可以养血柔肝、柔筋，缓解筋脉的拘急、痉挛。甘草味甘，能缓急，被尊称为“国老”，能入脾补养气血，与白芍相配能养血柔肝、缓急止痛，所以本方适合于痉挛性的疼痛类疾病。

2、目前，关于芍药甘草汤质量控制的文献中，主要是构建指纹图谱和建立了部分化学成分的质量检测，如甘草苷、甘草酸、芍药苷等，但现有的检测方法需要配制成不同的浓度，多次进样才能对多种物质进行检测，检测过程繁琐，虽有报道17个含量测定成分的方法，但是未见对有效成分异甘草苷芹糖的检测，部分成分的分离度未达到定量分析的要求，且未用指纹图谱对其整体评价。因此，目前的方法缺乏同时兼顾多个有效成分和指纹图谱的方法来全面评价芍药甘草汤的质量。

技术实现思路

1、因此，本发明的目的在于提供一种芍药甘草汤复方制剂和/或白芍及其制剂中化学成分的分离方法或者指纹图谱的构建方法，该方法根据芍药甘草汤复方制剂的特点，建立该品种的指纹图谱，实现各特征峰有效分离，提高特征峰的个数，提高分离效果，能够有效、准确、全面地检测芍药甘草汤复方制剂。

2、具体的，本发明公开了一种芍药甘草汤复方制剂和/或白芍及其制剂中化学成分的分离方法或者指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：

3、(1)供试品溶液的制备；

4、(2)取供试品溶液采用高效液相色谱法检测，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-含磷酸的水溶液为流动相进行梯度洗脱；梯度洗脱程序包括：0→5min→23min→36min→40min→64min，流动相中乙腈的体积百分数为：3-7％→3-7％→20％→20％→30％→55％。

5、进一步的，步骤(1)包括：称取供试品，采用提取溶剂进行提取，固液分离，取液体，即为供试品溶液；优选的，所述步骤(1)还满足如下a-d中的任意一项或者多项：

6、a、供试品的质量与提取溶剂的体积比为0.05-0.2:10-100，其中，质量与溶剂的配比关系为g/ml；

7、b、所述固液分离选自过滤或者离心；

8、c、提取溶剂选自水、甲醇和乙醇中的至少一种；优选为50％-70％的甲醇水溶液；

9、d、所述提取为超声提取，提取时间为10-60min。

10、进一步的，步骤(2)还满足如下1)-6)项中的任意一项或者多项：

11、1)所述梯度洗脱程序还包括：64min→65min，流动相中乙腈的体积百分数为：55％→55％；

12、2)所述含磷酸的水溶液中磷酸的体积百分数为0.05％-0.1％；

13、3)检测波长为235-270nm，优选为235-239nm；

14、4)流速为0.8-1.2ml/min，优选为1.0ml/min；

15、5)采用规格为250×4.6mm，5μm的色谱柱；

16、6)柱温为25-35℃，优选为30℃。

17、进一步的，所述的构建方法还包括采用没食子酸、儿茶素、没食子酸甲酯、对羟基苯甲酸、芍药苷、芍药内酯苷、芹糖甘草苷、甘草苷、没食子酸芍药苷、1，2，3，4，6-五没食子酸葡萄糖、异甘草苷芹糖、异甘草苷、甘草素、苯甲酰芍药苷、异甘草素、甘草酸中的一种或者多种制备对照品溶液的步骤，以及上述任一所述的构建方法中的高效液相色谱法检测对照品溶液的步骤；

18、优选的，还包括采用外标法计算供试品溶液中各对照品的含量的步骤；

19、优选的，每1ml的所述对照品溶液含各对照品1-500μg；

20、优选的，对照品溶液的溶剂选自甲醇溶液(例如，30-70％甲醇水溶液)或者纯甲醇。

21、优选的，所述的方法还包括采用外标法或校正因子法测定供试品溶液中对照品的含量的步骤；优选的，当供试品为芍药甘草汤复方制剂时，同时采用没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷、芹糖甘草苷、甘草苷、异甘草苷芹糖、异甘草苷、甘草素、甘草酸为对照品，测定供试品中各对照品的含量；

22、优选的，当供试品为白芍及其制剂时，同时采用芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷为对照品，测定供试品溶液中各对照品的含量。

23、在本发明的一些具体的实施方式中，以白芍及其制剂为供试品构建供试品溶液，同时以芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷为对照品构建对照品溶液，取供试品溶液和对照品溶液采用上述任一所述的高效液相色谱法检测；获得白芍及其制剂中各对照品的含量。采用本发明的方法不仅可以一次制样同时测定白芍及其制剂的芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷的含量，而且可结合分析芍药甘草汤复方制剂中上述指标成分的含量，计算转移率，更好地控制原料药和复方制剂的质量。

24、进一步的，所述芍药甘草汤复方制剂选自芍药甘草汤、芍药甘草汤固体制剂中的一种或者多种；

25、所述白芍及其制剂选自白芍药材、白芍饮片、白芍制剂中的一种或者多种。

26、其中，本发明中所述制剂或者复方制剂为本领域常规剂型，例如片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂等。

27、进一步的，所述芍药甘草汤固体制剂的指纹图谱具有24个共有峰，峰1为没食子酸；峰2为儿茶素；峰5为芍药内酯苷；峰6为芍药苷；峰7为芹糖甘草苷；峰8为甘草苷；峰9为没食子酸芍药苷；峰10为异甘草苷芹糖；峰12为异甘草苷；峰14为甘草素；峰17为苯甲酰芍药苷；峰22为甘草酸；和/或，所述芍药甘草汤固体制剂的指纹图谱具有24个共有峰，峰6与芍药苷对照品参照峰的保留时间相对应，以与芍药苷对照品参照峰相对应的峰为峰s，峰1-峰24与峰s的相对保留时间在规定值的±10％的范围之内；峰1-峰24的规定值依次为：0.299、0.782、0.821、0.916、0.942、1.000、1.130、1.154、1.392、1.700、1.723、1.735、1.766、1.828、1.901、1.907、1.960、1.984、2.002、2.102、2.118、2.188、2.277、2.310。

28、进一步的，所述白芍及其制剂的指纹图谱具有6个共有峰，峰1为没食子酸，峰2为儿茶素，峰3为芍药内酯苷，峰4为芍药苷，峰5为1，2，3，4，6-五没食子酸葡萄苷，峰6为苯甲酰芍药苷；和/或，所述白芍及其制剂的指纹图谱具有6个共有峰，峰4与芍药苷对照品参照峰的保留时间相对应，以与芍药苷对照品参照峰相对应的峰为峰s，峰1-峰6与峰s的相对保留时间在规定值的±10％的范围之内；峰1-峰6的规定值依次为：0.256、0.745、0.937、1.000、1.252、2.068。

29、进一步的，所述外标法包括标准曲线法或者外标一点法。

30、对于标准曲线法：包括构建一系列浓度的包含没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷、芹糖甘草苷、甘草苷、异甘草苷、异甘草苷芹糖、苯甲酰芍药苷、甘草素、甘草酸铵的对照品溶液，并分别注入液相色谱仪，分别制得没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷、芹糖甘草苷、甘草苷、异甘草苷、异甘草苷芹糖、苯甲酰芍药苷、甘草素、甘草酸铵的标准曲线，根据所述标准曲线，计算供试品溶液中没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷、芹糖甘草苷、甘草苷、异甘草苷、异甘草苷芹糖、苯甲酰芍药苷、甘草素、甘草酸铵的含量。

31、各对照品溶液可以单独制备，也可以混合制备成混合对照品溶液。

32、本发明还提供了一种芍药甘草汤复方制剂和/或白芍及其制剂的质量检测或者鉴别方法，包括将待检测产品按照上述任一所述的方法构建得到待检测产品的指纹图谱。

33、通过中药色谱指纹图谱相似性评价系统软件对比待检测产品指纹图谱与本发明构建的指纹图谱(例如对照指纹图谱)，相似度大于0.9可判断样品质量的一致性。

34、所述待检测产品可以为芍药甘草汤复方制剂和/或白芍及其制剂。

35、本发明技术方案，具有如下优点：

36、1.本发明所述的芍药甘草汤复方制剂和/或白芍及其制剂中化学成分的分离方法或者指纹图谱的构建方法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-含磷酸的水溶液为流动相进行梯度洗脱，并通过反复试验得到洗脱程序，在本发明的洗脱条件下，构建得到具有多个共有特征峰的指纹图谱，并实现没食子酸、儿茶素、没食子酸甲酯、对羟基苯甲酸、芍药苷、芍药内酯苷、芹糖甘草苷、甘草苷、没食子酸芍药苷、1，2，3，4，6-五没食子酸葡萄糖、异甘草苷芹糖、异甘草苷、甘草素、苯甲酰芍药苷、异甘草素、甘草酸中一种或者多种的有效分离和指认，明显提高了这些化学成分的分离度，节约检测时间和成本，峰形良好且无干扰，从而能够快速、准确、全面地检测芍药甘草汤复方制剂和/或白芍及其制剂的质量。

37、同时，该液相条件可作为白芍的色谱条件，能有效分离芍药甘草汤复方制剂的原料药(例如白芍)的多个有效成分，进而实现这些有效成分的含量测定，作为药材、饮片的质量控制的方法，便于从饮片-基准样品量值传递规律的评价。

38、2.本发明所述的芍药甘草汤复方制剂和/或白芍及其制剂中化学成分的分离方法或者指纹图谱的构建方法，通过优化色谱条件以及提取溶剂种类、提取时间等提取条件进行考察，确定了最佳提取工艺和色谱条件，使得峰面积更高，分离效果更好，能够更加全面的对芍药甘草汤复方制剂和/或白芍及其制剂进行质量监控。

39、3.本发明所述的芍药甘草汤复方制剂和/或白芍及其制剂中化学成分的分离方法或者指纹图谱的构建方法，可以同时测定芍药甘草汤复方制剂中10种有效成分的含量以及白芍及其制剂中共3种有效成分(芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷)的含量。测定方法简单、快速、准确，线性关系良好，精密度高、稳定性好，重复性好，满足分析方法的要求。以一次样品制备、一次进样分析，同时完成定性和定量分析。并通过药材、饮片、基准样品的量值传递规律，选择质量稳定的药材用于经典名方芍药甘草汤的制备。

40、4.本发明所述的芍药甘草汤复方制剂和/或白芍及其制剂中化学成分的分离方法或者指纹图谱的构建方法，甘草苷和芹糖甘草苷的不容易满足药典标准(r≥1.5)的要求，在乙腈(a)-0.1％磷酸(b)和乙腈(a)-0.0.05％磷酸(b)下分离效果有差别，且在甲醇溶剂中，溶剂效应比较明显，本发明通过优选采用乙腈(a)-0.05％磷酸水(b)为流动相，采用50％-70％甲醇为提取溶剂显著提高了甘草苷和芹糖甘草苷的分离效果。