一种基于pH响应型树状大分子纳米凝胶的mRNA肿瘤疫苗及其制备方法和应用

本发明属于生物医药领域，特别涉及一种基于ph响应型树状大分子纳米凝胶的mrna肿瘤疫苗及其制备方法和应用。

背景技术：

1、肿瘤疫苗是指利用抗原性的物质诱导机体产生特异性免疫应答，从而防御和治疗肿瘤的一种药物，是目前主流的抗肿瘤免疫疗法之一。根据疫苗制剂中抗原性物质的不同，肿瘤疫苗可以分为全细胞疫苗、核酸疫苗和多肽疫苗等。其中，基于信使rna(mrna)的疫苗成为了受到最多关注的疫苗类型之一(nat.rev.cancer 2021,21(6):360-378)。mrna疫苗编码和引入肿瘤相关抗原(taas)、肿瘤特异性抗原(tsas)或其他肿瘤相关细胞因子至树突状细胞(dcs)中，触发主要组织相容性复合物(mhc)-i介导的细胞毒性cd8+t细胞反应，以实现对高表达特定抗原的肿瘤类型的治疗或/和预防效果(nat.rev.drugdiscovery 2014,13(10):759-780)。与其他肿瘤疫苗制剂相比，mrna肿瘤疫苗能够直接在细胞质中翻译和表达抗原，具有可快速扩大生产、良好耐受性和安全性(不整合到宿主基因组中)以及低成本等优势(mol.ther.2015,23(9):1456-1464；expert opin.biol.ther.2021,21(2):201-218)。截至目前，已经有超过二十种mrna肿瘤疫苗成功步入临床试验(lancet oncol.2022,23(10):e450-e458)。然而，mrna易降解且呈负电荷，极大地限制了其细胞摄取以及体循环稳定性。因此，开发高效的mrna传递系统对于mrna肿瘤疫苗的研发十分重要。

2、随着纳米技术的不断发展，许多纳米平台已被广泛应用于mrna等核酸分子的递送。例如，脂质纳米粒子(lnps)已经被用于临床前或临床mrna疫苗制剂中，以防止mrna降解并促进其细胞内传递和内体/溶酶体逃逸(nat.mater.2021,20(5):701-710；nat.rev.mater.2021,6(12):1078-1094)。最近，为了避免lnps相关的过度炎症副作用，有研究者开发了聚合物纳米颗粒(adv.mater.2023,35(3):2207471)、lnp/聚合物杂化纳米颗粒(nanoscale 2019,11(45):21782-21789)和天然纳米囊泡(adv.mater.2022,34(20):2109984)等mrna载体，实现了较为安全的mrna递送。然而，开发具有良好生物安全性又能有效传递mrna的功能性或响应型纳米平台仍然具有挑战性。在常见的纳米平台中，具有形态可调、刺激响应和良好胶体稳定性等特性的聚合物纳米凝胶(ngs)目前日益受到关注。ngs是水溶胀胶体，由于其柔性和流动性，可以被细胞轻松内吞，但其用于载药时，简单的物理包封可能会使纳米凝胶中的药物或其他活性成分突然释放，导致不可预测的效果(actabiomater.2019,92:1-18；biomater.sci.2016,4(10):1422-1430)。通过改变ngs的单体、交联剂和引发剂，可以在ngs中引入各种功能性基团和刺激响应性能，从而合成具有良好药物负载能力的适应性ng系统，实现特定内源/外源刺激响应的药物释放(eur.j.pharm.biopharm.2020,157:121-153；prog.polym.sci.2019,99:101164)。同时，树状大分子，尤其是具有明确结构、球形形状和丰富氨基末端的pamam树状大分子，能够作为各种功能物质(包括但不限于成像剂(macromol.biosci.2020,20(2):1900282)、药物(chem.soc.rev.2018,47(2):514-532)、蛋白质(nanolett.2017,17(3):1678-1684；sci.adv.2019,5(6):eaaw8922)和mrna等(acs appl.bio mater.2020,3(9):5590-5605)的优良载体材料，长期以来一直受关注。但其细胞毒性和较弱的稳定性限制了其广泛应用。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供一种基于ph响应型树状大分子纳米凝胶的mrna肿瘤疫苗及其制备方法和应用。

2、本发明提供一种树状大分子纳米凝胶，所述纳米凝胶为聚酰胺-胺树状大分子与交联剂交联的纳米凝胶；其中交联剂为双对醛基苯甲酯聚乙二醇；所述聚酰胺-胺树状大分子为苯硼酸和甘露糖修饰的第三代树状大分子。

3、进一步地，所述双对醛基苯甲酯聚乙二醇的分子量为2000da。

4、本发明提供一种树状大分子纳米凝胶的制备方法，包括：

5、(1)将4-溴甲基苯硼酸、氨基末端的g3 pamam树状大分子、溶剂混合，搅拌反应，纯化，得到苯硼酸pba修饰的树状大分子g3-pba；

6、(2)将g3-pba、甘露糖man、水混合，搅拌反应，纯化，得到pba和man修饰的树状大分子g3-pba-man；

7、(3)将g3-pba-man、交联剂、水混合，得到水相，然后将水相加入油相中，初步形成油包水乳液，超声均化处理，加入乙二胺引发交联反应，并搅拌过夜，纯化，得到树状大分子纳米凝胶。

8、优选地，所述步骤(1)中pamam树状大分子与4-溴甲基苯硼酸摩尔比为1:8～1:10；

9、优选地，步骤(1)中溶剂为二甲基亚砜dmso；搅拌反应温度为70℃，时间24～48h；所述提纯为：使用截留分子量mwco为3500～5000的透析膜，通过2～2.5l的水透析，在2～3天内换水8～9次；所述纯化后进行冷冻干燥。

10、优选地，所述步骤(2)中g3-pba与甘露糖的摩尔比为1:50～1:100；

11、优选地，所述搅拌反应时间为48～72h；所述纯化为使用截留分子量mwco为3500～5000的透析膜，通过2～2.5l的水透析，在2～3天内换水8～9次；所述纯化后进行冷冻干燥。

12、优选地，所述步骤(3)中交联剂为双对醛基苯甲酯聚乙二醇其中n＝44～46。

13、所述双对醛基苯甲酯聚乙二醇fba-peg-fba的制备方法，包括：

14、将peg溶于溶剂中，加入对醛基苯甲酸fba、1,3-二环己基碳二亚胺dcc和4-二甲氨基吡啶dmap，搅拌12-24h，反应结束后，提纯，冷冻干燥，得到交联剂fba-peg-fba。

15、fba-peg-fba的制备方法中：peg与fba、dcc、dmap的投料摩尔比为1:4:4:0.5；所述提纯用水萃取获取水相，使用截留分子量mwco为500～1000的透析膜，通过2～2.5l的水透析，在2～3天内换水8～9次。

16、优选地，所述步骤(3)中g3-pba-man树状大分子与交联剂的摩尔比为1:4～1:8；

17、优选地，所述步骤(3)油相为司盘80、吐温80、己烷混合液，其中司盘80、吐温80、己烷的比例为(115:23:5～117:23:5，mg/mg/ml)；

18、优选地，所述步骤(3)所述水相、油相、乙二胺的体积比1:10:0.5～1:12:5。

19、优选地，所述步骤(3)中20w超声均化处理时间10～15min；所述纯化为反应液离心，弃上清，加入乙醇重悬沉淀，将重悬液置于mwco为8000-14000的透析袋中，在通过2～2.5l的水透析，在2～3天内换水8～9次。其中离心转速和时间选择12000rpm离心10min。

20、本发明提供一种载药树状大分子纳米凝胶，所述载药树状大分子纳米凝胶为所述树状大分子纳米凝胶负载肿瘤抗原肽。

21、优选地，所述肿瘤抗原肽为mrna；所述树状大分子纳米凝胶与mrna的n/p为0.5～15:1；其中n/p为纳米凝胶中的伯胺基团与核酸中的磷酸基团比例；mrna包括gp100 mrna。

22、本发明提供一种载药树状大分子纳米凝胶的制备方法，包括：将所述树状大分子纳米凝胶、肿瘤抗原肽混合，得到载药树状大分子纳米凝胶，也即基于ph响应型树状大分子纳米凝胶的mrna肿瘤疫苗。

23、本发明提供一种所述载药树状大分子纳米凝胶在制备治疗和预防肿瘤药物或肿瘤疫苗中的应用，如黑色素瘤。

24、本发明基于修饰了pba和甘露糖的g3 pamam树状大分子合成了负载gp100 mrna的pamam纳米凝胶。实验结果表明该纳米凝胶具有优良的生物相容性，ph响应性的药物释放，良好的细胞mrna转染效果，能够促进dcs熟化和特异性肿瘤抗原递呈，促进免疫响应，在小鼠体内实施肿瘤免疫治疗及预防，有效抑制肿瘤生长和复发。

25、本发明使用核磁共振氢谱、傅里叶变换红外光谱(ftir)、动态光散射(dls)、琼脂糖凝胶电泳、扫描电子显微镜(sem)、透射电子显微镜(tem)和原子力显微镜(afm)等手段对所合成的树状大分子及纳米凝胶进行了表征；通过cck-8实验在体外验证了纳米凝胶的细胞相容性；采用流式细胞术研究了纳米疫苗的细胞吞噬效果、细胞转染效果、促进dcs熟化效果和细胞摄取机制等；在小鼠体内构建b16f10黑色素瘤皮下瘤模型，通过瘤周注射，监测小鼠肿瘤体积和体重变化，探究了肿瘤mrna疫苗的抗肿瘤治疗效果及预防肿瘤复发疗效；采用小动物荧光成像研究了肿瘤mrna疫苗在淋巴结部位的蓄积和生物分布情况；通过主要脏器的苏木精-伊红染色法(h&e)染色和血常规等测试验证了肿瘤mrna疫苗的生物安全性。

26、有益效果

27、(1)本发明操作工艺简单，反应条件温和，易于纯化，所用的合成原料均为环境友好型材料，具有产业化实施前景；

28、(2)本发明制备的基于ph响应型树状大分子纳米凝胶的mrna肿瘤疫苗能够实现良好的细胞内mrna转染效果，促进dcs熟化和抗原递呈及后续免疫响应，在小鼠体内有效抑制肿瘤生长，实现优良的肿瘤免疫治疗效果。

29、(3)本发明制备的基于ph响应型树状大分子纳米凝胶的mrna肿瘤疫苗在肿瘤疫苗方面具有应用潜力。