一种用于依托咪酯毛发检测的免疫层析试纸的金标垫处理液及应用的制作方法

本发明涉及毒品免疫检测，尤其涉及一种用于依托咪酯毛发检测的免疫层析试纸的金标垫处理液及应用。

背景技术：

1、依托咪酯，为非巴比妥类静脉短效催眠药，被用作静脉麻醉剂，由于静脉注射后作用迅速而短暂，在临床上主要用于全麻诱导及短时手术麻醉。其药理作用包括镇静、催眠、抗焦虑和肌肉松弛。它可以通过抑制中枢神经系统的兴奋，使人产生镇静和安静的感觉，同时促进睡眠，延长睡眠时间。

2、目前毛发中依托咪酯的检测方法未见报道，毛发中依托咪酯含量较低，因此需要高灵敏度依托咪酯毛发检测试剂，传统的毛发检测试剂盒中金标垫玻璃纤维常见成分是奥斯龙6613的玻璃纤维，市面上常见的用于胶体金金标垫的玻璃纤维只能做到较低灵敏度，不能满足毛发中依托咪酯检测需求。金标垫决定了标记有相应蛋白的胶体金颗粒的活性，包括灵敏度和特异性、释放效果以及长期的稳定性，而不同的金标垫处理液对金标垫的影响较大。

3、因此，如何筛选出一种用于依托咪酯毛发检测金标垫玻璃纤维以及金标垫处理液，增强依托咪酯毛发检测的灵敏度已成为目前亟待解决的问题。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种用于依托咪酯毛发检测的免疫层析试纸的金标垫处理液及应用，所述金标垫玻璃纤维处理液可以显著提升用于依托咪酯毛发检测的免疫层析试纸的准确性、稳定性和灵敏度。

2、为达此目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一种用于依托咪酯毛发检测的免疫层析试纸的金标垫玻璃纤维处理液，所述金标垫玻璃纤维处理液包括磷酸氢二钠、牛血清蛋白、曲拉通x-100和proclin300。

4、本发明中金标垫玻璃纤维处理液采用磷酸氢二钠、牛血清蛋白、曲拉通x-100和proclin300的组合，能够显著提升依托咪酯毛发检测的准确性、稳定性和灵敏度，上述组分具有协同增效的作用，缺少任何一种都会对效果有较大的影响。

5、优选地，所述金标垫玻璃纤维处理液中，磷酸氢二钠的终浓度为4-6g/l，牛血清蛋白的终浓度为0.05-0.4g/l，曲拉通x-100的终浓度为0.05-2ml/l，proclin300的终浓度为0.05-0.4g/l。所述4-6g/l，例如可以是4g/l、4.5g/l、5g/l、5.5g/l或6g/l等。所述0.05-0.4g/l，例如可以是0.05g/l、0.1g/l、0.15g/l、0.2g/l、0.25g/l、0.3g/l、0.35g/l或0.4g/l等。所述0.05-2ml/l，例如可以是0.05ml/l、0.2ml/l、0.4ml/l、0.6ml/l、0.8ml/l、1.0ml/l、1.2ml/l、1.4ml/l、1.6ml/l、1.8ml/l或2ml/l等。所述0.05-0.4g/l，例如可以是0.05g/l、0.1g/l、0.15g/l、0.2g/l、0.25g/l、0.3g/l、0.35g/l或0.4g/l等。

6、本发明中的金标垫玻璃纤维处理液中的各个组分的终浓度在上述范围内，更有利于金标蛋白的释放，能够显著提升检测的准确性以及灵敏度。

7、第二方面，本发明提供一种用于依托咪酯毛发检测的免疫层析试纸，所述免疫层析试纸包括底板和底板上依次层叠设置的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。

8、所述金标垫含有胶体金标记的依托咪酯单克隆抗体、胶体金标记的兔igg、磷酸氢二钠、牛血清蛋白、曲拉通x-100和proclin300。

9、所述金标垫的材质选自8964玻璃纤维或6613玻璃纤维。

10、所述硝酸纤维素膜上含有包被依托咪酯-抗原血红蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗兔igg的质控线。

11、本发明采用了磷酸氢二钠、牛血清蛋白、曲拉通x-100和proclin300为金标垫处理液，附着在用于依托咪酯毛发检测的免疫层析试纸，能够显著提升金标蛋白的释放。

12、本发明采用的金标垫的材质为8964玻璃纤维或6613玻璃纤维，对于目前毒品胶体金检测试剂盒中金标垫玻璃纤维，主要适用于尿液样本，用于毛发样本的毒品检测容易造成检验灵敏度低、特异性差和批间不稳定性，易导致假阴性结果和假阳性结果。本发明采用的玻璃纤维能够更好的适用在依托咪酯毛发检测中，更好的促进金标蛋白的释放，从而提升检测灵敏度。经试验检测得知金标垫玻璃纤维处理液中各个组分被其具有类似效果的试剂替代，都会极大降低检测的灵敏度，从而降低检测的准确性。

13、优选地，所述金标垫为8964玻璃纤维。

14、本发明采用8964玻璃纤维作为金标垫，相较于市售的玻璃纤维，能够显著提升检测的灵敏度，从而能够实现对毛发中微量的依托咪酯的检测，极大程度上扩大了依托咪酯检测的使用场景。

15、优选地，每20-50mm2所述金标垫玻璃纤维上，胶体金标记的依托咪酯单克隆抗体的含量为0.1-0.3μg，胶体金标记的兔igg的含量为0.1-1.5μg，磷酸氢二钠的含量为0.2-0.4mg，牛血清蛋白的含量为7-12μg，曲拉通x-100的含量为5.3-265μg，proclin300的含量为7-12μg。所述20-50mm2，例如可以是20 mm2、25 mm2、30 mm2、35 mm2、40 mm2、45 mm2或50mm2等。所述0.1-0.3μg，例如可以是0.1μg、0.15μg、0.2μg、0.25μg或0.3μg等。所述0.1-1.5μg，例如可以是0.1μg、0.5μg、0.6μg、0.8μg、1.0μg、1.2μg、1.4μg或1.5μg等。所述0.2-0.4mg，例如可以是0.2mg、0.25mg、0.3mg、0.35mg或0.4mg等。所述5.3-265μg，例如可以是5μg、10μg、50μg、100μg、150μg、200μg、250μg或265μg等。所述0.05-2ml/l，例如可以是0.05ml/l、0.2ml/l、0.4ml/l、0.6ml/l、0.8ml/l、1.0ml/l、1.2ml/l、1.4ml/l、1.6ml/l、1.8ml/l或2ml/l等。所述7-12μg，例如可以是7μg、8μg、9μg、10μg、11μg或12μg等。

16、优选地，所述金标垫玻璃纤维上还含有海藻糖和蔗糖。

17、每20-50mm2所述金标垫玻璃纤维上，海藻糖的含量为1-4μg，蔗糖的含量为6-12μg。所述20-50mm2，例如可以是20 mm2、25 mm2、30 mm2、35 mm2、40 mm2、45 mm2或50 mm2等。所述1-4μg，例如可以是1μg、2μg、3μg或4μg等。所述6-12μg，例如可以是6μg、7μg、8μg、9μg、10μg、11μg或12μg等。

18、优选地，所述样品垫上含有四硼酸钠、pvp、s17、酪蛋白、edta和proclin300。

19、优选的，每50-80mm2所述样品垫上，四硼酸钠的含量为1-4μg，pvp的含量为0.01-2μg，s17的含量为0.01-2μg，酪蛋白的含量为0.01-2μg，edta的含量为0.01-1μg，proclin300的含量为0.01-0.5μg。所述50-80mm2，例如可以是50 mm2、55 mm2、60 mm2、65 mm2、70 mm2、75mm2或80 mm2等。所述1-4μg，例如可以是1μg、2μg、3μg或4μg等。所述0.01-2μg，例如可以是0.01μg、0.1μg、0.2μg、0.4μg、0.6μg、0.8μg、1μg、1.2μg、1.4μg、1.6μg、1.8μg或2μg等。所述0.01-2μg，例如可以是0.01μg、0.1μg、0.2μg、0.4μg、0.6μg、0.8μg、1μg、1.2μg、1.4μg、1.6μg、1.8μg或2μg等。所述0.01-2μg，例如可以是0.01μg、0.1μg、0.2μg、0.4μg、0.6μg、0.8μg、1μg、1.2μg、1.4μg、1.6μg、1.8μg或2μg等。所述0.01-1μg，例如可以是0.01μg、0.1μg、0.2μg、0.3μg、0.4μg、0.5μg、0.6μg、0.7μg、0.8μg、0.9μg或1μg等。所述0.01-0.5μg，例如可以是0.01μg、0.1μg、0.2μg、0.3μg、0.4μg或0.5μg等。

20、优选地，所述样品垫的材质为玻璃纤维。

21、优选地，每1-8mm所述检测线上依托咪酯-抗原血红蛋白偶联物的含量为0.01-0.5μg，例如可以是0.01μg、0.1μg、0.2μg、0.3μg、0.4μg或0.5μg等。所述1-8mm，例如可以是1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm或8mm等。

22、优选地，每1-8mm所述质控线上羊抗兔igg的含量为0.01-1μg，例如可以是0.01μg、0.1μg、0.2μg、0.4μg、0.6μg、0.8μg或1mg/ml。所述1-8mm，例如可以是1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm或8mm等。

23、优选地，所述底板选自：聚氯乙烯板、聚氨酯板、聚乙烯板或聚酰亚胺板中的任意一种或至少两种的组合。

24、优选地，沿液体流动方向，所述样品垫的一端粘贴在金标垫玻璃纤维的一端上部，产生1-2mm的部分重叠；所述金标垫玻璃纤维的一端粘贴在硝酸纤维素膜的一端上部，产生1-2mm的部分重叠；所述吸水垫的一端粘贴在硝酸纤维素膜的一端上部，产生1-2mm的部分重叠。所述1-2mm例如可以是1mm、1.1mm、1.2mm、1.3mm、1.4mm、1.5mm、1.6mm、1.7mm、1.8mm、1.9mm或2mm等。

25、优选地，所述免疫层析试纸粘贴在底板上，放入毛发试剂卡中。

26、第三方面，本发明提供根据第二方面所述的用于依托咪酯毛发检测的免疫层析试纸的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：沿液体流动方向，将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次层叠粘贴在底板上，得到所述免疫层析试纸。

27、优选地，所述金标垫采用包括如下步骤的方法制备得到：

28、（1）将第一方面所述的金标垫玻璃纤维处理液均匀喷洒在金标垫上后进行干燥，干燥的温度为40-50℃，干燥的时间为12-24h；所述喷洒的量为0.5-1.5μl/cm；所述40-50℃，例如可以是40℃、42℃、44℃、46℃、48℃或50℃等。所述12-24h，例如可以是12h、14h、16h、18h、20h、22h或24h等。所述0.5-1.5μl/cm，例如可以是0.5μl/cm、0.6μl/cm、0.8μl/cm、1.0μl/cm、1.2μl/cm、1.4μl/cm或1.5μl/cm等。

29、（2）将胶体金标记的依托咪酯单克隆抗体和胶体金标记的兔igg稀释，配制成抗体稀释液，均匀喷洒在步骤（1）获得的金标垫上后进行干燥。

30、优选地，步骤（2）中所述抗体稀释液中胶体金标记的依托咪酯单克隆抗体的od值为20-40，例如可以是20、25、30、35或40等。

31、优选地，步骤（2）中所述抗体稀释液中胶体金标记的兔igg的od值为10-30，例如可以是10、15、20、25或30等。

32、优选地，步骤（2）中所述抗体稀释液中还添加有海藻糖和蔗糖。

33、优选地，所述抗体稀释液中，海藻糖的终浓度为0.01-0.1 mg/ml，蔗糖的终浓度为0.1-0.5 mg/ml。所述0.01-0.1mg/ml，例如可以是0.01mg/ml 、0.02mg/ml 、0.04mg/ml 、0.05mg/ml 、0.06mg/ml 、0.08mg/ml 或0.1 mg/ml等。所述0.1-0.5 mg/ml，例如可以是0.1mg/ml 、0.2 mg/ml 、0.3 mg/ml 、0.4 mg/ml 或0.5 mg/ml等。

34、优选的，步骤（2）中所述稀释的溶剂包括pbs溶液、丙二醇、乙醇或丁二醇中的任意一种。

35、优选地，步骤（2）中所述干燥的温度为40-50℃，干燥的时间为12-24h。所述40-50℃，例如可以是40℃、42℃、44℃、46℃、48℃或50℃等。所述12-24h，例如可以是12h、14h、16h、18h、20h、22h或24h等。

36、优选地，步骤（2）中所述喷洒的量为0.5-1.5μl/cm，例如可以是0.5μl/cm、0.6μl/cm、0.8μl/cm、1.0μl/cm、1.2μl/cm、1.4μl/cm或1.5μl/cm等。

37、优选地，所述胶体金标记的依托咪酯单克隆抗体采用包括如下步骤的方法制备得到：

38、将胶体金溶液与依托咪酯单克隆抗体混合反应，加入封闭液进行封闭反应，反应后离心收集沉淀，得到胶体金标记的依托咪酯单克隆抗体。

39、优选地，所述胶体金溶液的ph为7.2-8.5，例如可以是7.2、7.5、7.8、8.0、8.2或8.5等。

40、优选地，所述标记后的胶体金溶液的浓度为0.01%-0.04%，例如可以是0.01%、0.015%、0.02%l、0.025%l、0.03%l、0.035%l或0.04%l等。

41、优选地，所述依托咪酯单克隆抗体的浓度为1-10mg/ml，例如可以是1mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml或10mg/ml等。

42、优选地，所述依托咪酯单克隆抗体和胶体金的质量和体积比为（0.5-2）mg:100ml，所述（0.5-2）mg，例如可以是0.5 mg、0.6 mg、0.7 mg、0.8 mg、0.9 mg、1 mg、1.1 mg、1.2mg、1.3 mg、1.4 mg、1.5 mg、1.6 mg、1.7 mg、1.8 mg、1.9 mg或2 mg等。

43、优选地，所述封闭液为牛血清白蛋白溶液，浓度为50-200mg/ml，例如可以是50mg/ml、80mg/ml、110mg/ml、140mg/ml、170mg/ml或200mg/ml等。

44、优选地，所述封闭反应的时间为25-30min，例如可以是25min、26min、27min、28min、29min或30min等。

45、优选地，所述封闭液与混合物的体积比为（2-4）:10，所述（2-4）例如可以是2、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8或4等。

46、优选地，所述离心的速度为10000-12000r/min，离心的时间为10-20min。所述10000-12000r/min，例如可以是10000r/min、10200r/min、10400r/min、10600r/min、10800r/min、11000r/min、11200r/min、11400r/min、11600r/min、11800r/min或12000r/min等。所述10-20min，例如可以是10min、12min、14min、15min、16min、18min或20min等。

47、优选地，所述样品垫采用包括如下步骤的方法制备得到：将样品垫处理液均匀喷洒在样品垫上，干燥后制得。

48、优选地，所述样品垫处理液以质量浓度计包括0.01-0.1g/ml四硼酸钠、0.005-0.05g/ml pvp、0.005-0.05g/ml表面活性剂s17、0.0005-0.005g/ml酪蛋白、0.001-0.01g/ml edta和0.0001-0.001g/l proclin300。所述0.01-0.1g/ml，例如可以是0.01g/ml、0.02g/ml、0.04g/ml、0.06g/ml、0.08g/ml或0.1g/ml等。所述0.005-0.05g/ml，例如可以是0.005g/ml、0.01g/ml、0.02g/ml、0.03g/ml、0.04g/ml或0.05g/ml等。所述0.005-0.05g/ml，例如可以是0.005g/ml、0.01g/ml、0.02g/ml、0.03g/ml、0.04g/ml或0.05g/ml等。所述0.0005-0.005g/ml，例如可以是0.0005g/ml、0.001g/ml、0.002g/ml、0.003g/ml、0.004g/ml或0.005g/ml等。所述0.001-0.01g/ml，例如可以是0.001 g/ml、0.002 g/ml、0.004 g/ml、0.006 g/ml、0.008 g/ml或0.01 g/ml等。所述0.0001-0.001g/l，例如可以是0.0001g/l、0.0002g/l、0.0004g/l、0.0006g/l、0.0008g/l或0.001g/l等。

49、优选地，所述样品垫处理液的喷洒量为0.060-0.070ml/cm2，例如可以是0.060ml/cm2 、0.063ml/cm2 、0.065ml/cm2 、0.067ml/cm2 、0.069ml/cm2 或0.070 ml/cm2 等。

50、优选地，所述干燥的温度为40-50℃，干燥的时间为12-24h。所述40-50℃，例如可以是40℃、42℃、44℃、46℃、48℃或50℃等。所述12-24h，例如可以是12h、14h、16h、18h、20h、22h或24h等。

51、优选地，所述硝酸纤维素膜采用包括如下步骤的方法制备得到：

52、采用包被缓冲液稀释依托咪酯-抗原血红蛋白偶联物，用pbs缓冲液稀释羊抗兔igg，将依托咪酯-抗原血红蛋白偶联物溶液喷洒在nc膜上，形成检测线，将羊抗兔igg溶液喷洒在nc膜上，形成质控线，干燥后得到硝酸纤维素膜。

53、优选地，所述包被缓冲液包括磷酸缓冲液。

54、优选地，所述依托咪酯-抗原血红蛋白偶联物溶液中依托咪酯-抗原血红蛋白偶联物的浓度为0.01-1.0mg/ml，例如可以是0.01mg/ml、0.05mg/ml 、0.1mg/ml 、0.2mg/ml 、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml或1.0mg/ml等。

55、优选地，所述羊抗兔igg溶液中羊抗兔igg的浓度为0.5-2mg/ml，例如可以是0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml或2mg/ml等。

56、优选地，所述依托咪酯-抗原血红蛋白偶联物溶液的喷洒量为0.5-1.5μl/cm，例如可以是0.5μl/cm、0.6μl/cm、0.8μl/cm、1.0μl/cm、1.2μl/cm、1.4μl/cm或1.5μl/cm等。

57、优选地，所述羊抗兔igg溶液的喷洒量为0.5-1.5μl/cm，例如可以是0.5μl/cm、0.6μl/cm、0.8μl/cm、1.0μl/cm、1.2μl/cm、1.4μl/cm或1.5μl/cm等。

58、优选地，所述干燥的温度为40-50℃，干燥时间为20-28h。所述40-50℃，例如可以是40℃、42℃、44℃、46℃、48℃或50℃等。所述20-28h，例如可以是20h、21h、22h、23h、24h、25h、26h、27h或28h等。

59、第四方面，本发明提供一种用于依托咪酯毛发检测的检测试剂盒，所述试剂盒包括：第二方面所述的用于依托咪酯毛发检测的免疫层析试纸和毛发裂解液。

60、优选地，所述毛发裂解液按重量份数计包括：0.1-1份的pvp-10000、1-10份的亚硫酸钠、0.1-1份的酪蛋白、0.5-2份的角蛋白酶和5-10份的proclin300。所述的0.1-1份，例如可以是0.1份、0.2份、0.4份、0.6份、0.8份或1份等。所述1-10份，例如可以是1份、2份、3份、4份、5份、6份、7份、8份、9份或10份等。所述0.5-2份，例如可以是0.5份、1份、1.5份或2份等。所述5-10份，例如可以是5份、6份、7份、8份、9份或10份等。

61、本发明提供的用于依托咪酯毛发检测的检测试剂盒，基于上述制备的依托咪酯毛发检测的免疫层析试纸，能够快速高效的检测出毛发中的微量依托咪酯，操作简单，可适用于非该领域技术人员，极大程度上扩大了依托咪酯检测的使用场景，并提供了便利条件。

62、与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

63、1.本发明创造性地将磷酸氢二钠、牛血清蛋白、曲拉通x-100和proclin300组合制备为金标垫的玻璃纤维处理液，能够显著提升依托咪酯毛发检测的准确性、稳定性和灵敏度，上述组分具有协同增效的作用，缺少任何一种都会对效果有较大的影响。

64、2.本发明采用8964玻璃纤维作为金标垫，相较于市售的玻璃纤维，能够显著提升检测的灵敏度，从而能够实现对毛发中微量的依托咪酯的检测，操作简单，可适用于非该领域技术人员，极大程度上扩大了依托咪酯检测的使用场景，并提供了便利条件。