一种识别肺腺癌肿瘤干细胞的基因标志物及其应用的制作方法

1.本发明涉及一种识别肺腺癌肿瘤干细胞的基因标志物及其应用，属于生物医药技术领域。


背景技术：

2.肺癌的发病率及死亡率在所有肿瘤中的排名均处于前列，其中最主要的肺癌亚型是肺腺癌。目前虽然临床上针对肺腺癌的治疗手段层出不穷，但患者整体的生存率依然不佳，因此进一步提升目前肺腺癌治疗手段的有效性是十分有必要的。肺腺癌肿瘤干细胞是肺腺癌组织中一小群具有自我更新及分化潜能的细胞类型，在肺腺癌的增殖、转移、放化疗耐药中均起着至关重要的作用。进一步深入地研究肺腺癌干细胞对战胜肺腺癌有着重要的意义。然而在既往的研究中，研究者通常是通过流式的方法，即通过细胞表面的干性基因来定义细胞的干性，这种方法一方面可供选择的标记基因较少，另一方面操作较为繁琐。因此开发一种可以识别肺腺癌中肿瘤干细胞基因标志物就显得十分有必要。因此，仍可能存在着一个方便、准确，有更高敏感性、特异性和应用价值的基因组合可以应用于区分肺腺癌干细胞和普通肺腺癌细胞。
3.近年来单细胞转录组测序的出现使得研究人员能够在单个细胞层面检测细胞的表达情况。通过单细胞转录组测序可以在单个细胞的层面研究肺腺癌中的干细胞，从而得到用于识别肺腺癌干细胞的特定表达谱(即肺腺癌干细胞基因标志物组合)。这将有助于研究者更为准确地区分肺腺癌中的肿瘤干细胞。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为解决获得识别肺腺癌肿瘤干细胞的基因标志物及其应用的技术问题。
5.为达到解决上述问题的目的，本发明所采取的技术方案是提供一种识别肺腺癌肿瘤干细胞的基因标志物，所述基因标志物包括基因rps4x、fth1、cyba、pomp、slc25a5、rpl35a、bst2、sec61g、hmgb1、commd6、clic1、cox6b1、ndufb4、tpi1、cox8a、sap18、hmgn1和xist中的至少一种。
6.本发明提供一种识别肺腺癌肿瘤干细胞的基因标志物在制备检测肺腺癌肿瘤干细胞的诊断试剂盒中的应用。
7.本发明提供一种识别肺腺癌肿瘤干细胞的基因标志物在制备肺腺癌预后的诊断试剂盒中的应用。
8.本发明提供一种识别肺腺癌肿瘤干细胞的基因标志物在制备治疗肺腺癌的药物中的应用。
9.本发明提供一种识别肺腺癌肿瘤干细胞的基因标志物在非诊断方法和非治疗方法中的应用。
10.相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
11.1.本发明基于单细胞转录组测序得到的肺腺癌肿瘤干细胞的标志物，可以准确地识别肺腺癌中的肺腺癌干细胞，并不限于细胞表面的干性基因，为进一步研究肺腺癌干细胞和针对肺腺癌干细胞的治疗提供了新的分子靶点。
12.2.本发明可基于机器学习的方法建立风险评估模型，具有可定量分析、准确性高、灵敏度和特异性好的优点。
附图说明
13.图1为肺腺癌的肿瘤干细胞及非肿瘤干细胞聚类结果图；
14.图2为rps4x等18个基因在区分肺腺癌的肿瘤干细胞和非肿瘤干细胞的roc曲线图；
15.其中，横坐标代表特异性，纵坐标代表敏感性；
16.图3为基于rps4x等18个基因构建的风险评估模型的roc曲线图；
17.其中，横坐标代表特异性，纵坐标代表敏感性；
18.图4为rt
‑
qpcr方法检测肺腺癌中肿瘤干细胞与非肿瘤干细胞中rps4x等18基因的mrna表达的差异倍数的结果图；
19.其中，纵坐标代表mrna表达的差异倍数。
具体实施方式
20.为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下：
21.本发明提供一种识别肺腺癌肿瘤干细胞的基因标志物，基因标志物包括基因rps4x、fth1、cyba、pomp、slc25a5、rpl35a、bst2、sec61g、hmgb1、commd6、clic1、cox6b1、ndufb4、tpi1、cox8a、sap18、hmgn1和xist中的至少一种。
22.本发明提供一种识别肺腺癌肿瘤干细胞的基因标志物在制备检测肺腺癌肿瘤干细胞的诊断试剂盒中的应用。
23.本发明提供一种识别肺腺癌肿瘤干细胞的基因标志物在制备肺腺癌预后的诊断试剂盒中的应用。
24.本发明提供一种识别肺腺癌肿瘤干细胞的基因标志物在制备治疗肺腺癌的药物中的应用。
25.本发明提供一种识别肺腺癌肿瘤干细胞的基因标志物在非诊断方法和非治疗方法中的应用。
26.实施例1
27.基因集的筛选：
28.肺腺癌组织的单细胞测序结果分析；
29.首先获取10例肺腺癌的肿瘤组织样本，并对这些肿瘤样本进行解离制备成单细胞悬液。随后基于目前公认的肿瘤干细胞的标记基因(cd133与aldh1)及肿瘤标记基因(epcam),通过流式分选的方法初步将肺腺癌中肿瘤干细胞分选出。随后将这些分选出肿瘤干细胞与剩余的普通肿瘤细胞进行单细胞转录组测序并得到下机数据。基于该测序，共得到了46106个单细胞的基因表达数据。
30.通过r语言，应用seurat包完成单细胞数据的完成细胞的降维聚类分析。接下来根
据公认的细胞标记鉴定出6955个肺腺癌肿瘤干细胞(图1)。在完成细胞鉴定后，使用“findmakrers”函数完成肺腺癌中肿瘤干细胞与普通肺腺癌细胞的转录组的差异分析(
±
0.5为log2fc界值)，最后得到了230个在肺腺癌中肿瘤干细胞中表达上调的基因，152个在肺腺癌中肿瘤干细胞中下调的基因。
31.在完成差异基因的筛选后，通过r语言中的proc包筛选能够较好区分肺腺癌肿瘤干细胞与非肿瘤干细胞的标记基因，纳入roc曲线下面积(auc，area under curve)值大于0.87的55个基因进入下一步的lasso回归分析中。
32.在完成肺腺癌肿瘤干细胞标记基因的初步筛选后，通过lasso回归的方法进一步筛选标记基因并得到十八个基因为：rps4x、fth1、cyba、pomp、slc25a5、rpl35a、bst2、sec61g、hmgb1、commd6、clic1、cox6b1、ndufb4、tpi1、cox8a、sap18、hmgn1、xist。该18个基因的auc值，敏感性及特异性的值如表1及图2所示：
33.表1构建肺腺癌肿瘤干细胞风险评估模型基因的auc，敏感性及特异质值
34.基因auc敏感性特异性rps4x0.9242690.8622460.845866fth10.9016660.8385290.809346cyba0.9058360.8212260.86197pomp0.9188870.8771630.833789slc25a50.8990390.8664230.790079rpl35a0.908880.8332340.837958bst20.8747370.8318170.81711sec61g0.891720.8102630.819986hmgb10.924380.8764920.824874commd60.8933960.8497170.803019clic10.873470.8182430.788641cox6b10.8816780.8495670.756147ndufb40.8835040.8304740.796262tpi10.8818130.8785050.734292cox8a0.8727720.7805790.816966sap180.8992070.8579210.800719hmgn10.8946590.8572490.775988xist0.8714280.7831890.921783
35.通过logistic回归构建评分模型：
36.score＝0.252*rps4x 0.609*fth1 0.287*cyba 0.358*pomp 0.477*slc25a5 0.586*rpl35a 0.197*bst2 0.444*sec61g 0.420*hmgb1 0.351*commd6 0.626*clic1 0.512*cox6b1 0.426*ndufb4 0.379*tpi1 0.850*cox8a 0.480*sap18 0.498*hmgn1
‑
1.373*xist；
37.随后利用实施例1中的单细胞转录组数据验证该logistic回归风险模型的效果。根据该模型，将相应基因的归一化后的表达值(单位：tpm)代入评分模型中，结果表明与单基因模型相比，该风险模型的特异性与敏感性均有了一定的提高，其auc的值接近0.95，说
明该预测模型能够更为准确地区分出肺腺癌肿瘤干细胞和非肺腺癌肿瘤干细胞(图3)。该模型中score的截断值为8.5。根据该模型，当score评分计算公式得到的数值大于8.5时，则该细胞判定为肺腺癌肿瘤干细胞；当score评分计算公式得到的数值小于8.5时，则该细胞判定为普通肺腺癌细胞。
38.实施例2效果验证：
39.流式细胞术分选肺腺癌肿瘤干细胞和非肿瘤干细胞验证基因表达量：
40.通过rt
‑
qpcr方法在分选出的肺腺癌肿瘤干细胞和普通肺腺癌细胞中检测这18个基因的mrna表达的差异倍数，结果如图4所示。由图4的结果可知，rps4x、fth1、cyba、pomp、slc25a5、rpl35a、bst2、sec61g、hmgb1、commd6、clic1、cox6b1、ndufb4、tpi1、cox8a、sap18、hmgn1和xist这18个基因在肺腺癌肿瘤干细胞中的表达量普遍高于非肿瘤干细胞。因此，rps4x等18个基因可用于区分肺腺癌肿瘤干细胞细胞和非肿瘤干细胞。
41.以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。