一种利用核卫星结构多联检测miRNA的方法与流程

技术特征：
1.一种利用核卫星结构多联检测mirna的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)取出20～40μl磁珠，吸取上清液后用12.5mm mg
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洗涤，并加入2～4μl biotin dna在旋转仪上旋转2～4h后，重复刚才的洗涤操作，并定容至20～40μl；(2)已修饰dna的金球与三种烷基硫醇，按照浓度比1：2000～1:3000的比例混合，将mirna链设置在摇床上，反应温度为20℃，反应转速为1250～1500rpm，反应时间为6～12h，然后通过在18000～20000rcf转速下离心去除过量未连接的烷基硫醇分子并用0.1m pbs缓冲液洗涤2～3次；(3)取已修饰dna的磁珠并加入过量已修饰烷基硫醇分子mass tag的金球，并在摇床上以37℃，反应的转速为1050～1250rpm，反应时间为6～12h，反应结束后洗涤上清液并进行maldi检测；(4)链置换反应：按照biotin dna:置换链为1：0.05～1：1的比例加入置换链，即需要检测的mirna链，，将mirna链设置在摇床上，反应温度为25℃，反应转速为400rpm～600rpm，反应时间为3～6h，反应结束后洗涤上清液并进行maldi检测；(5)maldi检测：将1μl分析物与0.5μl dhb基质溶液混合，然后将1μl该混合物沉积在384孔不锈钢靶板上，待到风干后将不锈钢靶板放入4800plus maldi
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tof/tof质谱仪进行测试并得到相应的质谱数据。2.根据权利要求1所述的利用核卫星结构多联检测mirna的方法，其特征在于：所述的0.1m pbs磷酸缓冲盐溶液为0.1m nacl，10mm磷酸盐。3.根据权利要求1所述的利用核卫星结构多联检测mirna的方法，其特征在于：所述的三种烷基硫醇分别为mass tag 1[hs
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(ch2)
11
(och2ch2)3oh]((11
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巯基十一烷基)三(乙二醇))，mass tag 2[hs
‑
(ch2)
11
(och2ch2)4oh]((11
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巯基十一烷基)四(乙二醇))，mass tag 3[hs
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(ch2)
11
(och2ch2)6oh]((11
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巯基十一烷基)六(乙二醇))；相对分子质量分别为693，781，957。4.根据权利要求1所述的利用核卫星结构多联检测mirna的方法，其特征在于：在步骤(2)中，反应时间为12h。5.根据权利要求1所述的利用核卫星结构多联检测mirna的方法，其特征在于：在步骤(2)中，反应时间为12h。6.根据权利要求1所述的利用核卫星结构多联检测mirna的方法，其特征在于：在步骤(4)中，反应的转速为500rpm。

技术总结
本发明公开了一种利用核卫星结构多联检测miRNA的方法，包括如下步骤：(1)取出磁珠，用12.5mM Mg


技术研发人员：田野 闵乾昊 陈志 张雪
受保护的技术使用者：南京大学
技术研发日：2021.08.30
技术公布日：2021/12/16