一种利用核卫星结构多联检测miRNA的方法与流程

dna在旋转仪上旋转2～4h后，重复刚才的洗涤操作，并定容至20～40μl；
10.(2)已修饰dna的金球与三种烷基硫醇，按照浓度比1：2000～1:3000的比例混合，将mirna链设置在摇床上，反应温度为20℃，反应转速为1250～1500rpm，反应时间为6～12h，然后通过在18000～20000rcf转速下离心去除过量未连接的烷基硫醇分子并用0.1m pbs缓冲液洗涤2～3次；
11.(3)取已修饰dna的磁珠并加入过量已修饰烷基硫醇分子mass tag的金球，并在摇床上以37℃，反应转速为1050～1250rpm，反应时间为6～12h，反应结束后洗涤上清液并进行maldi检测；
12.(4)链置换反应：按照biotin dna:置换链为1：0.05～1：1的比例加入置换链，即需要检测的mirna链，，将mirna链设置在摇床上，反应温度为25℃，反应转速为400rpm～600rpm，反应时间为3～6h，反应结束后洗涤上清液并进行maldi检测；
13.(5)maldi检测：将1μl分析物与0.5μl dhb基质溶液混合，然后将1μl该混合物沉积在384孔不锈钢靶板上，待到风干后将不锈钢靶板放入4800plus maldi
‑
tof/tof质谱仪进行测试并得到相应的质谱数据。
14.进一步地，所述的0.1m pbs磷酸缓冲盐溶液为0.1m nacl，10mm磷酸盐。
15.进一步地，所述的三种烷基硫醇分别为mass tag 1[hs
‑
(ch2)
11
(och2ch2)3oh]((11
‑
巯基十一烷基)三(乙二醇))，mass tag 2[hs
‑
(ch2)
11
(och2ch2)4oh]((11
‑
巯基十一烷基)四(乙二醇))，mass tag 3[hs
‑
(ch2)
11
(och2ch2)6oh]((11
‑
巯基十一烷基)六(乙二醇))；相对分子质量分别为693，781，957。
[0016]
更进一步地，在步骤(2)中，反应时间为12h。
[0017]
进一步地，在步骤(2)中，反应时间为12h。
[0018]
进一步地，在步骤(4)中，反应转速为500rpm。
[0019]
有益效果：本发明通过maldi质谱测试，可以检测出样品中含有的mirna的种类，并且可以同时独立的检测3种mirna的种类与含量多少。实验结果探究得出，mirna的检测限浓度能够达到pm级别，灵敏都特别高。
[0020]
(1)本发明修饰不同种烷基硫醇分子(mass tag)的金球(本发明为3种)与磁珠之间的组装，磁珠
‑
金球组装体即为本发明中的“核
‑
卫星结构”；mirna的置换作用：每种mirna可以将核
‑
卫星结构中相应的卫星金球置换下来，在之后的maldi质谱检测中也会以相应信号的有无或者强弱来判定mirna的有无与量的多少；maldi检测：maldi检测中需要引入对照组，即未加入mirna进行链置换反应的control组。
[0021]
(2)本发明旨在开发一种mirna响应性核
‑
卫星结构“质量条形码(mass tag)”纳米探针，来探测人体细胞内mirna的种类与含量，这些均可通过质谱信号的有无与强弱反映出来。
附图说明
[0022]
图1为本发明的maldi质谱测试图；在检测物为修饰有mass tag 3的金球时，maldi质谱图中出现横坐标为957的信号峰(957为mass tag 3相对分子质量，同样的，693与781分别为mass tag 1与mass tag 2相对分子质量)，横坐标表示mass tag的类型，纵坐标表示信号强弱，信号越强，含量越高。
[0023]
图2为本发明的mirna的检测图。其中，(a)未加入检测物，(b)加入的检测物中只含有mir
‑
155，(c)加入的检测物中含有mir
‑
155与mir
‑
16，(d)检测物中含有mir
‑
155，mir
‑
16，mir
‑
let7。
[0024]
注释：不同的mirna加入后会置换出对应的金球，金球上连接的mass tag种类是固定的，因此不同金球的置换反应在质谱信号中就是其上mass tag信号的缺失。
[0025]
图3为本发明的检测物中mir
‑
155的含量对质谱信号的影响图；用957的信号与加入的内标869信号的比值q来标定；(a)未加入检测物的对照组，q为100％(b)检测物中mir
‑
155浓度为0.5μm，q＝0％，(c)检测物中mir
‑
155浓度为1nm，q为82％，(d)检测物中mir
‑
155浓度为500pm，q为100％。
[0026]
图4为本发明的磁球与修饰有不同mass tag的金球之间的组装示意图；其中mir
‑
let 7可以置换修饰有693信号的金球；mir
‑
16可以置换修饰有781信号的金球；mir
‑
155可以置换修饰有957信号的金球。
具体实施方式
[0027]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
[0028]
实施例1
[0029]
结构组成：1μm直径的磁珠，10nm直径金球，mirna
‑
155，mirna
‑
let7，mirna
‑
16，烷基硫醇分子(mass tag)；
[0030]
本发明的一种利用核卫星结构多联检测mirna的方法，包括如下步骤：
[0031]
(1)取出20μl磁珠，吸取上清液后用12.5mm mg
2
洗涤，并加入3μl biotin dna在旋转仪上旋转2h后，重复刚才的洗涤操作，并定容至20μl；
[0032]
(2)已修饰dna的金球与三种烷基硫醇，按照浓度比1：2500的比例混合并在摇床上以20℃，1400rpm的条件反应9h，然后通过在19000rcf转速下离心去除过量未连接的烷基硫醇分子并用0.1m pbs缓冲液洗涤2.5次；
[0033]
(3)取已修饰dna的磁珠并加入过量已修饰烷基硫醇分子mass tag的金球，并在摇床上以37℃，1000rpm的条件下反应，反应时间为12h，反应结束后洗涤上清液并进行maldi检测；
[0034]
(4)链置换反应：按照biotin dna:置换链为1：0.05的比例加入置换链，即需要检测的mirna链，并在摇床上以25℃，500rpm的条件反应5h，反应结束后洗涤上清液并进行maldi检测；
[0035]
(5)maldi检测：将1μl分析物与0.5μl dhb基质溶液混合，然后将1μl该混合物沉积在384孔不锈钢靶板上，待到风干后将不锈钢靶板放入4800plus maldi
‑
tof/tof质谱仪进行测试并得到相应的质谱数据。
[0036]
实施例2
[0037]
实施例2与实施例1的区别在于：本发明的一种利用核卫星结构多联检测mirna的方法，包括如下步骤：
[0038]
在步骤(1)中，取出40μl磁珠，吸取上清液后用12.5mm mg
2
洗涤若干次，并加入4μl biotin dna在旋转仪上旋转3h后，重复刚才的洗涤操作，并定容至40μl；
[0039]
在步骤(2)中，已修饰dna的金球与三种烷基硫醇，按照浓度比1:3000的比例混合并在摇床上以20℃，1500rpm的条件反应6h，然后通过在18000rcf转速下离心去除过量未连接的烷基硫醇分子并用0.1m pbs缓冲液洗涤3次；
[0040]
在步骤(3)中，取已修饰dna的磁珠并加入过量已修饰烷基硫醇分子mass tag的金球，并在摇床上以37℃，1250rpm的条件下反应，反应时间为6h，反应结束后洗涤上清液并进行maldi检测；
[0041]
在步骤(4)中，链置换反应：按照biotin dna:置换链为1：1的比例加入置换链，即需要检测的mirna链，并在摇床上以25℃，600rpm的条件反应6h，反应结束后洗涤上清液并进行maldi检测。
[0042]
实施例3
[0043]
实施例3与实施例1的区别在于：本发明的一种利用核卫星结构多联检测mirna的方法，包括如下步骤：
[0044]
在步骤(1)中，取出30μl磁珠，吸取上清液后用12.5mm mg
2
洗涤若干次，并加入2μl biotin dna在旋转仪上旋转4h后，重复刚才的洗涤操作，并定容至30μl；
[0045]
在步骤(2)中，已修饰dna的金球与三种烷基硫醇，按照浓度比1：2000的比例混合并在摇床上以20℃，1250rpm的条件反应12h，然后通过在20000rcf转速下离心去除过量未连接的烷基硫醇分子并用0.1m pbs缓冲液洗涤2次；
[0046]
在步骤(3)中，取已修饰dna的磁珠并加入过量已修饰烷基硫醇分子mass tag的金球，并在摇床上以37℃，1050rpm的条件下反应，反应时间为9h，反应结束后洗涤上清液并进行maldi检测；
[0047]
在步骤(4)中，链置换反应：按照biotin dna:置换链为1：0.08的比例加入置换链，即需要检测的mirna链，并在摇床上以25℃，400rpm的条件反应3h，反应结束后洗涤上清液并进行maldi检测。
[0048]
试验例
[0049]
如图1所示，检测物的有无与含量的多少可以从maldi质谱图中反应出来，图1显示直接测试修饰有mass tag 3的金球，maldi质谱图中将出现横坐标为957的信号峰，横坐标957即代表mass tag 3，纵坐标代表信号强度，信号越强，待测物含量越高。
[0050]
maldi质谱图信号解读：在本实施例中，一共会在maldi质谱图中出现3种特征峰，其横坐标依次为693(mass tag 1)，781(mass tag 2)，957(mass tag 3)，代表修饰在金球表面的mass tag的类型，纵坐标为峰值，峰值越高代表信号越强，说明检测物中的mass tag含量越高，图2a显示核—卫星结构的maldi质谱图，在未加入检测物时，出现693，781，957三种不同信号，说明修饰有3种不同mass tag的金球成功与磁球连接，图2b中出现693，781信号，说明检测物中含有mir
‑
155,成功发生链置换反应将修饰957mass tag的金球从核
‑
卫星结构中置换下来导致957信号的缺失，同理，图2c中693与957信号的缺失说明待测物中含有mir
‑
155与mir
‑
let7，图2d中三种信号均缺失说明待测物中含有mir
‑
155，mir
‑
16与mir
‑
let7三种mirna；
[0051]
图3是进行mirna的检测限探究，在进行maldi测试之前，在所有的样品中加入相同物质的量的mass tag 4(869)，用957的信号与加入的内标869信号的比值q来标定。图3a显示在核
‑
卫星结构中加入内标869后，maldi质谱图中出现693，781，957，869四种信号，此时
规定q＝100％,图3b,3c,3d显示mir
‑
155的浓度分别为0.5μm，1nm，500pm时q值为0％,82％,100％,得出检测限为500pm，即当待测物中含有500pm以上的mirna时即可从质谱图中得出mirna的种类与相对含量。
[0052]
所述的0.1m pbs磷酸缓冲盐溶液为0.1m nacl，10mm磷酸盐。
[0053]
所述的三种烷基硫醇分别为mass tag 1[hs
‑
(ch2)
11
(och2ch2)3oh]((11
‑
巯基十一烷基)三(乙二醇))，mass tag 2[hs
‑
(ch2)
11
(och2ch2)4oh]((11
‑
巯基十一烷基)四(乙二醇))，mass tag 3[hs
‑
(ch2)
11
(och2ch2)6oh]((11
‑
巯基十一烷基)六(乙二醇))；相对分子质量分别为693，781，957。
[0054]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。