一株皮特不动杆菌YY-7S及其应用的制作方法

一株皮特不动杆菌yy
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7s及其应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，涉及一株皮特不动杆菌，具体地说，涉及一株对多种植物病原菌具有广谱抗性的皮特不动杆菌yy
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7s、分离鉴定及其在促进花生生长和防治花生致病真菌上的应用。


背景技术：

2.花生作为世界上最重要的豆科作物之一，在农业生产中发挥着重要的作用，在我国主要油料作物(包括油菜、花生、向日葵、芝麻和胡麻)中，花生的总产量、油产量、经济效益和国际竞争力位居第一位。但花生在整个生育期较易受到多种生物或非生物胁迫的危害，其中植物病害严重威胁花生的产量，所导致的花生产量损失在20％以上。
3.真菌是植物主要的病原来源，能够引起多种病害，导致全球粮食作物和经济作物的严重损失，由齐整小核菌(sclerotium rolfsii)引起的白绢病、核盘菌(sclerotinia sclerotiorum)引起的菌核病、黑曲霉(aspergillus niger)引起的冠腐病以及fusarium neocosmosporiellum引起的花生基腐病均为土传性真菌病害，严重影响花生的健康生产。
4.当前的农业生产中，防治病害很大程度上依赖于杀菌剂等农用化学用品，但化学药剂对人类健康和土壤微生物系统的平衡带来了严重的后果。因此，近年来，越来越多的研究倾向于花生病害的生物防治，尤其是高效拮抗生防菌的筛选与应用成为研究的热点。拮抗微生物作为生防菌剂具有更好的的环境友好性和可持续性，目前用于防治花生病害的生防菌主要以真菌和细菌最为常见，细菌同真菌相比较，具有易于培养、繁殖速率快等优势，因而在生防微生物中占有重要地位。从特定作物的根或根际分离的微生物可能比从其他植物物种中分离的微生物更好地适应该作物，更好的控制病害。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于解决现有技术中存在的上述问题，提出了一株皮特不动杆菌yy
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7s及其应用，摒弃了化学农药在防治花生病害方面的种种弊端，在花生上应用皮特不动杆菌，借助生防菌株，促进花生的生长，提高花生对白绢病、菌核病、冠腐病和基腐病的抗性。
6.本发明的技术方案是：
7.本发明提供了一株皮特不动杆菌yy
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7s，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.23529。
8.进一步的，其16s rdna的核苷酸序列如seq id no：1所示；gyrb基因序列如seq id no：2所示。
9.本发明还提供了皮特不动杆菌yy
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7s在防治植物真菌病害中的应用。
10.进一步的，所述植物真菌病害包括花生致病真菌引起的花生真菌病害，所述花生真菌病害包括白绢病、菌核病、冠腐病和基腐病，所述花生致病真菌包括白绢病菌、核盘菌、冠腐病菌和基腐病菌。
11.本发明还提供了采用皮特不动杆菌yy
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7s制备的生防菌剂，所述生防菌剂的活性成分包括皮特不动杆菌yy
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7s菌悬液、无菌发酵液或挥发性气体中的任一种。
12.本发明还提供了皮特不动杆菌yy
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7s在促进花生生长上的应用。
13.进一步的，应用方式为采用菌株yy
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7s的有菌发酵液灌根。
14.本发明的有益效果：
15.本发明所提供的一株皮特不动杆菌yy
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7s，为生防菌株，应用于花生病害防治上，摒弃了化学农药在防治花生病害方面的种种弊端，提高了花生对白绢病、菌核病、冠腐病和基腐病的抗性，同时还能够促进花生的生长。采用皮特不动杆菌yy
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7s防治花生真菌病害，安全有效，防治效果显著且快速，有利于花生的绿色健康生产，提高了经济效益。
附图说明
16.图1为菌株yy
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7s在lb固体培养基上的菌落形态图；
17.图2为菌株yy
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7s基于16s rdna和gyrb基因构建的系统发育树；
18.图3为菌株yy
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7s菌悬液对4种病原菌的抑制作用结果示意图；
19.图4为菌株yy
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7s发酵液对4种病原菌的抑制作用结果示意图；
20.图5为菌株yy
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7s挥发性气体对4种病原菌的抑制作用结果示意图；
21.图6为菌株yy
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7s有菌发酵液对花生生长影响的结果示意图。
具体实施方式
22.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
23.为了进一步理解本发明，将结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。
24.实施例1皮特不动杆菌yy
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7s的分离鉴定
25.(1)菌株yy
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7s的分离：于公园中的野蒜根际周围，称取距离地表5～10cm深处的土壤样品约100g，带回实验室，4℃保存。取土壤样品10g加到90ml无菌水中，28℃、140rpm振荡15min，静置5min，取上清液，采用10倍系列稀释法，依次稀释到10
‑2、10
‑4和10
‑5，每个浓度吸取100μl分别涂于lb固体培养基上，每个浓度重复3次，28℃暗培养。待培养基上出现细菌菌落时，喷施花生冠腐病菌(a.niger)孢子悬浮液。培养2d后，选取周围出现明显抑菌圈的菌落，用移菌环挑取单菌落，在lb固体培养基上进行纯化培养。
26.挑选得到一株抑菌圈明显且菌落较小的菌株，菌体呈乳白色，圆形，边缘整齐，表面湿润，不透明，如图1所示，命名为yy
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7s。菌株yy
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7s单菌落用lb液体培养基摇菌后，加入甘油，于
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80℃保存。
27.(2)皮特不动杆菌yy
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7s的菌种鉴定：根据提取细菌基因组的试剂盒“transgen ebacteria genomic dna kit”提取yy
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7s的基因组dna。分别利用16s rdna通用引物27f(5’agagtttgatcmtggctcag 3’)(seq id no：3)和16s
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r(5’aaggaggtgatccagccgca 3’)(seq id no：4)，gyrb基因引物up
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1e(5’caggaaacagctatgaccaygsnggnggnaarttyr 3’)(seq id no：5)和apru(5’tgtaaaacgacggccagtgcnggrtcyttytcytgrca 3’)(seq id no：6)
对菌株yy
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7s的基因组进行pcr扩增。pcr产物送北京擎科生物科技有限公司测序。16s rdna序列全长为1392bp，序列如seq id no：1所示；gyrb基因序列全长为866bp，序列如seq id no：1所示。
28.所获得的序列提交到genbank数据库(ol314651、ol343766)进行blast分析比对，并联合16s rdna和gyrb基因用mega6.06软件构建系统发育树，如图2所示。结果表明菌株yy
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7s与皮特不动杆菌acinetobacter pittii lmg 1035在同一分支上，16s rdna和gyrb基因序列相似性分别达到100、99.19％，说明菌株yy
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7s为皮特不动杆菌acinetobacter pittii。菌株yy
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7s保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址为北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期为2021年09月30日；保藏编号为cgmcc no.23529。
29.实施例2菌株yy
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7s菌悬液对4种花生病原菌菌丝生长的抑制作用
30.菌悬液制备：将菌株yy
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7s的单菌落放入液体lb培养基中，28℃振荡培养2d，静置5min，弃大部分上清。
31.病原菌的活化：分别取花生白绢病菌、核盘菌、冠腐病菌和基腐病菌的菌饼接种到pda培养基中央，25℃暗培养7d，备用。
32.lb固体培养基中央接种直径为5mm的病原菌的菌饼，菌饼两侧约20mm处用yy
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7s的菌悬液划2组粗壮的平行线，以不接种菌悬液作为对照，每个处理重复6次，25℃恒温培养。对菌丝生长情况进行测量，采用菌丝生长速率法计算抑菌率。抑菌率(％)＝(对照菌落增长直径－处理菌落增长直径)/对照菌落增长直径
×
100。结果如图3所示，发现菌株yy
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7s对四种病原菌均具有显著的抑菌效果，图3中，a为yy
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7s对4种花生病原菌的拮抗效果；b为4种病原菌的菌落生长情况统计(注：**差异在0.01水平差异极显著)；c为yy
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7s对4种花生病原菌的抑菌率统计，yy
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7s对白绢病菌、核盘菌、冠腐病菌和基腐病菌的菌丝生长抑制率分别为75.62％、78.25％、83.00％和54.20％。
33.实施例3菌株yy
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7s无菌发酵液对4种花生病原菌菌丝生长的抑制作用
34.用牙签挑取菌株yy
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7s的单菌落放入盛有100ml lb培养基的三角瓶中，28℃振荡培养4d，高速离心后收集上清液，用0.22um滤膜过滤得到无菌发酵液。将无菌发酵液以1:10的比例与加热冷却至约50℃的lb固体培养基混合倒平板，在平板中央接入直径为5mm病原菌的菌饼，以添加等量lb液体培养基的平板作为对照，每个处理设6个重复，25℃培养，对菌丝生长情况进行测量，计算抑菌率。结果如图4所示，与相应对照相比，菌株yy
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7s的无菌发酵液极显著的降低了白绢病菌、核盘菌菌丝的生长，但对冠腐病菌和基腐病菌的生长无显著影响。图4中，a为yy
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7s对4种花生病原菌的拮抗效果；b为4种病原菌的菌落生长情况统计(注：**差异在0.01水平差异极显著)；c为yy
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7s对4种花生病原菌的抑菌率统计，菌丝生长抑制率分别为22.80％、93.26％、0.58％和0.35％。
35.实施例4菌株yy
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7s挥发性气体对4种花生病原菌菌丝生长的抑制作用
36.采用双皿对扣法测定挥发性气体的抑菌活性。用牙签蘸取yy
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7s的菌悬液，于lb平板上均匀划线，另一lb平板中央接入直径为5mm病原菌的菌饼。以空白lb平板作为对照，每个处理设6个重复，对菌丝生长情况进行测量，计算抑菌率。结果如图5所示，菌株yy
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7s的挥发性气体极显著的降低了白绢病菌、核盘菌、冠腐病菌和基腐病菌菌丝的生长，图5中，a为yy
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7s挥发性气体对4种花生病原菌的拮抗效果；b为4种病原菌的菌落生长情况统计(注：**
差异在0.01水平差异极显著)；c为yy
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7s对4种花生病原菌的抑菌率统计，菌丝生长抑制率分别为27.39％、96.21％、34.94％和10.13％。
37.实施例5菌株yy
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7s有菌发酵液对花生生长的影响
38.花生品种双英5号播种于花盆中，2周后用菌株yy
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7s的有菌发酵液灌根(2ml/株)，4周后再次用yy
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7s的有菌发酵液灌根，以接种等量lb培养基为对照。对照和处理各3盆，重复3次，8周后处理花生，称量植株总鲜质量，烘干后称量植株总干质量。结果如图6所示，统计发现，同对照相比，菌株yy
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7s的有菌发酵液能够极显著增加双英5号植株的鲜质量和干质量，比对照分别增加20.83％和33.81％(图中**表示在p<0.01水平下，差异极显著)。
39.上述说明仅为本发明的优选实施例，并非是对本发明的限制，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改型等，均应包含在本发明的保护范围之内。