一种解脂耶氏酵母杂合启动子及其应用的制作方法

1.本发明属于基因工程技术领域，更具体地，涉及一种解脂耶氏酵母杂合启动子及其应用。


背景技术：

2.解脂耶氏酵母是一种隶属于子囊菌门的非常规酵母，美国食品和药物管理局(food and drug administration)将其认定为gras(generally recognized as safe)生物。该物种广泛分布于自然界和人类生活的各个角落，复杂的生存环境造就了其碳源的多样性，解脂耶氏酵母可使用糖类、多元醇、有机酸、乳酸盐、烷烃、脂肪酸、煎炸油等多种亲水性或疏水性碳源。解脂耶氏酵母拥有十分丰富的酶系，可作为蛋白质生产、代谢产物分泌、烷烃降解等多种生物化学反应的宿主，其产物广泛应用于食品、医药、能源、化工等多种领域。
3.解脂耶氏酵母的基因工程和合成生物学研究中，充分发挥重组菌的生产潜力需要精准高效地监测菌株的生长生产过程，因而，选择合适的启动子元件控制目的基因的转录表达尤为重要。该宿主中用于异源蛋白表达的启动子包括诱导型启动子、组成型启动子和杂合启动子。其中，诱导型启动子的诱导物大多不溶或难溶于水，不利于菌株发酵过程，主要用于该宿主中疏水产物的生产；组成型启动子难以表达一些可能产生细胞毒性的物质，且启动子强度常弱于由其改造得到的杂合启动子；杂合启动子一般由来自不同基因的元件序列组成，是解脂耶氏酵母中当前使用最为广泛的启动子。
4.目前，解脂耶氏酵母中可用的杂合启动子十分有限，已报到的杂合启动子多由xpr2基因的启动子的上游激活序列uas1b与亮氨酸生物合成关键酶基因leu2最小启动子pleu
min
、翻译延伸因子
‑
1α启动子ptef、赤藓糖激酶启动子peyk1等组合构建而成。解脂耶氏酵母基因工程菌的精准控制需要更多的杂合启动子调控基因的表达，以确保相应途径中的最佳通量或避免代谢负担。


技术实现要素：

5.为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种解脂耶氏酵母杂合启动子，并验证其应用于基因表达的可行性。本发明通过将不同数量的启动子上游激活序列和解脂耶氏酵母烯醇酶基因启动子串联，构建了一系列解脂耶氏酵母杂合启动子，并将置于报告基因及目的基因上游，控制基因表达以获取特定的最终产物产量；从而解决现有技术中解脂耶氏酵母基因工程菌的精准控制需要的杂合启动子调控基因的表达。
6.根据本发明第一方面，提供了一种解脂耶氏酵母杂合启动子，所述杂合启动子为将至少一个解脂耶氏酵母的xpr2基因的上游激活序列uas1b和解脂耶氏酵母烯醇酶基因启动子串联得到。
7.优选地，所述解脂耶氏酵母的xpr2基因的上游激活序列uas1b小于等于32个重复单元。
8.优选地，所述解脂耶氏酵母的xpr2基因的上游激活序列uas1b为4、8、12、16、20、24、28或32个重复单元。
9.优选地，所述解脂耶氏酵母烯醇酶基因启动子为解脂耶氏酵母烯醇酶基因的起始密码子向前截取小于等于1300bp且大于等于100bp的任意长度。
10.优选地，所述解脂耶氏酵母烯醇酶基因启动子为解脂耶氏酵母烯醇酶基因的起始密码子向前截取100bp、125bp、150bp、175bp、200bp、300bp、400bp、700bp、1000bp或1300bp的序列。
11.根据本发明另一方面，提供了任一所述的解脂耶氏酵母杂合启动子用于启动异源目的基因表达的应用。
12.优选地，所述应用具体为：将所述解脂耶氏酵母杂合启动子依次与报告基因和异源目的基因连接，以启动目的基因表达。
13.优选地，所述报告基因为绿色荧光蛋白基因。
14.优选地，所述异源目的基因为脂肪酶基因。
15.优选地，所述脂肪酶基因为疏棉状嗜热丝胞菌脂肪酶基因。
16.总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：
17.(1)本发明开发设计了一系列不同强度的解脂耶氏酵母杂合启动子，且在用于异源蛋白生产时获得了高于现有杂合启动子的强度。本发明缓解了解脂耶氏酵母中现有杂合启动子可用性不足的问题，为该宿主的基因工程改造和合成生物学研究提供了新的有效元件。
18.(2)烯醇酶为细胞质中糖酵解途径第九步的关键酶，可催化甘油酸
‑2‑
磷酸脱水生成磷酸烯醇式丙酮酸。解脂耶氏酵母中烯醇酶具有较高的蛋白表达水平，即烯醇酶基因对应的启动子可能具有较高的强度。本发明构建的解脂耶氏酵母的xpr2基因的上游激活序列uas1b和解脂耶氏酵母烯醇酶基因启动子串联得到的杂合启动子，新获得的hp4e
100
启动子强度与hp4d(当前最常用的启动子)相当，hp4e
400
、hp4e
1000
等启动子强度弱于hp4d，hp12e
100
、hp16e
100
等启动子强度高于hp4d。以上启动子可适用于多种基因不同水平的表达。
附图说明
19.图1为重组质粒1296
‑
peno
n
‑
egfp(n＝75,100,125,150,175,200,300,400,700,1000,1300)构建流程图。
20.图2为菌株po1f/1296
‑
peno
n
‑
egfp(n＝75,100,125,150,175,200,300,400,700,1000,1300)荧光强度检测结果示意图。
21.图3为重组质粒1296
‑
peno
n
‑
mtll(n＝100,125,200,400,700,1000,1300)构建流程图。
22.图4为菌株po1f/1296
‑
peno
n
‑
mtll(n＝100,125,200,400,700,1000,1300)脂肪酶活力检测结果示意图。
23.图5为重组质粒1296
‑
hp4e
n
‑
mtll(n＝100,125,200,400,700,1000,1300)构建流程图。
24.图6为菌株po1f/1296
‑
hp4e
n
‑
mtll(n＝100,125,200,400,700,1000,1300)脂肪酶
活力检测结果示意图。
25.图7为重组质粒1296
‑
hpne
100
‑
mtll(n＝8,12,16,20,24,28,32)构建流程图。
26.图8为菌株po1f/1296
‑
hpne
100
‑
mtll(n＝8,12,16,20,24,28,32)脂肪酶活力检测结果示意图。
具体实施方式
27.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
28.本发明以解脂耶氏酵母烯醇酶基因(enolase，genbank：xm_505509.1)启动子peno(即seq id no：1)为研究对象，首先比较不同长度的peno启动子的强度差异，随后在peno启动子的上游添加uas1b激活序列(即seq id no：2)，构建得到不同强度的烯醇酶杂合启动子。本发明依次比较了上述启动子和已有的解脂耶氏酵母杂合启动子作用下增强型绿色荧光蛋白基因和疏棉状嗜热丝胞菌脂肪酶(thermomyces lanuginosus lipase，genbank：aac08588.1)基因的表达情况，证实了烯醇酶杂合启动子用于解脂耶氏酵母中重组蛋白高效生产的可行性。
29.本发明中，增强型绿色荧光蛋白基因egfp为常见的报告基因；解脂耶氏酵母po1f和大肠杆菌top10为商业化宿主；lb培养基、md培养基和ypd培养基均为宿主常用培养基。疏棉状嗜热丝胞菌脂肪酶基因根据解脂耶氏酵母密码子使用情况优化后由武汉擎科生物技术有限公司合成。本发明重组质粒使用醋酸锂转化法(例如，可参考：chen dc,beckerich jm,gaillardin c.one
‑
step transformation of the dimorphic yeast yarrowia lipolytica.applied microbiology and biotechnology.1997,48(2):232
‑
235.doi:10.1007/s002530051043)转入酵母感受态细胞，所得阳性转化子经bmsy培养基(山梨醇50g/l，yeast extract 10g/l，tryptone 20g/l，磷酸盐缓冲液100mm，无氨基酵母氮碱13.4g/l，生物素0.4mg/l)发酵培养120h。本发明以流式细胞仪和共聚焦显微镜进行荧光强度检测；采用碱式滴定法测定疏棉状嗜热丝胞菌脂肪酶活力，一个酶活力单位(u)定义为脂肪酶每分钟水解橄榄油产生1μmol游离脂肪酸所需的酶量。每个样品三次测量取平均值。本发明所用引物由武汉擎科生物技术有限公司合成，其序列具体如下所示：
[0030][0031]
以下为具体实施例：
[0032]
实施例1：不同长度烯醇酶启动子的活性检测
[0033]
如图1所示，以解脂耶氏酵母po1f菌株基因组为模板，分别以peno
n
‑
f1/peno
‑
r为引物，pcr扩增获得不同长度烯醇酶启动子peno
n
(n＝75,100,125,150,175,200,300,400,700,1000,1300)。以限制性酶bamhi/hindiii分别双酶切上述pcr产物和质粒1296
‑
hp4d
‑
egfp(本实验室保存，商业化载体pina1296插入强型绿色荧光蛋白基因egfp)，分别回收pcr产物片段和较大的载体骨架部分，以dna连接酶连接后转化大肠杆菌top10感受态细胞，涂板lb
‑
amp平板(lb培养基补加氨苄青霉素至0.1g/l)，置于37℃培养至单克隆清晰可见。挑取适当数量的单克隆分别以peno
n
‑
f1/peno
‑
r为引物进行菌落pcr，选取阳性克隆子抽取质粒测序，结果符合预期的重组质粒分别命名为1296
‑
peno
n
‑
egfp(n＝75,100,125,150,175,
200,300,400,700,1000,1300)。
[0034]
重组质粒1296
‑
peno
n
‑
egfp经限制酶apai线性化，通过醋酸锂转化法插入解脂耶氏酵母po1f基因组，经md
‑
ura培养基(md培养基补加尿嘧啶至22.4mg/l)筛选鉴定菌落表型，以确定重组质粒的转入。随后，挑选阳性单克隆抽取基因组，以引物对egfp
‑
f/egfp
‑
r进行pcr验证，所得正确菌株命名为po1f/1296
‑
peno
n
‑
egfp(n＝75,100,125,150,175,200,300,400,700,1000,1300)。取菌株po1f/1296
‑
peno
n
‑
egfp进行bmsy摇瓶发酵，同时以宿主po1f和菌株po1f/1296
‑
hp4d
‑
egfp(本实验室保存，宿主po1f转入质粒1296
‑
hp4d
‑
egfp)为对照，约120h后取菌液于流式细胞仪和共聚焦显微镜进行荧光检测，所得检测结果见图2。其中，长度为75bp的启动子peno
75
对应重组菌的荧光强度与宿主po1f的荧光强度之间无显著性差异(p＝0.9282)；长度为100bp的启动子peno
100
对应重组菌的荧光强度与宿主po1f相比差异较小但显著(p＝0.0264)；当启动子长度大于125bp时，对应重组菌的荧光强度随着启动子长度的增大而不断增强，但均小于解脂耶氏酵母杂合启动子hp4d对应的重组菌。综上可知，烯醇酶启动子长度增加时其启动子强度也随之提高，且烯醇酶最小启动子的长度可能为100bp左右。
[0035]
实施例2：不同长度烯醇酶启动子用于疏棉状嗜热丝胞菌脂肪酶的表达
[0036]
如图3所示，以限制性酶hindiii/kpni分别双酶切重组质粒1296
‑
peno
n
‑
egfp和1296
‑
hp4d
‑
mtll(本实验室保存，商业化载体pina1296插入根据解脂耶氏酵母密码子使用情况优化且无前肽序列的疏棉状嗜热丝胞菌脂肪酶基因mtll)，分别回收较大的载体骨架部分和mtll基因片段，以dna连接酶连接后转化大肠杆菌top10感受态细胞，即可得重组质粒1296
‑
peno
n
‑
mtll(n＝100,125,200,400,700,1000,1300)。
[0037]
上述质粒经apai线性化后锂转解脂耶氏酵母po1f，经md
‑
ura培养基初步筛选鉴定菌落表型后，随机挑选单菌落至bmsy
‑
三丁酸甘油酯平板(bmsy培养基灭菌前加入2％体积的三丁酸甘油酯)进行菌株脂肪酶活力定性筛选，酶活较高的克隆子将快速产生较大的透明水解圈。分别挑选上述转化所得菌株po1f/1296
‑
peno
n
‑
mtll(n＝100,125,200,400,700,1000,1300)中水解圈大的单克隆进行bmsy摇瓶发酵，同时以宿主po1f和菌株po1f/1296
‑
hp4d
‑
mtll(宿主po1f转入质粒1296
‑
hp4d
‑
mtll)为对照，约120h后取重组菌发酵上清液以碱式滴定法进行脂肪酶活力检测。如图4所示，启动子peno
100
对应的重组菌脂肪酶活力较低(30u/ml)，但明著高于宿主po1f自身的脂肪酶活力(25u/ml)；烯醇酶启动子长度小于400bp时，随着启动子长度的增加，对应重组菌的脂肪酶活力也不断提高；另一方面，启动子peno
400
、peno
700
、peno
1000
和peno
1300
对应的菌株脂肪酶活力差异不大，约为39
‑
44u/ml，且远低于启动子hp4d对应的菌株酶活力(299u/ml)。
[0038]
实施例3：杂合启动子hp4e
n
用于疏棉状嗜热丝胞菌脂肪酶的表达
[0039]
杂合启动子hp4e
n
构建流程如图5所示，质粒1296
‑
hp4d
‑
mtll经hindiii/sali双酶切，回收约7400bp的载体片段；质粒1296
‑
hp4d
‑
mtll经sali/bglii双酶切，回收约540bp的片段，命名为4uas1b；以解脂耶氏酵母po1f基因组为模板，分别以peno
n
‑
f2/peno
‑
r为引物进行pcr扩增获得不同长度的烯醇酶启动子peno
n
(n＝100,125,200,400,700,1000,1300)，而后以bglii/hindiii双酶切并胶回收。上述载体片段、4uas1b片段和peno
n
启动子片段三者酶连，得到重组质粒1296
‑
hp4e
n
‑
mtll(n＝100,125,200,400,700,1000,1300)，其中，hp4e
n
为将4个重复串联的启动子上游激活序列uas1b置于不同长度的烯醇酶启动子上游所
得的一系列杂合启动子。
[0040]
重组质粒1296
‑
hp4e
n
‑
mtll经apai线性化后转入解脂耶氏酵母po1f，经md
‑
ura平板筛选后，取单克隆点板至bmsy
‑
三丁酸甘油酯筛选平板，可得菌株po1f/1296
‑
hp4e
n
‑
mtll(n＝100,125,200,400,700,1000,1300)。挑选每种菌株中水解圈大的单克隆进行bmsy摇瓶发酵，同时以宿主po1f和菌株po1f/1296
‑
hp4d
‑
mtll为对照，约120h后取上清液进行脂肪酶活力检测。如图6所示，不同长度的烯醇酶启动子上游串联uas1b序列后得到的杂合启动子对应的重组菌酶活力大幅提高。其中，杂合启动子hp4e
100
对应的重组菌酶活力最高(305u/ml)，该值略高于杂合启动子hp4d对应的菌株酶活力(299u/ml)，表明hp4e
100
的启动子强度与hp4d较为接近。综上可知，解脂耶氏酵母中表达疏棉状嗜热丝胞菌脂肪酶时，杂合启动子hp4e
n
表现出的启动子强度远高于相应的启动子peno
n
(n＝100,125,200,400,700,1000,1300)，且hp4e
100
的启动子强度最高。
[0041]
实施例4：杂合启动子hpne
100
用于疏棉状嗜热丝胞菌脂肪酶的表达
[0042]
为尝试提高杂合启动子的强度，后文在杂合启动子hp4e
100
的基础上，进一步提高启动子上游激活序列uas1b的数量，从而得到一系列具有不同启动子强度的杂合启动子。
[0043]
杂合启动子hpne
100
(n＝8,12,16,20,24,28,32)构建过程如图7所示，分别以限制酶bglii/psti和bamhi/psti双酶切质粒1296
‑
hp4e
100
‑
mtll(bglii和bamhi为同尾酶)，均回收带有4个uas1b序列的dna片段，两个dna片段经连接酶连接后转化top10并涂布lb
‑
amp平板，以psti酶切位点上下游引物pst
‑
f/pst
‑
r进行菌落pcr验证即可快速筛选得到阳性克隆子。所得重组质粒含有携带8个uas1b序列的杂合启动子hp8e
100
，故命名为1296
‑
hp8e
100
‑
mtll。
[0044]
类似地，以限制酶bglii/psti双酶切质粒1296
‑
hp4e
100
‑
mtll，以限制酶bamhi/psti双酶切质粒1296
‑
hp8e
100
‑
mtll，分别回收含有4个uas1b元件和8个uas1b元件的dna片段。两个dna片段酶连后转化top10并以引物对pst
‑
f/pst
‑
r鉴定阳性克隆子，所得重组菌质粒携带含有12个uas1b序列的杂合启动子hp12e
100
，命名为1296
‑
hp12e
100
‑
mtll。随后，以限制酶bglii/psti和bamhi/psti分别双酶切质粒1296
‑
hp8e
100
‑
mtll可构建携带杂合启动子hp16e
100
的重组质粒1296
‑
hp16e
100
‑
mtll；以限制酶bglii/psti双酶切质粒1296
‑
hp4e
100
‑
mtll、1296
‑
hp8e
100
‑
mtll、1296
‑
hp12e
100
‑
mtll和1296
‑
hp16e
100
‑
mtll，以限制酶bamhi/psti双酶切质粒1296
‑
hp16e
100
‑
mtll，可依次构建携带杂合启动子hp20e
100
、hp24e
100
、hp28e
100
、hp32e
100
的重组质粒1296
‑
hp20e
100
‑
mtll、1296
‑
hp24e
100
‑
mtll、1296
‑
hp28e
100
‑
mtll和1296
‑
hp32e
100
‑
mtll。
[0045]
重组质粒1296
‑
hpne
100
‑
mtll(n＝8,12,16,20,24,28,32)经限制酶apai线性化转入解脂耶氏酵母po1f，经md
‑
ura平板筛选后，取单克隆转板至bmsy
‑
三丁酸甘油酯筛选平板，挑选水解圈大的单克隆进行bmsy摇瓶发酵，约120h检测发酵上清中的脂肪酶活力。如图8所示，串联uas1b序列后，所有启动子对应的菌株酶活力均明显高于原始启动子peno
100
；启动子peno
100
上游串联的uas1b序列数量增加时，重组菌株的脂肪酶活力也随之增大，即对应杂合启动子的强度不断提高，但uas1b数量超过20个时，重组菌株酶活反而下降。此外，含有16个uas1b序列的杂合hp16e
100
对应的重组菌脂肪酶活力最高(446u/ml)，相当于菌株po1f/1296
‑
hp4d
‑
mtll酶活力的1.49倍，表明本发明构建的杂合启动子在用于疏棉状嗜热丝胞菌脂肪酶表达时，其表现优越于现有的杂合启动子hp4d。
[0046]
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。