一步式高效筛选黄曲霉毒素绿色防控材料的方法及其应用与流程

1.本发明涉及一步式高效筛选黄曲霉毒素绿色防控材料的方法及其应用。


背景技术：

2.黄曲霉毒素毒性强、危害大，是污染食品种类最多的污染物，我国是世界上黄曲霉毒素 污染最严重国家之一，近年总体呈现污染加重趋势，严重威胁食品安全和人民健康。黄曲霉 毒素是自然界毒性最强的一类真菌毒素，其中黄曲霉毒素b1是国际癌症研究组织 (international agency for research on cancer,iarc)认定的i类致癌物，已引发过多起人畜 群体中毒事件，成为肝癌病例高发的主要原因之一。根据近5年web of science检索数据 统计：黄曲霉毒素污染食品及原料种类超过了110种，高居污染物首位。因此，筛选黄曲 霉毒素绿色防控材料，对推进黄曲霉毒素绿色防控技术发展与应用具有重要意义。
3.现有黄曲霉毒素绿色防控材料筛选方法归纳起来，主要是通过检测处理后的黄曲霉毒素 含量，通过比较黄曲霉毒素含量差异从而评价筛选出效果较好的绿色防控材料。然而，这类 常规方法筛选出来的绿色防控材料仍存在两个重要疑问没有解决：(1)绿色防控材料是否有 抑制黄曲霉生长的效果？(2)绿色防控材料是否能够从黄曲霉毒素的生物合成的源头阻断 毒素合成？要解答上述两个重要疑问，一方面仍需要进一步通过抑菌试验来测定绿色防控材 料对黄曲霉毒素产毒菌生长得抑菌效果，另一方面仍需要通过测定黄曲霉毒素生物合成通路 ——如一系列前体物质。
4.那么，如何才能实现黄曲霉毒素绿色防控材料的一步式高效筛选？
5.针对这一瓶颈难题，发明人团队经过多年攻关研究，成功发现了一种黄曲霉毒素产毒菌 产毒力指示分子——对于在相同产毒条件下培养的不同产毒菌株，该指示分子含量与菌株的 黄曲霉毒素产毒力成正相关。进一步研究还发现，对于同一株黄曲霉毒素产毒菌而言，在一 定培养时间内，该指示分子含量与菌的生产量成正相关。经深入研究发现，只要该指示分子 的产生被抑制，黄曲霉毒素合成通路的源头也一定被抑制。在此基础上，成功发明了一种高 效筛选黄曲霉毒素绿色防控材料的方法，并应用于高效筛选出既能源头抑制黄曲霉毒素合 成，又能抑制黄曲霉毒素产毒菌生长的有效绿色防控材料，为黄曲霉毒素高效绿色防控提供 了重要支撑。


技术实现要素：

6.本发明针对现有技术存在的不足，提供一步式高效筛选黄曲霉毒素绿色防控材料的方法 及其应用，其应用于一步式高效筛选出既能源头抑制黄曲霉毒素合成，又能抑制黄曲霉毒素 产毒菌生长的有效绿色防控材料，容易推广应用。
7.为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：
8.提供一步式高效筛选黄曲霉毒素绿色防控材料的方法，测定候选黄曲霉毒素绿色防控材 料试验处理组和对照组指示分子aft-yjfzp008含量，计算绿色防控材料对指示分子aft
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yjfzp008抑制率，根据指示分子aft-yjfzp008抑制率结果，高效筛选黄曲霉毒素绿
色防 控材料，所述的指示分子aft-yjfzp008氨基酸序列如seq id no.1所示。抑制率越高， 则表明其同时抑制黄曲霉毒素源头合成及抑制产毒菌生长的效果越好，由此筛选出效果较好 的黄曲霉毒素绿色防控材料。
9.按上述方案，所述的黄曲霉毒素绿色防控材料试验处理组和对照组可以但不限于通过如 下步骤实现：花生仁粉末、黄曲霉产毒菌孢子、系列候选绿色防控材料混合在培养基中培养 一定时间，获得试验处理组，其中用培养基代替候选绿色防控材料培养一定时间则获得对照 组。
10.按上述方案，所述的花生仁粉末，可以但不限于是中花6号、鲁花8号等品种去壳后研 磨制成的粉末状产物。
11.按上述方案，所述的黄曲霉产毒菌孢子，可以但不限于是5
×
105及以上cfu/ml的黄曲 霉产毒菌孢子液。黄曲霉产毒菌指可产黄曲霉毒素的黄曲霉产毒菌，比如黄曲霉菌标准产毒 菌株3.4408等，但并不限于此。
12.按上述方案，所述的培养基可以是液态的沙氏培养基，也可以是其他具有类似功效的培 养基。
13.按上述方案，所述的混合在培养基中培养一定时间可以但不限于是24h及以上。
14.黄曲霉毒素指示分子浓度的定量检测，可通过采用指示分子分子aft-yjfzp008的氨基 酸序列或其中的部分序列，通过常规抗体制备流程，制备出与该蛋白质对应的抗体，并实现 对该指示分子肽的定量检测，也可以通过其他检测技术手段实现对这些与该指示分子肽有一 一对应关系的定量检测，从而达到上述检测，部分序列是指与该黄曲霉毒素指示分子蛋白质 有一一对应关系的全序列中的一部分。
15.具体地，所述的指示分子aft-yjfzp008含量可以但不限于通过如下步骤实现：
16.a处理组与对照组培养一定时间后，对培养物充分匀浆，制备成待测溶液，加入到孔底 包被有指示分子aft-yjfzp008的纳米抗体或单克隆抗体的酶标板孔中，反应，洗板；
17.b加入指示分子aft-yjfzp008多克隆抗体反应，洗板；
18.c加入与指示分子aft-yjfzp008多克隆抗体发生结合反应的辣根过氧化物酶标记抗 体，反应，洗板；
19.d加入显色液反应；加入终止液，酶标仪读取并计算待测溶液中aft-yjfzp008的含 量；
20.用系列浓度的起标准物质作用的指示分子aft-yjfzp008纯品溶液，替换待测溶液，用 于制作标准曲线，再根据酶标仪读数计算指示分子aft-yjfzp008含量。
21.所述的绿色防控材料对aft-yjfzp008的抑制率，可以通过如下方式计算：抑制率＝ (对照组aft-yjfzp008含量-处理组aft-yjfzp008含量)/对照组aft-yjfzp008含量
×ꢀ
100％。
22.按上述方案，aft-yjfzp008的多克隆抗体与aft-yjfzp008的纳米抗体或单克隆抗体 的动物源不同，可利用指示分子aft-yjfzp008直接作抗原，制备获得纳米抗体或单克隆抗 体、以及兔源多克隆抗体，具体地：
23.指示分子aft-yjfzp008的纳米抗体或单克隆抗体的获得可采用如下方法：利用aft
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yjfzp008作为免疫抗原，采用常规方式免疫羊驼或者balb/c鼠，再利用已知常规的纳米抗 体或鼠源单克隆抗体制备技术方案即可研制获得；
24.指示分子aft-yjfzp008的多克隆抗体的获得可采用如下方法：利用aft-yjfzp008作为免疫抗原，采用常规方式免疫新西兰大白兔等试验兔，再利用已知常规的多克隆抗体制备技术方案即可研制获得黄曲霉毒素指示分子aft-yjfzp008的兔源多克隆抗体；
25.所述的与指示分子aft-yjfzp008的多克隆抗体发生结合反应的辣根过氧化物酶标记的抗体为辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体，可以直接购买商品获得。
26.所述的elisa包被缓冲液是指常规碳酸盐缓冲液，配制方法为：称取nahco31.465g、na2co30.795g,加入去离子水定容至500ml即可。
27.所述的elisa显色液是指elisa常规的双氧水与tmb显色液。
28.所述的终止液是指elisa常规的显色终止液2mol/l硫酸水溶液，配制方法为：取44ml浓硫酸加入到300ml去离子水中，搅拌到冷却，最后定容至400ml即可。
29.本发明提供一步式高效筛选黄曲霉毒素绿色防控材料的方法在筛选黄曲霉毒素绿色防控材料的应用。
30.按上述方案，所述的黄曲霉毒素绿色防控材料包括但不限于植物精油、柠檬醛衍生物仿生材料等黄曲霉毒素绿色防控材料。
31.本发明基于(1)黄曲霉毒素的产毒菌产毒力指示分子aft-yjfzp008肽一旦被抑制，则黄曲霉毒素生物合成通路的源头也一定被抑制；(2)对于同一产毒菌株，黄曲霉毒素的产毒菌产毒力指示分子aft-yjfzp008肽与菌株生长量呈正相关关系，由此成功发明了一步式高效筛选既能源头抑制黄曲霉毒素合成，又能抑制黄曲霉毒素产毒菌生长的有效绿色防控材料，能应用于筛选出植物精油、柠檬醛衍生物仿生材料等等黄曲霉毒素绿色防控材料，为黄曲霉毒素高效绿色防控提供了重要支撑。
32.本发明有益效果在于：
33.1.可用于一步式筛选出同时抑制黄曲霉毒素源头合成及其产毒菌生长的黄曲霉毒素绿色防控材料，2.易操作，实用性强，容易推广应用，3.对发展黄曲霉毒素微生物防控技术与保障食品安全具有重要意义。
具体实施方式
34.指示分子aft-yjfzp008的初始获得用发掘方法：
35.(1)取黄曲霉强产毒力菌株，培养获得菌株培养物和胞外分泌蛋白质混合物；然后将菌株培养物细胞破碎，获得胞内蛋白质混合物；将上述胞外分泌蛋白质混合物和胞内蛋白质混合物合并，加入碳二亚胺偶联获得黄曲霉抗原；
36.(2)将上述黄曲霉抗原免疫试验动物，获得纳米抗体库或单克隆抗体库；
37.(3)获得不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质合并溶液，利用步骤(2)获得的抗体库中的抗体，检测不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质，获得系列检测信号；
38.(4)找出检测信号与上述黄曲霉菌株产毒力呈现正相关的纳米抗体，即黄曲霉菌株产毒力指示分子抗体，与黄曲霉菌株产毒力指示分子抗体对应的蛋白质即发掘出的黄曲霉菌株产毒力指示分子。
39.上述方案中，步骤(1)的黄曲霉强产毒力菌株是通过常规方法从自然界分离、鉴定，或者通过人工改造获得，其产毒力经ny/t2311—2013标准方法鉴定结果不小于10μg/kg。
40.步骤(3)中所述的不同产毒力的黄曲霉菌株不少3株，其产毒力经ny/t 2311—2013 标准方法鉴定结果呈现为高、中、低至少3个层次。
41.所述的黄曲霉强产毒力菌株培养中采用的培养基为察氏培养基或者其他可供黄曲霉正常 生长的营养物，培养时间不少于12h，培养的环境温度为15～35℃。
42.所述的菌株培养物细胞破碎是通过常规液氮研磨或者细胞破碎仪等方法。
43.所述的碳二亚胺的用量为每1.0ml合并的胞外分泌蛋白质混合物和胞内蛋白质混合物 中，加入碳二亚胺量为0.005～0.1g。
44.所述的偶联反应指在15～37℃反应2～6h，在4～10℃反应过夜。
45.所述的免疫是常规免疫方式，接种黄曲霉抗原。所述的试验动物是指小白鼠或者羊驼或 者其他具有相似效果的试验动物。
46.按上述方案，所述的抗体制备流程是指常规的纳米抗体制备技术流程或者常规的基于细 胞融合的杂交瘤单克隆抗体制备技术流程。
47.按上述方案，所述的检测不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质是指采用常规的westernblot技术流程，即将不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质移至硝酸纤维素膜上，再利用上述 抗体库中抗体，经直接方法或者间接方法检测，或者采用具有类似功效的其他技术流程。
48.按上述方案，上述直接方法是指将上述抗体库中抗体通过常规方法与信号材料偶联，再 与上述移至硝酸纤维素膜上的相应蛋白质发生免疫结合反应。
49.按上述方案，上述间接方法是指将上述抗体库中抗体先与上述移至硝酸纤维素膜上的相 应蛋白质发生免疫结合反应，然后再利用第二抗体与信号材料偶联物与上述结合到硝酸纤维 素膜上的抗体发生免疫结合反应。
50.上述检测中信号材料是辣根过氧化物酶或者是胶体金或者是荧光材料或者是具有类似功 效的其他材料。检测信号是显色反应信号或者是斑点信号或者是荧光信号。
51.指示分子aft-yjfzp008抗体可以在获知黄曲霉毒素指示分子aft-yjfzp008全部序列 后，利用其全部肽段或部分肽段通过常规的抗体制备技术流程制备获得。
52.按照如下配方配置察氏培养基：3％(w/v)蔗糖，0.3％(w/v)nano3，0.1％(w/v) k2hpo4，0.05％(w/v)mgso4
·
7h2o，0.05％(w/v)kcl，0.001％(w/v)feso4， ph6.5，配置获得察氏培养基。随机选取公开文献《中国典型花生产区黄曲霉菌分布、产毒 力与侵染研究》——中国农业科学院硕士学位论文，作者张杏，第33页——公布的产毒真 菌菌株hlj-1、henzy-2、hubha-24、jxzs-29-2、lnct-6、gxfc-34、gdzj-108-19、jsnt
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1、hundx-7、hbha-8-17等10株，分别接种到上述察氏培养基中，于28℃200rpm/min 培养5天后，常规方法充分匀浆、破碎细胞，再用常规的蛋白质纯化系统、蛋白质电泳、免 疫亲和等方法，即可纯化获得指示aft-yjfzp008。试验结果表明，上述产毒真菌菌株培养 物中均可以制备得到aft-yjfzp008，在同样培养条件下，hbha-8-17制备得到aft
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yjfzp008的量最多，而hlj-1制备得到aft-yjfzp008的量最少。
53.所述的免疫亲和方法，是利用指示分子aft-yjfzp008的纳米抗体或单克隆抗体，通过 常规方法制备成免疫亲和柱，再利用免疫亲和方法从黄曲霉毒素产毒真菌细胞破碎液中富集 纯化，去离子水溶解获得。具体可用上样液稀释黄曲霉毒素产毒真菌细胞破碎液，经常规滤 纸过滤后，再连续加到上述免疫亲和柱中，待基本流尽时，再免疫亲和柱常规
淋洗液洗涤柱 体，最后用ph 2.2的甘氨酸缓冲液或者70％甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液后通过常规超滤 离心方法及时去除溶液，再用无菌水从超滤离心管中溶解出留在超滤离心管内的蛋白质，即 可获得指示分子aft-yjfzp008水溶液。
54.实施例1黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft-yjfzp008的纳米抗体制备
55.利用aft-yjfzp008作为免疫抗原，采用常规方式免疫羊驼或者balb/c鼠，再利用已知 常规的纳米抗体或鼠源单克隆抗体制备技术方案即可研制获得。
56.将上述制备获得的aft-yjfzp008溶解在常规pbs缓冲液或者生理盐水中至浓度不低 于0.1mg/ml，再和弗氏完全佐剂等体积混合乳化，通过背部皮下或皮内多点注射方式免疫 羊驼，之后每隔2-4周加强免疫1次，加强免疫时用弗氏不完全佐剂替换弗氏完全佐剂。采 用常规elisa流程监测免疫效果，至羊驼血清效价不再上升后，随后对免疫羊驼的静脉取 血、提取总rna、合成cdna、vhh基因的扩增、vhh基因片段的回收、vhh基因与双 酶切处理的pcantab 5e(his)载体的连接、连接产物电转化、构建纳米抗体基因库以及 纳米抗体基因库的拯救等操作按照专利文献cn103866401a的方法完成，最终获得拯救后的 纳米抗体基因库。
57.将上述制备获得的aft-yjfzp008按8μg/孔、2μg/孔、0.5μg/孔、0.1μg/孔的梯度固 定在96孔酶标板等固相载体上，参考专利文献cn103866401a的方法对上述拯救后的纳米 抗体基因库进行2-4次淘选，再用aft-yjfzp008和间接非竞争elisa鉴定每一噬菌体克隆 产生的抗体，阳性结果对应的噬菌体为噬菌体阳性克隆，再将此阳性克隆通过纳米抗体制备 的常规方式制备出纳米抗体，即为aft-yjfzp008的纳米抗体，用于进一步应用研究工作， 优选经elisa方法表征，具有特异性强、亲和力高的纳米抗体。
58.实施例2黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft-yjfzp008的单克隆抗体制备
59.利用aft-yjfzp008作为免疫抗原，采用常规方式免疫羊驼或者balb/c鼠，再利用已知 常规的纳米抗体或鼠源单克隆抗体制备技术方案即可研制获得。
60.将上述制备获得的aft-yjfzp008溶解在常规pbs缓冲液或者生理盐水中至浓度不低 于0.1mg/ml，再和弗氏完全佐剂等体积混合乳化，通过背部皮下或皮内多点注射方式 balb/c鼠，之后每隔2-4周加强免疫1次，加强免疫时用弗氏不完全佐剂替换弗氏完全佐 剂。采用常规elisa流程监测免疫效果，至balb/c鼠血清效价不再上升后，随后分离免 疫小鼠脾细胞、脾细胞与鼠源骨髓瘤细胞sp2/0融合、半固体培养基对杂交瘤细胞的选择性 培养操作按照专利文献cn103849604a的方法完成，待半固体培养基上长出针尖白色斑点 后，将白色斑点分别挑取到内置杂交瘤常规培养基的96孔培养板，从而获得单克隆杂交瘤 资源库。
61.参考专利文献cn103849604a的方法获取上述单克隆杂交瘤培养上清即单克隆抗体，将 上述制备获得的aft-yjfzp008按8μg/孔、2μg/孔、0.5μg/孔、0.1μg/孔的梯度固定在 96孔酶标板等固相载体上，再用间接非竞争elisa程序鉴定每一单克隆抗体，挑取阳性克 隆，获得aft-yjfzp008单克隆抗体，并用于进一步应用研究工作，优选经检测具有特异性 强、亲和力高的aft-yjfzp008单克隆抗体。
62.实施例3黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft-yjfzp008的特异性兔源多克隆抗体制备
63.利用aft-yjfzp008作为免疫抗原，采用常规方式免疫新西兰大白兔等试验兔，再
利用 已知常规的兔多克隆抗体制备技术方案即可研制获得。
64.将上述制备获得的aft-yjfzp008直接用作抗原，以浓度不低于0.1mg/ml的溶液与弗 氏完全佐剂等体积混合乳化，通过背部皮下或皮内多点注射方式新西兰大白兔，之后每隔2
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4周加强免疫1次，加强免疫时用弗氏不完全佐剂替换弗氏完全佐剂。采用常规elisa流程 监测免疫效果，至免疫动物血清效价不再上升后，通过常规方法制备获得免疫动物的血清， 即为黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft-yjfzp008的兔源多克隆抗体。
65.实施例4黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft-yjfzp008的免疫快速检测方法建立
66.aft-yjfzp008的免疫快速检测方法即双抗夹心间接非竞争elisa方法的基本操作程 序：酶标板中包被aft-yjfzp008的纳米抗体，洗板；加入封闭液封闭，洗板；加入aft
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yjfzp008或待测液反应，洗板；加入aft-yjfzp008兔源多克隆抗体反应，洗板；加入辣 根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体反应，洗板；加入显色液反应；加入终止液，酶标仪读取并 计算结果。以下工作均采用该基本程序完成。
67.抗体浓度的确定：采用设计棋盘滴定法同时进行多个平行实验，采用不同浓度的上述纳 米抗体包被，另外将上述兔源多克隆抗体设置为不同浓度，最终根据结果确定纳米抗体和兔 源多克隆抗体的一个适宜工作浓度，即在节省抗体用量的原则下选择od450nm值近似1.0 的点所对应的上述两种抗体浓度，elisa结果研究表明，上述纳米抗体和兔源多克隆抗体的 其他浓度也可以实现检测，纳米抗体的一个适宜包被浓度为2.2μg/ml，兔源多克隆抗体的 一个适宜浓度为2.8μg/ml。
68.最佳抗体包被条件的确定：包被是elisa方法研究的第一步，包被效果的好坏对 elisa的结果有着非常关键的影响。为确定不同包被条件对检测结果的影响，选择了4℃包 被过夜、37℃恒温包被2h、37℃恒温包被1h三种不同的条件包被在孔内，检测结果表明， 研究的三种包被方式均可以实现包被，4℃下包被过夜为最佳包被条件。
69.最佳封闭剂的确定：抗体完成包被以后，为了避免酶标板孔未被占用的位点对elisa 后续的步骤造成干扰，需要利用一些惰性蛋白即封闭剂来占用这些位点，而不适当的封闭剂 会与二抗非特异性结合，造成假阳性的情况。本研究采用3％bsa/pbst、3％脱脂奶粉 /pbst、5％脱脂奶粉/pbst三种不同的封闭剂进行封闭，研究结果表明，虽然三种封闭剂均 可不同程度的达到封闭的目的，5％脱脂奶粉/pbst的封闭效果最佳，为最佳封闭剂。
70.封闭时间的确定：研究分别设置37℃恒温封闭1h、2h、3h三种不同的封闭时长进行封 闭，检测的结果表明37℃、封闭2h的设置下阳性孔od450nm值/阴性孔od450nm值的数 值最大，阳性样品od450nm值＞1，因此37℃恒温封闭2h为最佳封闭时间。
71.上述兔源多克隆抗体反应时间的确定：研究分别采用37℃恒温反应30min、50min、1h 三个反应时长进行反应，检测结果表明：37℃恒温下反应50min为上述兔源多克隆抗体的 最佳反应时间。
72.黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft-yjfzp008的elisa标准曲线绘制：将aft
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yjfzp008分子分别稀释至0.00003、0.0003、0.003、0.03、0.3、3、30、300ng/ml，每孔 200μl入孔，采用上述最佳条件绘制aft-yjfzp008的elisa标准曲线。在上述最佳优化 条件下建立的双抗夹心酶联免疫吸附分析方法的相关系数达0.99，对aft-yjfzp008分子检 测限可达到0.05ng/ml，表明该检测方法具有良好的检测灵敏度和准确度。
73.方法特异性评价：为评价黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft-yjfzp008的上述免疫 检测方法的特异性，研究选取几株与黄曲霉菌具有一定同源性的真菌尖孢镰刀菌、黑曲霉、 赭曲霉菌、串珠镰刀菌等，通过对这些真菌培养物的细胞破碎液进行检测，结果见表1，上 述方法对与黄曲霉菌有同源性的真菌的蛋白质均无明显的交叉反应，表明建立的黄曲霉毒素 产毒菌产毒力指示分子aft-yjfzp008免疫快速检测方法具有良好的特异性。
74.表1.黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子免疫快速检测方法特异性测定结果
[0075][0076]
方法重复性评价：为评价上述建立的黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft-yjfzp008 免疫快速检测方法的重复性，随机取4株黄曲霉毒素的产毒菌株——阳性1、阳性2、阳性 3、阳性4和1株黄曲霉毒素的不产毒菌株——阴性5研究，对测定结果的板内、板间的数 据变异进行分析。上述研究结果见表2，经计算板内变异系数为0.6％-5.7％，板间的变异系 数为1.2％-9.1％，均在10％以下，因此，上述方法具有良好的重复性。
[0077]
表2.产毒力指示分子aft-yjfzp008免疫快速检测方法重复性测定结果
[0078][0079]
方法准确度评价：为了评价上述方法的检测准确度，同时也是为了考察方法的实用性， 选择花生和玉米样品为例进行研究评价，在玉米和花生样品中添加黄曲霉毒素产毒菌产毒力 指示分子aft-yjfzp008，检测结果的回收率越接近100％，说明方法越准确、越实用。该 研究结果见表3，结果表明，上述建立的检测方法用于检测花生和玉米中产毒力指示分子 aft-yjfzp008，其回收率达到了83％-106％，说明该方法准确度高，可以应用到实际样品 检测中去，具有良好的实用性。
[0080]
表3.黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子免疫快速检测方法添加回收试验结果
[0081][0082][0083]
实施例5黄曲霉毒素绿色防控材料植物精油的筛选
[0084]
1)待筛选植物精油的制备：可通过常规的植物精油制备方法制备获得，也可以通过商 业购买获得。本实施例仅以购买获得的锡兰肉桂精油(cinnamomun verum)、罗勒精油 (ocimum basilicum)、亚香茅精油(cymbopogon nardus)、薄荷精油(mentha arvensis)、蓝 桉精油(eucalyptus globules)共5种绿色材料植物精油为例阐述本发明技术方案的用途，但 不只限于这些植物精油。
[0085]
2)黄曲霉毒素产毒菌的制备：以《中国典型花生产区黄曲霉菌分布、产毒力与侵染研 究》——中国农业科学院硕士学位论文，作者张杏，第33页——公布的黄曲霉毒素产毒菌 株hundx-7为例，挑取少量hundx-7菌株的菌液，接种在dg18固体培养基上活化，28℃ 恒温黑暗条件倒置培养，待dg18培养基上长满黄绿色孢子后，取0.1％吐温水冲洗孢子， 收集即制成孢子悬浮液，高倍显微镜下进行计数，计算孢子悬浮液中孢子浓度，取上述孢子 悬浮液转移至200ml的沙氏液体培养基中，至孢子终浓度为5
×
105cfu/ml。
[0086]
3)防控试验：将上述5种植物精油少量分别与黄曲霉毒素产毒菌株孢子悬浮液共同培 养于含有中花6号花生粉末的沙氏液体培养基中，植物精油体积浓度最终不高于200μl/ml ——本实施例取20μl/ml，28℃200rpm共培养1天，每个处理设置3个重复，其中用沙 氏培养基代替待筛选菌株培养一定时间则获得对照组。
[0087]
4)指示分子aft-yjfzp008含量的测定与绿色防控材料的选择：采用实施例4建立的 方法，测定上述试验处理组和对照组指示分子aft-yjfzp008含量，通过如下方式计算待筛 选菌株对aft-yjfzp008的抑制率：
[0088]
aft-yjfzp008抑制率＝(对照组aft-yjfzp008含量-处理组aft-yjfzp008含量)/对 照组aft-yjfzp008含量
×
100％
[0089]
上述研究结果见表5，结果表明，不同菌株之间aft-yjfzp008抑制率存在显著差异， aft-yjfzp008抑制率越高，则表明同时抑制黄曲霉毒素源头合成及其产毒菌生长的效果越 好，由此推断并筛选出效果较好的黄曲霉毒素绿色防控材料，可以用于进一步制剂研制与开 发利用。
[0090]
表5待筛选的12种绿色防控材料对aft-yjfzp008抑制效果
[0091][0092][0093]
5)验证确认：为进一步验证上述一步法筛选结果的可靠性，采用常规多步法——抑菌 试验 抑制产毒试验。
[0094]
将上述步骤1)的植物精油与2)最终孢子悬浮液共培养于沙氏液体培养基中，28℃ 200rpm共培养1天，每个处理设置3个重复，其中用沙氏培养基代替待筛选菌株培养一定 时间则获得对照组。采用《gb 5009.22-2016食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素b族和g 族的测定》中的高效液相色谱-质谱联用方法测定处理组与对照组黄曲霉毒素水平，通过如 下方式计算待筛选菌株对黄曲霉毒素的抑制率：
[0095]
黄曲霉毒素抑制率＝(对照组黄曲霉毒素含量-处理组黄曲霉毒素含量)/对照组黄曲霉 毒素含量
×
100％
[0096]
上述黄曲霉毒素抑制率计算结果见表6。
[0097]
通过将上述菌丝洗净、晾干，测定处理组与对照组菌丝干重，通过如下方式计算待筛选 菌株对产毒菌的抑制率：
[0098]
产毒菌抑制率＝(对照组产毒菌干重-处理组产毒菌干重)/对照组产毒菌干重
×
100％
[0099]
计算对产毒菌生长抑制效果，结果见表6。
[0100]
表6上述待筛选的12株绿色防控材料对黄曲霉毒素与产毒菌生长抑制效果
[0101][0102]
根据上述研究结果，锡兰肉桂精油(材料01)对黄曲霉毒素与产毒菌生长抑制效果显 著优于其他菌株，由此确认本发明技术方案结果是正确可靠。
[0103]
实施例6黄曲霉毒素仿生绿色防控材料的筛选
[0104]
1)待筛选仿生绿色防控材料的制备：本实施例仅以人工合成的3种仿生绿色防控材料
[0105]
上述3种仿生绿色防控材料柠檬醛衍生物制备方法如下：柠檬肟的合成路线如下所示， 具体步骤为：将柠檬醛(500mg，3.28mmol)和盐酸羟胺(290mg，4.17mmol)溶于5ml水 中，将碳酸氢钠(345mg，4.11mmol)溶于10ml水中，构成反应体系。缓慢将溶有 nahco3的水溶液滴加到上述反应体系中，55℃下搅拌5小时后，对水层用乙醚萃取3次， 合并乙醚有机相，再用无水na2so4干燥乙醚有机相过夜，再过滤去除固体，对干燥后的乙 醚有机相减压浓缩，再经过快速硅胶柱层析分离，最终获得的黄色油状液体即为柠檬肟。
[0106][0107]
仿生绿色防控材料的合成：合成路线如下所示，具体步骤为：将4-甲基苯甲酸或者4
‑ꢀ
溴苯丁酸或者4-碘苯丁酸0.75mmol与tbtu、dmap溶于无水ch2cl2，室温下搅拌30min， 将上述柠檬肟100mg加入，搅拌反应6h后，再加水淬灭反应，用nahco3和饱和nacl溶 液洗涤三遍，无水na2so4干燥过夜，再过滤，滤液经减压浓缩、快速硅胶柱层析分离，最 终获得的油状液体即为柠檬醛仿生物质即仿生绿色防控材料。上述合成中，反应原料采用4
‑ꢀ
甲基苯甲酸或者4-溴苯丁酸或者4-碘苯丁酸，对应的产物即仿生绿色防控材料依次为：3,7
‑ꢀ
二甲基-2,6-辛二烯醛肟-(4-甲基苯甲酰基)酯——ie、3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醛肟-o-(4
‑ꢀ
(4-溴苯基)丁酰基)酯——iic、3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醛肟-o-(4-(4-碘苯基)丁酰基) 酯——iie。
[0108][0109]
其中含r的反应原料rcooh分别为4-甲基苯甲酸或者4-溴苯丁酸或者4-碘苯丁酸，对应 的产物依次为：3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛肟-(4-甲基苯甲酰基)酯——ie、3,7-二甲基-2,6-辛 二烯-1-醛肟-o-(4-(4-溴苯基)丁酰基)酯——iic、3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醛肟-o-(4
‑ꢀ
(4-碘苯基)丁酰基)酯——iie。
[0110]
2)黄曲霉毒素产毒菌的制备：以《中国典型花生产区黄曲霉菌分布、产毒力与侵染研 究》——中国农业科学院硕士学位论文，作者张杏，第33页——公布的黄曲霉毒素产毒菌 株hundx-7为例，挑取少量hundx-7菌株的菌液，接种在dg18固体培养基上活化，28℃ 恒温黑暗条件倒置培养，待dg18培养基上长满黄绿色孢子后，取0.1％吐温水冲洗孢子， 收集即制成孢子悬浮液，高倍显微镜下进行计数，计算孢子悬浮液中孢子浓度，取上述孢子 悬浮液转移至200ml的沙氏液体培养基中，至孢子终浓度为5
×
105cfu/ml。
[0111]
3)防控试验：将上述系列待筛选仿生绿色防控材料即仿生物质柠檬醛衍生物分别与黄 曲霉毒素产毒菌株孢子悬浮液共同培养于含有鲁花8号花生粉末的沙氏液体培养基中，待筛 选仿生绿色防控材料终浓度不高于200μl/ml——本实施例取30μl/ml，在28℃200rpm 共培养1天，每个处理设置3个重复，其中用沙氏培养基代替待筛选菌株培养一定时间则获 得对照组。
[0112]
4)指示分子aft-yjfzp008含量的测定与绿色防控材料的选择：采用实施例4建立的 方法，测定上述试验处理组和对照组指示分子aft-yjfzp008含量，通过如下方式计算待筛 选菌株对aft-yjfzp008的抑制率：
[0113]
抑制率＝(对照组aft-yjfzp008含量-处理组aft-yjfzp008含量)/对照组aft
‑ꢀ
yjfzp008含量
×
100％
[0114]
计算绿色防控材料对aft-yjfzp008的抑制率，结果见表7。根据aft-yjfzp008抑制 率越高，则表明同时抑制黄曲霉毒素源头合成及其产毒菌生长的效果越好的原则，由表7很 容易筛选出效果较好的黄曲霉毒素绿色防控材料即仿生物质3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醛肟
‑ꢀ
o-(4-(4-碘苯基)丁酰基)酯——iie，可以用于进一步生防制剂研制与利用。
[0115]
表7待筛选的3种绿色防控材料对aft-yjfzp008抑制效果
[0116][0117]
上述实施例5和6中的黄曲霉产毒菌hundx-7只是一个列举，并不限于此，使用其他 黄曲霉产毒菌如黄曲霉菌标准产毒菌株3.4408也可。
[0118]
综合上述实例，本发明技术方案可用于一步式筛选出同时抑制黄曲霉毒素源头合成及其 产毒菌生长的黄曲霉毒素绿色防控材料，易操作，实用性强，容易推广应用，对发展黄曲霉 毒素微生物防控技术与保障食品安全具有重要意义。