一种通过双菌种共发酵制备裂褶多糖和麦角硫因的方法与流程

1.本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种通过双菌种共发酵制备裂褶多糖和麦角硫因的方法。


背景技术：

2.麦角硫因(egt)，化学名为2-巯基组氨酸三甲基内盐，是一种稀有的天然手性氨基酸。麦角硫因在抗氧化、清除自由基、螯合金属离子、防紫外辐射损伤、抑制癌症等方面具有独特的生理功能，并且在某些方面具有比谷胱甘肽等天然抗氧化剂更优越的生理功能，目前广泛应用于食品添加剂、保健品、化妆品等领域。目前，麦角硫因的生产方法多采用单一食用菌液体发酵方式，再将发酵后的产物进行后处理，最终获得麦角硫因。但采用现有的生产方法获得的麦角硫因产量普遍不高，不能满足日益增长的市场需求。
3.裂褶多糖(spg)是裂褶菌发酵得到的水溶性多糖，具有抑制肿瘤、抗菌消炎、抗辐射、提高机体免疫力等多种生理活性。目前，裂褶多糖的生产方法多采用单一食用菌液体发酵方式，再将发酵后的产物进行后处理，最终得到裂褶多糖。但发酵得到的裂褶多糖难于重新溶解、不利于生物吸收等特性，极大的限制了其应用。
4.cn109939027a公开了一种猴头菌发酵获得含麦角硫因的化妆品原液的制备方法，包括如下步骤：(1)将猴头菌菌丝接种到液体种子培养基中培养，得到种子液；(2)将种子液接种到发酵培养基中发酵并添加麦角硫因前体物质，发酵至终点，得到发酵液；步骤3：对含有菌丝体的发酵液进行处理，得到含麦角硫因的发酵原液作为含麦角硫因的化妆品原液。该方法为目前广泛应用的麦角硫因的生产方法，其采用单一食用菌液体发酵方式，再将发酵后的产物进行后处理，因此，该原液产品含有300mg/l左右的麦角硫因。
5.cn112195215a公开了一种榆黄菇松蕈菌丝体联合发酵生产麦角硫因的方法，步骤如下：取松蕈菌丝体接种到培养获得的榆黄菇种子液中并补加一定量的种子培养基，继续培养2-3天；将培养获得的含有榆黄菇和松蕈的种子液以5-20％发酵培养基体积的接种量接种到发酵培养基中并添加前体物质，发酵2-4天后补加少量前体物质，继续发酵3-4天；对发酵后的发酵液进行处理，得到含有麦角硫因的溶液。该发明选用榆黄菇和松蕈作为麦角硫因的生产菌种，通过联合发酵的方式达到提高麦角硫因产率的目的，最终发酵液中的麦角硫因含量可达到880mg/l左右，但该麦角硫的产率还具有提升空间。
6.cn107557407a公开了一种调控裂褶菌发酵产物裂褶多糖分子量的方法，该方法取裂褶菌斜面菌种采用pda培养基试管斜面接种培育，制得发酵种子液；将种子培养液接入发酵罐中发酵，分别控制发酵条件，发酵结束后放料，除去菌丝体；后处理，得精制裂褶多糖。该发明方法采用单一食用菌液体发酵方式，因此在裂褶菌发酵需要分别控制发酵条件，制备工艺复杂。
7.cn113337545a公开了一种裂褶菌发酵产物及其制备方法、护肤品、裂褶菌培养基。该裂褶菌发酵产物的制备方法，包括：在裂褶菌培养基中培养裂褶菌，然后收集发酵产物；其中，所述裂褶菌培养基中含有葛根。在培养基中加入葛根粉末培养裂褶菌，收集发酵产
物。该发明通过在裂褶菌培养基中含有葛根的方法，提高裂褶菌发酵产物的抗氧化水平。
8.因此，亟需开发一种通过双菌种共发酵制备裂褶多糖和麦角硫因的方法。


技术实现要素：

9.针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种通过双菌种共发酵制备裂褶多糖和麦角硫因的方法，所述方法将裂褶菌和制备麦角硫因的菌种共发酵，发现双菌种共发酵，能发挥协同作用，可以显著提高麦角硫因的产率，且获得的共发酵液具有显著的抗氧化和清除自由基的能力。
10.为达此目的，本发明采用以下技术方案：
11.第一方面，本发明提供一种通过双菌种共发酵制备裂褶多糖和麦角硫因的方法，所述方法包括以下步骤：将裂褶菌的发酵种子液和蕈菌的发酵种子液接种至共发酵培养基进行共发酵培养，得到含裂褶多糖和麦角硫因的发酵液。
12.在本发明中，将裂褶菌和制备麦角硫因的菌种共发酵，发现双菌种共发酵，不仅不会发生竞争现象，还能发挥协同作用，使得从菌丝体中大量制备麦角硫因，确保麦角硫因产品质量，显著提高麦角硫因的产率；且制备工艺简单，尤其适用于麦角硫因的规模化生产。
13.特别地，由于最终获得的发酵液中含有裂褶多糖和麦角硫因，所述裂褶多糖和麦角硫因相互配合，具有协同增效的作用，能进一步提高所述组合物对于dpph自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基的清除作用，可增强皮肤组织的抗氧化能力，降低皮肤组织自由基含量，发挥延缓皮肤光老化的作用。
14.优选地，所述共发酵培养基按质量百分含量计由如下组分组成：葡萄糖0.5-5％、胰蛋白胨0.5-3％、酵母浸膏0.1-3％、酵母抽提物0.1-0.5％、硫酸镁0.01-0.15％和磷酸二氢钾0.05-0.2％，余量为水。
15.在本发明中，选择适宜的培养基，使得裂褶菌和蕈菌能够进行共发酵培养，有利于两个菌种发挥协同作用，并进一步提高麦角硫因的产率。
16.以所述共发酵培养基质量为100％计，葡萄糖的含量为0.5-5％，例如可以是0.5％、0.6％、0.8％、1％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2％、2.2％、2.4％、2.6％、2.8％、3％、3.2％、3.4％、3.6％、3.8％、4％、4.2％、4.4％、4.6％、4.8％、5％等，优选为3-5％。
17.以所述共发酵培养基质量为100％计，胰蛋白胨的含量为0.5-3％，例如可以是0.5％、0.6％、0.8％、1％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2％、2.2％、2.4％、2.6％、2.8％、3％等，优选为2-3％。
18.以所述共发酵培养基质量为100％计，酵母浸膏的含量为0.1-3％，例如可以是0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.8％、1％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2％、2.2％、2.4％、2.6％、2.8％、3％等，优选为2-3％。
19.以所述共发酵培养基质量为100％计，酵母抽提物的含量为0.1-0.5％，例如可以是0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％等。
20.以所述共发酵培养基质量为100％计，硫酸镁的含量为0.01-0.15％，例如可以是0.01％、0.02％、0.04％、0.06％、0.08％、0.1％、0.12％、0.15％等。
21.以所述共发酵培养基质量为100％计，磷酸二氢钾的含量为0.05-0.2％，例如可以是0.05％、0.06％、0.08％、0.1％、0.12％、0.15％、0.18％、0.2％等。
22.优选地，所述共发酵培养基的ph为5.5-7.0，例如可以是5.5、5.6、5.8、6.0、6.2、6.5、6.7、6.9、7.0等。
23.优选地，所述裂褶菌的发酵种子液中菌体的质量百分含量为5-30％，例如可以是5％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％、30％等。
24.优选地，所述蕈菌的发酵种子液中菌体的质量百分含量为5-30％，例如可以是5％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％、30％等。
25.优选地，所述共发酵培养基中，裂褶菌的发酵种子液的接种量为2-20wt％，例如可以是2wt％、3wt％、4wt％、5wt％、6wt％、7wt％、8wt％、9wt％、10wt％、11wt％、12wt％、13wt％、14wt％、15wt％、16wt％、17wt％、18wt％、19wt％、20wt％等。
26.优选地，所述共发酵培养基中，蕈菌的发酵种子液的接种量为5-20wt％，例如可以是5wt％、6wt％、7wt％、8wt％、9wt％、10wt％、11wt％、12wt％、13wt％、14wt％、15wt％、16wt％、17wt％、18wt％、19wt％、20wt％等。
27.优选地，所述共发酵培养的具体步骤为：将裂褶菌的发酵种子液和蕈菌的发酵种子液接种至装有共发酵培养基的摇瓶中，置于恒温摇床中进行震荡培养。
28.优选地，所述震荡培养的温度为28-30℃，例如可以是28℃、28.5℃、29℃、29.5℃、30℃等，震荡培养的转速为100-150r/min，例如可以是100r/min、110r/min、120r/min、140r/min、150r/min等，震荡培养的时间为3-5天，例如可以是3天、3.5天、4天、4.5天、5天等。
29.优选地，所述共发酵培养后还包括超声和/或离心。
30.优选地，所述超声的功率为400-1000，例如可以是400w、500w、600w、700w、800w、900w、1000w等，超声的时间为5-20min，例如可以是5min、6min、8min、10min、12min、14min、16min、18min、20min等。
31.优选地，所述离心的转速为8000-10000r/min，例如可以是8000r/min、8500r/min、9000r/min、9500r/min等，离心的时间为5-10min，例如可以是5min、6min、7min、8min、9min、10min等。
32.优选地，所述裂褶菌的发酵种子液由以下制备方法制备得到：
33.(a)将裂褶菌接种到pda培养基中进行活化培养，得到活化种子；
34.(b)将步骤(a)得到的活化种子接种到液体培养基中进行种子培养，得到裂褶菌的发酵种子液。
35.优选地，步骤(a)中，所述活化培养的温度为24-26℃，例如可以是24℃、25.5℃、25℃、25.5℃、26℃等，活化培养的时间为2-5天，例如可以是2天、2.5天、3天、3.5天、4天、5天等。
36.优选地，步骤(b)中，所述液体培养基按质量百分含量计由以下组分组成：葡萄糖0.5-2％、酵母浸膏0.1-2％、硫酸镁0.01-0.15％和磷酸二氢钾0.05-0.2％，余量为水。
37.以所述液体培养基的质量为100％计，所述，葡萄糖的含量为0.5-2％，例如可以是0.5％、0.6％、0.8％、1％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2％等。
38.以所述液体培养基的质量为100％计，所述，酵母浸膏的含量为0.1-2％，例如可以是0.1％、0.2％、0.5％、0.6％、0.8％、1％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2％等。
39.以所述液体培养基的质量为100％计，所述，硫酸镁的含量为0.01-0.15％，例如可
以是0.01％、0.02％、0.04％、0.06％、0.08％、0.1％、0.12％、0.15％等。
40.以所述液体培养基质量为100％计，磷酸二氢钾的含量为0.05-0.2％，例如可以是0.05％、0.06％、0.08％、0.1％、0.12％、0.15％、0.18％、0.2％等。
41.优选地，步骤(b)中，所述种子培养在恒温摇床中进行，培养的温度为24-26℃，例如可以是24℃、25.5℃、25℃、25.5℃、26℃等，培养的转速为150-200r/min，例如可以是150r/min、160r/min、170r/min、180r/min、190r/min、200r/min等，培养的时间为3-5天，例如可以是3天、3.5天、4天、4.5天、5天等。
42.优选地，所述蕈菌的发酵种子液由以下制备方法制备得到：将蕈菌的菌丝体接种到种子培养基中进行种子培养，得到蕈菌的发酵种子液。
43.优选地，所述蕈菌包括猴头菇、糙皮侧耳、灵芝、杏鲍菇、凤尾菇、榆黄菇、松蕈、平菇或木耳中的任意一种或至少两种的组合。
44.优选地，所述种子培养基按质量百分含量计由以下组分组成：蔗糖1-10％、豆饼粉3-5％、玉米粉1-3％、维生素b10.1-0.3％、硫酸镁0.01-0.15％和磷酸二氢钾0.05-0.2％，余量为水。
45.以所述种子培养基的质量为100％计，所述蔗糖含量为1-10％，例如可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％等。
46.以所述种子培养基的质量为100％计，所述豆饼粉含量为3-5％，例如可以是3％、3.5％、4％、4.5％、5％等。
47.以所述种子培养基的质量为100％计，所述玉米粉含量为1-3％，例如可以是1％、1.5％、2％、2.5％、3％等。
48.以所述种子培养基的质量为100％计，所述维生素b1含量为0.1-0.3％，例如可以是0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％等。
49.以所述种子培养基的质量为100％计，所述，硫酸镁的含量为0.01-0.15％，例如可以是0.01％、0.02％、0.04％、0.06％、0.08％、0.1％、0.12％、0.15％等。
50.以所述种子培养基质量为100％计，磷酸二氢钾的含量为0.05-0.2％，例如可以是0.05％、0.06％、0.08％、0.1％、0.12％、0.15％、0.18％、0.2％等。
51.优选地，所述种子培养在恒温摇床中进行，培养的温度为23-25℃，例如可以是23℃、23.5℃、24℃、24.5℃、25℃等，培养的转速为160-180r/min，例如可以是160r/min、165r/min、170r/min、175r/min、180r/min等，培养的时间为1-3天，例如可以是1天、1.5天、2天、2.5天、3天等。
52.优选地，所述含裂褶多糖和麦角硫因的发酵液中，麦角硫因的含量为900mg/l以上，例如可以900mg/l、920mg/l、940mg/l、960mg/l、980mg/l、1000mg/l、1100mg/l、1200mg/l、1400mg/l、1600mg/l、2000mg/l等，优选为950-1050mg/l。
53.优选地，所述含裂褶多糖和麦角硫因的发酵液中，裂褶多糖的含量为9g/l以上，例如可以9g/l、10g/l、11g/l、12g/l、13g/l、14g/l、15g/l、16g/l、18g/l、20g/l等，优选为9-12g/l。
54.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
55.(1)本发明将裂褶菌和制备麦角硫因的菌种共发酵，发现双菌种共发酵，不仅不会发生竞争现象，还能发挥协同作用，使得从菌丝体中大量制备麦角硫因，确保麦角硫因产品
质量，显著提高麦角硫因的产率；且制备工艺简单，尤其适用于麦角硫因的规模化生产；
56.(2)本发明最终获得的发酵液中含有裂褶多糖和麦角硫因，所述裂褶多糖和麦角硫因相互配合，具有协同增效的作用，能进一步提高所述组合物对于dpph自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基的清除作用，可增强皮肤组织的抗氧化能力，降低皮肤组织自由基含量，发挥延缓皮肤光老化的作用。
具体实施方式
57.下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
58.以下实施例和对比例中未注明具体技术或条件者，均可按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品或可通过现有技术进行制备得到。
59.制备例1
60.本制备例提供一种裂褶菌的发酵种子液，所述裂褶菌的发酵种子液由以下制备方法制备得到：
61.(a)将裂褶菌接种到pda培养基中，于24℃下活化培养3天，得到活化种子，并将其于4℃下保存进行保种处理；
62.其中，所述pda培养基按质量百分含量计由如下组分组成：马铃薯20％、葡萄糖2％和琼脂2％，余量为水；配置完pda培养基在121℃下进行20min的灭菌处理；
63.(b)将步骤(a)得到的活化种子接种至装有液体培养基的摇瓶中，置于恒温摇床中进行震荡培养，培养的温度为24℃，培养的转速为150r/min，培养的时间为3天，得到菌体质量含量为10％的裂褶菌的发酵种子液；
64.其中，所述液体培养基按质量百分含量计由以下组分组成：葡萄糖1％、酵母浸膏1％、硫酸镁0.05％和磷酸二氢钾0.1％，余量为水；配置完液体培养基在121℃下进行20min的灭菌处理。
65.制备例2
66.本制备例提供一种裂褶菌的发酵种子液，所述裂褶菌的发酵种子液由以下制备方法制备得到：
67.(a)将裂褶菌接种到pda培养基中，于25℃下活化培养4天，得到活化种子，并将其于4℃下保存进行保种处理；
68.其中，所述pda培养基按质量百分含量计由如下组分组成：马铃薯20％、葡萄糖2％和琼脂2％，余量为水；配置完pda培养基在121℃下进行20min的灭菌处理；
69.(b)将步骤(a)得到的活化种子接种至装有液体培养基的摇瓶中，置于恒温摇床中进行震荡培养，培养的温度为25℃，培养的转速为180r/min，培养的时间为4天，得到菌体质量含量为18％的裂褶菌的发酵种子液；
70.其中，所述液体培养基按质量百分含量计由以下组分组成：葡萄糖1％、酵母浸膏1％、硫酸镁0.05％和磷酸二氢钾0.1％，余量为水；配置完液体培养基在121℃下进行20min的灭菌处理。
71.制备例3
72.本制备例提供一种裂褶菌的发酵种子液，所述裂褶菌的发酵种子液由以下制备方法制备得到：
73.(a)将裂褶菌接种到pda培养基中，于26℃下活化培养5天，得到活化种子，并将其于4℃下保存进行保种处理；
74.其中，所述pda培养基按质量百分含量计由如下组分组成：马铃薯20％、葡萄糖2％和琼脂2％，余量为水；配置完pda培养基在121℃下进行20min的灭菌处理；
75.(b)将步骤(a)得到的活化种子接种至装有液体培养基的摇瓶中，置于恒温摇床中进行震荡培养，培养的温度为26℃，培养的转速为200r/min，培养的时间为5天，得到菌体质量含量为25％的裂褶菌的发酵种子液；
76.其中，所述液体培养基按质量百分含量计由以下组分组成：葡萄糖1％、酵母浸膏1％、硫酸镁0.05％和磷酸二氢钾0.1％，余量为水；配置完液体培养基在121℃下进行20min的灭菌处理。
77.制备例4
78.本制备例提供一种蕈菌的发酵种子液，所述蕈菌的发酵种子液由以下制备方法制备得到：将猴头菇的菌丝体接种至装有液体培养基的摇瓶中，置于恒温摇床中进行震荡培养；培养的温度为23℃，培养的转速为160r/min，培养的时间为1天，得到菌体质量含量为12％的猴头菇菌的发酵种子液；
79.其中，所述种子培养基按质量百分含量计由以下组分组成：蔗糖5％、豆饼粉4％、玉米粉2％、维生素b10.2％、硫酸镁0.1％和磷酸二氢钾0.05％，余量为水；配置完种子培养基在121℃下进行20min的灭菌处理。
80.制备例5
81.本制备例提供一种蕈菌的发酵种子液，所述蕈菌的发酵种子液由以下制备方法制备得到：将糙皮侧耳的菌丝体接种至装有液体培养基的摇瓶中，置于恒温摇床中进行震荡培养；培养的温度为24℃，培养的转速为170r/min，培养的时间为2天，得到菌体质量含量为23％的糙皮侧耳的发酵种子液；
82.其中，所述种子培养基按质量百分含量计由以下组分组成：蔗糖6％、豆饼粉3％、玉米粉1％、维生素b10.3％、硫酸镁0.1％和磷酸二氢钾0.05％，余量为水；配置完种子培养基在121℃下进行20min的灭菌处理。
83.制备例6
84.本制备例提供一种蕈菌的发酵种子液，所述蕈菌的发酵种子液由以下制备方法制备得到：将松蕈的菌丝体接种至装有液体培养基的摇瓶中，置于恒温摇床中进行震荡培养；培养的温度为23℃，培养的转速为180r/min，培养的时间为3天，得到菌体质量含量为30％的松蕈的发酵种子液；
85.其中，所述种子培养基按质量百分含量计由以下组分组成：蔗糖6％、豆饼粉3％、玉米粉1％、维生素b10.3％、硫酸镁0.1％和磷酸二氢钾0.05％，余量为水；配置完种子培养基在121℃下进行20min的灭菌处理。
86.实施例1
87.本实施例提供一种通过双菌种共发酵制备裂褶多糖和麦角硫因的方法，所述方法具体包括以下步骤：
88.(1)将制备例1提供的裂褶菌的发酵种子液和制备例4提供的蕈菌的发酵种子液接种至装有共发酵培养基的摇瓶中，置于恒温摇床中进行震荡培养，得到发酵液；
89.其中，所述共发酵培养基按质量百分含量计由如下组分组成：葡萄糖3％、胰蛋白胨3％、酵母浸膏3％、酵母抽提物0.3％、硫酸镁0.1％和磷酸二氢钾0.05％，余量为水，ph为6.0；
90.其中，裂褶菌的发酵种子液的接种量为10wt％，蕈菌的发酵种子液的接种量为10wt％；所述震荡培养的温度为28℃，震荡培养的转速为120r/min，震荡培养的时间为4天；
91.(2)将步骤(1)得到的发酵液先在800w的功率下超声15min，再于9000r/min的转速下离心8min，滤掉菌丝，得到含裂褶多糖和麦角硫因的发酵液。
92.实施例2
93.本实施例提供一种通过双菌种共发酵制备裂褶多糖和麦角硫因的方法，所述方法具体包括以下步骤：
94.(1)将制备例2提供的裂褶菌的发酵种子液和制备例5提供的蕈菌的发酵种子液接种至装有共发酵培养基的摇瓶中，置于恒温摇床中进行震荡培养，得到发酵液；
95.其中，所述共发酵培养基按质量百分含量计由如下组分组成：葡萄糖5％、胰蛋白胨2％、酵母浸膏2％、酵母抽提物0.2％、硫酸镁0.1％和磷酸二氢钾0.06％，余量为水，ph为6.5；
96.其中，裂褶菌的发酵种子液的接种量为12wt％，蕈菌的发酵种子液的接种量为8wt％；所述震荡培养的温度为28℃，震荡培养的转速为110r/min，震荡培养的时间为4天；
97.(2)将步骤(1)得到的发酵液先在1000w的功率下超声5min，再于8000r/min的转速下离心10min，滤掉菌丝，得到含裂褶多糖和麦角硫因的发酵液。
98.实施例3
99.本实施例提供一种通过双菌种共发酵制备裂褶多糖和麦角硫因的方法，所述方法具体包括以下步骤：
100.(1)将制备例3提供的裂褶菌的发酵种子液和制备例6提供的蕈菌的发酵种子液接种至装有共发酵培养基的摇瓶中，置于恒温摇床中进行震荡培养，得到发酵液；
101.其中，所述共发酵培养基按质量百分含量计由如下组分组成：葡萄糖4％、胰蛋白胨2.5％、酵母浸膏2.5％、酵母抽提物0.1％、硫酸镁0.08％和磷酸二氢钾0.06％，余量为水，ph为5.8；
102.其中，裂褶菌的发酵种子液的接种量为8wt％，蕈菌的发酵种子液的接种量为12wt％；所述震荡培养的温度为30℃，震荡培养的转速为100r/min，震荡培养的时间为3天；
103.(2)将步骤(1)得到的发酵液先在400w的功率下超声20min，再于10000r/min的转速下离心5min，滤掉菌丝，得到含裂褶多糖和麦角硫因的发酵液。
104.实施例4
105.本实施例提供一种通过双菌种共发酵制备裂褶多糖和麦角硫因的方法，与实施例1的区别仅在于，所述裂褶菌的发酵种子液的接种量为15wt％，蕈菌的发酵种子液的接种量为5wt％，其他步骤与实施例1相同。
106.实施例5
107.本实施例提供一种通过双菌种共发酵制备裂褶多糖和麦角硫因的方法，与实施例
1的区别仅在于，所述裂褶菌的发酵种子液的接种量为5wt％，蕈菌的发酵种子液的接种量为15wt％，其他步骤与实施例1相同。
108.实施例6
109.本实施例提供一种通过双菌种共发酵制备裂褶多糖和麦角硫因的方法，与实施例1的区别仅在于，所述共发酵培养基按质量百分含量计由如下组分组成：葡萄糖3％、蛋白胨3％、酵母抽提物4％、硫酸镁0.1％和磷酸二氢钾0.05％，余量为水；其他步骤与实施例1相同。
110.实施例7
111.本实施例提供一种通过双菌种共发酵制备裂褶多糖和麦角硫因的方法，与实施例1的区别仅在于，所述共发酵培养基按质量百分含量计由如下组分组成：葡萄糖3％、蛋白胨3％、酵母浸膏4％、硫酸镁0.1％和磷酸二氢钾0.05％，余量为水；其他步骤与实施例1相同。
112.实施例8
113.本实施例提供一种通过双菌种共发酵制备裂褶多糖和麦角硫因的方法，与实施例1的区别仅在于，震荡培养的温度为26℃，震荡培养的转速为180r/min。
114.实施例9
115.本实施例提供一种通过双菌种共发酵制备裂褶多糖和麦角硫因的方法，与实施例1的区别仅在于，震荡培养的温度为32℃，震荡培养的转速为80r/min，震荡培养的时间为2天。
116.对比例1
117.本对比例提供一种通过单菌种发酵制备裂褶多糖的方法，所述方法具体包括以下步骤：
118.(1)将制备例1提供的裂褶菌的发酵种子液接种至装有发酵培养基的摇瓶中，置于恒温摇床中进行震荡培养，得到发酵液；
119.其中，所述发酵培养基按质量百分含量计由如下组分组成：葡萄糖3％、胰蛋白胨3％、酵母浸膏3％、酵母抽提物0.3％、硫酸镁0.1％和磷酸二氢钾0.05％，余量为水，ph为6.0；
120.其中，裂褶菌的发酵种子液的接种量为15wt％；所述震荡培养的温度为28℃，震荡培养的转速为120r/min，震荡培养的时间为7天；
121.(2)将步骤(1)得到的发酵液于10000r/min的转速下离心5min，滤掉菌丝，得到含裂褶多糖的发酵液。
122.对比例2
123.本对比例提供一种通过单菌种发酵制备制备麦角硫因的的方法，所述方法包括以下步骤：
124.(1)将制备例4提供的蕈菌的发酵种子液接种至装有发酵培养基的摇瓶中，置于恒温摇床中进行震荡培养，得到发酵液；
125.其中，所述发酵培养基按质量百分含量计由如下组分组成：葡萄糖3％、胰蛋白胨3％、酵母浸膏3％、酵母抽提物0.3％、硫酸镁0.1％和磷酸二氢钾0.05％，余量为水，ph为6.0；
126.其中，蕈菌的发酵种子液的接种量为15wt％；所述震荡培养的温度为28℃，震荡培
养的转速为120r/min，震荡培养的时间为5天；
127.(2)将步骤(1)得到的发酵液先在300w的功率下超声3min，再于9000r/min的转速下离心8min，滤掉菌丝，得到含麦角硫因的发酵液。
128.试验例1
129.麦角硫因和裂褶多糖的含量测定
130.测试样品：实施例1-9提供的含裂褶多糖和麦角硫因的发酵液、对比例1提供的含裂褶多糖的发酵液、对比例2提供的含麦角硫因的发酵液；
131.测试方法：对裂褶多糖的标准品、麦角硫因标准品、待测样品进行hplc测定，将样品色谱图与标准溶液色谱图进行对照，根据保留时间确定样品中的麦角硫因峰；以标准品麦角硫因的浓度与相应的峰面积绘制标准曲线，在标准品与样品进样量相同的情况下，用外标法定量，计算出样品中麦角硫因和裂褶多糖的含量；
132.具体测试结果如表1所示：
133.表1
[0134][0135][0136]
由表1测试数据可知，本发明制备得到的含裂褶多糖和麦角硫因的发酵液中，麦角硫因的含量为900mg/l以上，裂褶多糖的含量为9g/l以上。说明在本发明中，将裂褶菌和制
备麦角硫因的菌种共发酵，发现双菌种共发酵，不仅不会发生竞争现象，还能发挥协同作用，使得从菌丝体中大量制备麦角硫因，确保麦角硫因产品质量，显著提高麦角硫因的产率；且制备工艺简单，尤其适用于麦角硫因的规模化生产。
[0137]
测试例2
[0138]
裂褶多糖的分子量和粘度测定
[0139]
测试样品：实施例1-9提供的含裂褶多糖和麦角硫因的发酵液、对比例1提供的含裂褶多糖的发酵液；
[0140]
测试方法：将上述发酵液浓缩至原来的体积的至1/4，再加入5倍体积的85vol％乙醇沉淀，以10000rpm的转速离心弃去上清液，收集沉淀用蒸馏水重新溶解，再采用分子量为5kda的超滤膜过滤除麦角硫因、蛋白质及其他小分子产物，得湿裂褶多糖；将得到湿裂褶多糖置于-20℃下冷冻干燥24h；采用高效凝胶渗透色谱对得到的裂褶多糖测分子量；
[0141]
测试条件为：色谱柱：7.8
×
300mm(ultrahydrogel tm 120，250，1000，由waters corporation提供)；柱温：35℃；流动相：高纯水；流速0.6ml/min；进样量：50μl；
[0142]
具体测试结果如表2所示：
[0143]
表2
[0144]
样品多糖平均分子量(kda)实施例11023实施例2948实施例3923实施例41150实施例51024实施例61168实施例71147实施例81155实施例91073对比例11357
[0145]
由表2测试数据可知，本发明所述含裂褶多糖和麦角硫因的发酵液中，裂褶多糖的分子量在1200kda以下。说明在本发明中，将裂褶菌和制备麦角硫因的菌种共发酵，发现双菌种共发酵，不仅使得从菌丝体中大量制备麦角硫因，而且还能获得分子量相对更低，水溶性更好的裂褶多糖，更加利于生物吸收入体内发挥生物活性，极大的扩展了裂褶多糖的应用。
[0146]
测试例3
[0147]
抗氧化活性测定
[0148]
测试样品：实施例1-9提供的含裂褶多糖和麦角硫因的发酵液、对比例1提供的含裂褶多糖的发酵液、对比例2提供的含麦角硫因的发酵液；
[0149]
测试方法：
[0150]
1、对dpph自由基的清除能力评价
[0151]
dpph
·
又称1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，是一种很稳定的氮中心的自由基，它的稳定性主要来自共振稳定作用的3个苯环的空间障碍，使夹在中间的氮原子上不成对的电子
不能发挥其应有的电子成对作用。它的无水乙醇溶液呈紫色，在517nm波长处有最大吸收，吸光度与浓度呈线性关系。向其中加入自由基清除剂时，可以结合或替代dpph
·
，使自由基数量减少，吸光度变小，溶液颜色变浅，借此可评价清除自由基的能力；
[0152]
具体实验步骤如下：以trolox溶液为阳性对照，测定不同浓度下trolox对dpph自由基的清除效果。实验结果以teac值表示，其单位为μmoltrolox当量/100ml，即100ml样品相当多少μmol trolox的抗氧化能力；分别吸取2ml样品溶液(或无水乙醇)和2mldpph
·
溶液于具塞试管中，混匀；避光反应30min，测定517nm波长下的吸光值；
[0153]
dpph自由基清除率(％)＝[1-(a
1-a2)/a0]
×
100％；
[0154]
式中：a0代表没有添加样品，添加dpph；a1代表添加样品或无水乙醇，添加dpph；a2代表添加样品或无水乙醇，没有添加dpph；
[0155]
2、对abts
·
自由基的清除能力评价
[0156]
abts在适当的氧化物作用下氧化成绿色的abts
·
，当向反应中加入抗氧化物质时，abts
·
的产生就会受到抑制，在734nm测定吸光度即可测定并计算出样品的总抗氧化能力；
[0157]
具体实验步骤如下：以trolox溶液为阳性对照，测定不同浓度下trolox对abts
·
自由基的清除效果。实验结果以teac值表示，其单位为μmoltrolox当量/100ml，即100ml样品相当多少μmol trolox的抗氧化能力；取7mmol/l的abts溶液，用10mmol/l的pbs(ph 7.4)稀释60倍，得到abts工作液；吸取190μlabts工作液(或pbs)，加入10μl样品溶液(或pbs)，振荡10s，30℃条件下静置6min，测定734nm处吸光值a。
[0158]
abts
·
自由基清除率(％)＝[1-(a
1-a2)/a0]
×
100％；
[0159]
式中：a0代表没有添加样品，添加abts；a1代表添加样品或pbs，添加abts；a2代表添加样品或pbs，没有添加abts；
[0160]
具体测试结果如表3所示：
[0161]
表3
[0162]
[0163][0164]
由表3测试数据可知，本发明制备得到的发酵液的原液对dpph自由基清除率在90％以上，即使稀释至浓度为10vol％后，dpph自由基清除率仍能达到67％以上；发酵液的原液对abts
·
自由基清除率在90％以上，即使稀释至浓度为10vol％后，对abts
·
自由基清除率仍能达到67％以上；说明由于最终获得的发酵液中含有裂褶多糖和麦角硫因，所述裂褶多糖和麦角硫因相互配合，具有协同增效的作用，能进一步提高所述组合物对于dpph自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基的清除作用，可增强皮肤组织的抗氧化能力，降低皮肤组织自由基含量。
[0165]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明所述通过双菌种共发酵制备裂褶多糖和麦角硫因的方法，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。