一种红霉素降解菌IURMF57及其应用的制作方法

一种红霉素降解菌iurm f57及其应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体为一种红霉素降解菌iurm f57及其在红霉素污染土壤和水体修复领域的应用。


背景技术：

2.红霉素及大环内酯类衍生物近年来在医疗领域与兽药领域被广泛使用，中国作为红霉素生产大国在供应本国的基础上拥有国际市场的80％份额，随着国际市场对红霉素需求的不断上升，我国红霉素产量开始大幅增长，且市场份额不断扩大，已从2006年的3420吨上升到2018年的10430吨左右，12年间产量增长3倍。在红霉素生产过程中会产生大量废水和菌渣。2008年抗生素菌渣被列为危险固体废弃物，使红霉素生产企业环保压力增大。这些废弃物中含有来自发酵残余营养物的高cod和高氨氮，存在生物抑制性物质和提取分离中残留的高浓度酸、碱、有机溶剂等，最终成为超级细菌的温床。不当的处理方法极易造成环境污染和生态危害，也造成了资源的浪费。现有处理技术成本过高，企业增值增产的信心将受到打击，导致产量远低于产能。国际市场供不应求的局面愈加明显，但由于环境政策压力，企业无法开足马力进行生产。同时，由于红霉素的广为使用以及滥用造成其在各种环境中进行迁移和转化，其所诱导生成的抗性基因也具有很高的活性和迁移转化特性。
3.目前红霉素菌渣处理方法多样，但物理和化学法劣势明显。早年焚烧和填埋处理方法的高能耗，渗滤液会造成土壤和地下水污染及空气污染的弊端显而易见。近年来高温水热干燥处理和高能电子束等新型处理方法也存在着高耗能、设备和人员技能要求高、基因诱变等重大弊端。除此，在整个红霉素废料处理行业市场上没有完整的处理体系，现有技术无法保证药厂的后顾之忧。因此迫切需要更多安全的方法来处理抗生素菌渣。本专利利用自主驯化的菌株，专一性处理生产废水中残留的红霉素及其中间体，降解效率高，过程清洁无污染并且能使菌渣资源化利用。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种红霉素降解菌iurm f57，即博德特氏菌(bordetella petrii)iurm f57及其应用，以及降解红霉素的方法、红霉素降解菌干粉剂。
5.为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种红霉素降解菌iurm f57，该菌已于2020年11月06日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为cgmcc no.21117。
6.本发明的第二个目的是提供了上述红霉素降解菌iurm f57在制备用于红霉素降解的制剂中的应用。
7.本发明的第三个目的是提供了上述红霉素降解菌iurm f57在制备用于红霉素环境污染后修复的制剂中的应用。
8.本发明的第四个目的是提供了上述红霉素降解菌iurm f57在制备用于红霉素残留污染后土壤修复的制剂中的应用。
9.本发明的第五个目的是提供了上述红霉素降解菌iurm f57在制备用于红霉素残留污染后水体修复的制剂中的应用。
10.本发明的第六个目的是提供了一种降解红霉素的方法，将上述的红霉素降解菌iurm f57接种于含有红霉素的体系中培养，即可实现降解红霉素。
11.进一步的，上述的一种降解红霉素的方法，所述培养温度为37℃，培养时间为72h。
12.本发明的第七个目的是提供了一种红霉素降解菌干粉剂，所述干粉剂中含有上述的博德特氏菌(bordetella petrii)iurm f57。
13.本发明的第八个目的是提供了上述一种红霉素降解菌干粉剂的制备方法，是将博德特氏菌(bordetella petrii)iurm f57扩大培养后，经过常规方法干燥制得。
14.本发明通过微生物技术法，即根据红霉素的特性，从特定环境条件中或者通过改造，得到能够降解红霉素的微生物，通过大环内酯酶，转移酶，裂解酶等对红霉素结构进行破坏，得到无污染的代谢产物。微生物将红霉素作为其生长所需的碳源和能源，并在酶的作用下水解成简单化合物，最终降解为h2o和co2等代谢产物，且具有成本低，无二次污染优点。使用这种方法能够高效清洁的处理红霉素菌渣，极大减少了环境的负担，符合现在国家所倡导的可持续发展的新理念。
15.本发明的有益效果为：本发明提供的红霉素降解菌及其应用，通过微生物筛选富集，根据红霉素的理化性质，在特定环境条件中筛选得到能够降解红霉素的微生物。以大环内酯酶，转移酶，糖苷酶等酶类对红霉素结构进行破坏，得到危害小，无污染的代谢产物，从而达到红霉素无害化处理的目的。实验证明，本发明的红霉素降解菌iurm f57能在仅存在红霉素为碳源的特殊环境中存活，达到54％-69％的降解红霉素的效率，相关酶降解红霉素的活性高。本发明所提供的红霉素降解菌iurm f57可以应用于药企菌渣废物与污染环境中的红霉素降解，在菌渣固废处理和水污染处理方面拥有良好的实际应用价值。
附图说明
16.图1为红霉素降解菌iurm f57的单菌落形态图。
17.图2为实施例2中的红霉素降解菌iurm f57的降解曲线图。
18.图3为实施例3中的红霉素降解菌iurm f57的降解曲线图。
19.图4为实施例4中的红霉素降解菌iurm f57的降解曲线图。
具体实施方式
20.实施例1：
21.iurm f57的筛选方法，步骤如下：
22.称取10g红霉素菌渣，取1ml上清液，加入9ml无菌水，进行10倍稀释。依次加入以上材料梯度稀释至1000倍，摇匀后静置，取上清液加入含红霉素(100mg/l)的msm无机盐液体培养基，置于37℃、150rpm摇床中培养3天。将上述所得菌液均匀涂布在含红霉素的msm固体培养基上，然后放入37℃生化培养箱培养5-7天，在lb平板上划线分离，得到红霉素降解菌iurm f57，其单菌落形态如图1所示。
23.菌株鉴定
24.采用上海生工真菌dna提取试剂盒获得红霉素降解菌iurm f57基因组dna，通过
pcr的dna扩增技术对菌株16s基因进行扩增并送至上海捷瑞生物公司进行测序分析；用于扩增16s基因的上游引物序列为：5’tccgtaggtgaacctgcgg 3’，下游引物序列为5’tcctccgcttattgatatgc 3’。
25.pcr反应条件：95℃预变性10min，95℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，反应31个循环，72℃延伸5min。使用ncbi的blast功能在genebank数据库中进行序列比对，分析菌株的分类为：。
26.红霉素降解菌iurm f57的16s rrna基因序列见序列表中序列1。
27.(一)主要材料
28.1、培养基
29.lb液体培养基：酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，琼脂15g，超纯水1000ml。
30.msm无机盐液体培养基：nh4cl 0.630g，k2hpo4·
3h2o 1.965g，kh2po
4 0.500g，nano
3 1.00g，mgso
4 0.100g，超纯水1000ml。
31.相对应的固体培养基则在1l液体培养基中添加琼脂粉15g配制成。
32.2、仪器设备
33.flexcycler pcr扩增仪，tanon-3500凝胶成像系统，北京市六一仪器厂电泳仪，灭菌锅，英衡电子天平，uv1900紫外可见分光光度计，恒温培养箱，eppendorf高速冷冻离心机，摇床，青岛海尔集团的低温冰箱。
34.(二)红霉素降解测定
35.(1)红霉素标准曲线的绘制
36.准确称取100.0mg工业纯红霉素于10ml容量瓶中，用流动相定容至标线，制备成每毫升含有10.0mg的红霉素标准液。加入流动相稀释制备成10.0、20.0、40.0、50.0、60.0、80.0和100mg/l的红霉素标准溶液。
37.色谱条件：
38.色谱柱：反向c18(安捷伦)，4.6
×
250mm，5μm，80a；
39.流动相：乙腈:k2hpo4(0.01m)＝60:40；
40.流速：1.0ml/min；
41.柱温：35℃；
42.检测波长：215nm；
43.进样量：40μl。
44.标准曲线为y(峰面积)＝0.2031x(红霉素浓度)-0.2785
45.(2)红霉素降解率测定方法
46.将降解菌接种到含有10mg的100ml液体msm培养基中，与添加50mg的100ml液体msm培养基中，接种量2％，置于37℃，ph＝7，放入摇床中培养。每24h取一次发酵液，置于-20℃冰箱保存，一共取样120小时。
47.取1ml发酵液用4ml流动相稀释，后取2ml液体，10000rpm离心1min，将上清液通过0.22μm滤膜后利用液相进行检测分析，再以制备标准曲线得到的方程计算出红霉素含量，得出实验组红霉素的降解率。
48.实施例2：
49.将红霉素降解菌iurm f57在lb液体培养基中培养，离心收集菌体，无菌水重悬后
稀释至od
600
＝1，将所选菌株接种100.0ml含100mg红霉素的液体无机盐培养基中，置于恒温摇床中180r/min，37℃培养120h降解率为69.33％，红霉素降解效率果明显。(图2)
50.实施例3
51.将红霉素降解菌iurm f57按照1％的接种量接种于1000g灭菌的土壤中，于37℃条件下加入100mg红霉素培养120h，经测定，测定降解率为：54.03％。
52.(图3)
53.实施例4
54.将红霉素降解菌按1％的接种量接种于100ml灭菌的含红霉素的废水中，经测定该废水的红霉素浓度为130mg/l，于36.5℃、180r/min条件下培养120h，测定红霉素降解率为：67％。(图4)
55.实施例5
56.红霉素降解菌iurm f57干粉剂的制备，红霉素降解菌iurm f57经过扩大培养后，通过常规方法干燥制得粉末状试剂。菌体存活量高。
57.最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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