一种刺梨无刺1号无刺品系的特异分子标记及其应用

id no.1所示，下游引物序列如seq id no.2所示；所述分子标记341.112的上游引物序列如seq id no.3所示，下游引物序列如seq id no.4所示。
11.本发明还提供了一种检测刺梨无刺1号无刺品系的方法，用具体序列如seq id no.1～seq id no.4所示的引物对提取的刺梨基因组dna进行pcr扩增；然后观察扩增结果，得出结论。
12.优选的，所述扩增为双重pcr扩增，所述扩增反应的总体积为17.5～22.5μl，其中包括0.9～1.1μl dna、153.61标记上下游引物各0.4～0.6μl、341.112标记上下游引物各0.4～0.6μl、6～8μl ddh2o、9～11μl taq dna聚合酶。
13.优选的，所述扩增反应的过程为：93～95℃预变性3～5min，93～95℃变性25～35s，45～55℃退火25～35s，70～74℃延伸35～45s，25～35个循环，最后总延伸5～8min，3～5℃保温。
14.优选的，所述得出结论的方法为：如果能够同时扩增出特异的2条不同大小的500bp和100bp扩增片段，则标志着所检测的育种材料为刺梨无刺1号无刺品系。
15.与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：
16.(1)本发明通过一次双重pcr同时检测双标记位点，利用2个inde1标记即可简单、快速地鉴定出刺梨材料中的无刺1号无刺品系，而且双标记位点同时检测，相互印证，相互检验，能够确保检测结果的准确性、有效性及可靠性。
17.(2)本发明在刺梨品种的区分和种间杂交种的鉴定等方面具有重大应用价值。
18.(3)本发明能为创新大果无刺鲜食刺梨品种提供技术支撑。
19.(4)利用本发明在育种材料的幼苗期提取其叶片基因组dna进行双重pcr扩增，通过观察电泳条带即可鉴定其是否为无刺1号无刺品系，因此也可大大缩短无刺刺梨的育种周期，加快育种进程。
附图说明
20.图1为实施例6中两对引物双重pcr扩增产物图谱；
21.图2为实施例6中引物seq id no.1～2普通pcr扩增产物图谱；
22.图3为实施例6中引物seq id no.3～4普通pcr扩增产物图谱。
具体实施方式
23.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。以下实施例中使用的试剂、试剂盒和仪器均可由市售获得，实施例中使用的方法如无特别说明，与常规使用的方法一致。
24.下面结合实施例，对本发明的技术方案进行进一步详细阐述。
25.实施例1无刺1号的获得
26.刺梨无刺1号种质资源单株采集自贵州省毕节市黔西县，现种植于贵州大学刺梨种质资源圃。
27.实施例2无刺1号品系实生后代的获得
28.无刺1号种质资源单株自然授粉后，采集健康种子播种，繁殖f1代单株。f1代单株自
然授粉后，采集健康种子播种，繁殖f2代单株。
29.实施例3采集供试材料
30.于贵州省贵阳市贵州大学刺梨种质资源圃(26
°
42.408'n,106
°
67.353'e)采集刺梨叶片材料34份，每份3个重复，具体信息如表1所示。然后将采集到的叶片材料用蒸馏水冲洗，擦干水分，液氮速冻后置于超低温冰箱保存、备用。
31.表1供试材料样品信息列表
32.[0033][0034]
实施例4提取待测刺梨材料样品的基因组dna
[0035]
样品总dna使用biotake通用植物dna提取试剂盒(离心柱型)提取获得，方法步骤如下:
[0036]
(1)柱平衡步骤：向吸附柱ac中(吸附桂放入收集管中)加入500pl的平衡液，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的下滤液，将吸附杜重新放回收集管中；
[0037]
(2)取适量植物组织在研钵中加入液氮充分碾磨成细粉；
[0038]
(3)转移细粉(植物新鲜组织100mg或干重组织30mg)到一个1.5ml离心管，不要解冻，加入550μl65℃预热bufferp1和4μl rnasea，剧烈涡旋振荡混匀1分钟，室温放置10分钟；
[0039]
(4)加入130μl的bufferp2，剧烈涡旋振荡混匀1分钟，12000rpm离心3分钟；
[0040]
(5)小心吸取上清到分离柱a中，注意不要吸到界面物质，12000rpm离心1分钟，收集下滤液；
[0041]
(6)转移下滤液到一个新的2ml离心管中，加入1.5倍体积的buffer p3立刻轻柔涡旋充分混匀；
[0042]
(7)将上一步所得混合物(包括可能出现的沉淀)加入一个吸附柱ac中，(吸附柱放入收集管中)12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液(吸附柱ac单次上样量最多700μl,若样本量大于700μl需分多次过柱)；
[0043]
(8)加入700μl漂洗液wb，12000rpm离心1分钟，弃掉废液；
[0044]
(9)加入500μl漂洗液wb，12000rpm离心1分钟，弃掉废液；
[0045]
(10)将吸附柱ac放回空收集管中，13000rpm离心3～5分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应；
[0046]
(11)取出吸附桂ac，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50μl洗脱缓冲液eb(洗脱缓冲液事先在65℃水浴中预热)，室温放置3～5分钟，12000rpm离心1分钟收集dna；
[0047]
(12)将dna置于～20℃保存、备用。
[0048]
实施例5设计indel标记引物
[0049]
(1)模板序列的准备
[0050]
利用重测序数据与参考基因组进行比对查找indel位点。根据找到的indel位点，基于刺梨基因组序列，取indel位点两翼各300bp碱基长度，共601bp碱基长度进行引物设计。
[0051]
(2)标记引物设计
[0052]
基于上述模板序列，采用snapgene软件对符合条件的目标序列进行pcr引物设计，引物设计原则:tm值为50～60℃，引物gc％含量为45～55％，在位点周围设计引物，扩增产物大小为100～300bp，引物长度为18～24bp。在引物的3’端不应有任何互补碱基，引物也不出现发夹结构及引物二聚体。引物全部由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物信息如表2所示。
[0053]
表2 indel标记引物信息列表
[0054][0055]
实施例6两种方式对34份材料进行扩增
[0056]
(1)单对引物的pcr扩增
[0057]
以实施例3中样品dna为模板，分别利用实施例5中合成的特异引物seq id no.1～
2和seq id no.3～4，进行单对引物的普通pcr扩增与琼脂糖电泳检测。
[0058]
其中pcr扩增反应的总体积为20μl，其中包括1μldna、上下游引物各0.5μl、8μlddh2o、10μltaq dna聚合酶。
[0059]
pcr扩增的反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环，最后总延伸7min，4℃保温。
[0060]
(2)两对引物同时双重pcr扩增
[0061]
以实施例3中样品dna为模板，同时利用实施例5中合成的两对特异引物seq idno.1～seq id no.4进行双重pcr扩增与琼脂糖电泳检测。
[0062]
其中双重pcr扩增反应的总体积为20μl，其中包括1μldna、153.61标记上下游引物各0.5μl、341.112标记上下游引物各0.5μl、7μlddh2o、10μltaq dna聚合酶。
[0063]
双重pcr扩增的反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环，最后总延伸7min，4℃保温。
[0064]
(3)两种扩增方式pcr产物的检测
[0065]
采用0.9％琼脂糖凝胶对普通pcr扩增产物和双重pcr扩增产物进行电泳检测。分别取5μl引物seq id no.1～2和引物seq id no.3～4pcr的普通pcr扩增产物，以及引物seq id no.1～4的双重pcr扩增产物，直接点样，同时取5μldnamarker直接点样，作为电泳参照物。电泳条件为：u＝110v，i＝100a，t＝30min，电泳缓冲液为0.5
×
tae。电泳结束后用紫外凝胶成像仪观察电泳结果并拍照。
[0066]
实施例7所有供试材料的双重pcr产物检测
[0067]
利用实施例6中的两种pcr扩增方法对实施例3中所有供试材料进行扩增，然后利用电泳检测方法对其进行检测。结果如图1～3所示，其中图1为两对引物双重pcr扩增产物图谱，图2为引物seq id no.1～2普通pcr扩增产物图谱，图3为引物seq id no.3～4普通pcr扩增产物图谱。
[0068]
由图1可知：34份材料双重pcr产物的电泳条带共呈现出四种带型，其中：呈现泳道1带型的材料有：18、19、22号；呈现泳道2带型的材料有：f、15、16号；呈现泳道3带型的材料有：1、3、4、5、7、cd、17、23、24、25、26、27、28、30、31、33、36、38、39、40号；呈现泳道4带型的材料有：14、20、21、29、32、34、35、37号。
[0069]
在呈现图1中泳道2带型的三种材料中，f和16的样品采集信息列表中标注的信息均为无刺1号，15的样品采集信息列表中标注的信息为无刺1号品系的f2代，皆为无刺性状材料，双重pcr扩增产物的电泳结果与原始记载信息一致，说明本发明的检测方法准确、有效。
[0070]
在图2中，引物seq id no.1～2对34份材料的扩增结果呈现出两种不同带型，呈现泳道1所示带型的材料有：f、15、16、18、19、22号，其余材料的带型均为泳道2所示。说明该引物不能单独将f、15、16这三份材料区分出来。
[0071]
在图3中，引物seq id no.3～4对34份材料的扩增结果呈现出与图2略显不同的两种带型，呈现泳道1所示带型的材料有：1、3、4、5、7、cd、17、18、19、22、23、24、25、26、27、28、30、31、33、36、38、39、40号，呈现泳道2所示带型的材料有：f、14、15、16、20、21、29、32、34、35、37。说明该引物也不能单独将f、15、16这三份材料区分出来。但是从电泳结果来看，f、15、16这三份材料与18、19、22这三份材料的带型不同。同时，f、15、16、18、19、22号六份材料
在图1中的电泳条带与图2和图3中的电泳条带叠加起来一致。
[0072]
因此，单独的任何一对引物均不能将无刺1号无刺材料区分出来，只有两对引物同时使用时才能准确区分出无刺1号无刺材料。
[0073]
综上可知，本发明通过一次双重pcr同时检测双标记位点，以此来鉴定刺梨材料中的无刺1号无刺品系，双标记位点同时检测可相互印证，相互检验，确保检测的准确度和可靠性。同时利用本发明在育种材料的幼苗期提取其叶片基因组dna进行双重pcr扩增，通过观察电泳条带即可鉴定其是否为无刺1号无刺品系，缩短育种周期，加快育种进程。
[0074]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。