用于通过原位杂交进行核酸的多路复用检测的方法与流程

用于通过原位杂交进行核酸的多路复用检测的方法
1.本技术要求2019年2月15日提交的美国临时申请号62/806,574的权益，所述临时申请的全部内容以引用的方式并入本文。
2.本技术以引用的方式在本文结合作为ascii文本文件的序列表，所述序列表名称为"12790-059-228_sl.txt"，创建于2020年2月12日，并且具有1,312千字节的大小。
3.发明背景
4.本发明总体上涉及核酸的检测，并且更具体地涉及核酸的多路复用检测。
5.rna原位杂交(ish)是广泛用于测量和定位细胞如循环肿瘤细胞(ctc)或组织切片内的特定rna序列(例如信使rna(mrna)、长非编码rna(lncrna)和微rna(mirna))，同时保留细胞和组织背景的分子生物学技术。因此，rna ish提供了细胞和组织内基因表达的时空可视化以及定量。它在研究和诊断中具有广泛的应用(hu等人,biomark.res.2(1):1-13,doi:10.1186/2050-7771-2-3(2014)；ratan等人,cureus 9(6):e1325.doi:10.7759/cureus.1325(2017)；weier等人,expert rev.mol.diagn.2(2):109-119(2002))。荧光rna ish分别利用荧光染料和荧光显微镜进行rna标记和检测。荧光rna ish通常提供四至五个靶序列的有限多路复用。有限的多路复用能力主要是由于可由荧光显微镜的光学系统区分的少量光谱上不同的荧光染料。在诸如产生细胞和组织图以理解复杂生物系统的领域中，特别是在人类健康和疾病中，高度期望更高水平的多路复用。
6.已经引入了几种方法，所述方法利用连续轮次杂交、成像、除去标签和重新杂交至不同靶标，其在理论上可在同一细胞或组织切片中对四至五个靶标的倍数进行成像(shah等人,neuron 92(2):342-357(2016)；codeluppi等人,nature methods 15(11):932
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935(2018))。然而，在实践中，先前描述的连续荧光ish(fish)方法可导致连续几轮杂交和检测中的核酸检测灵敏度、特别是rna检测灵敏度和细胞形态的显著损失。此外，由于需要重复整个靶探针杂交和标记检测步骤，所以所述方法是时间和劳动密集型的。因此，允许同时可视化更多靶序列的更实用且更灵敏的方法仍然是技术挑战。
7.因此，需要用于更多靶核酸的多路复用检测的原位检测方法。本发明满足了这种需要并且也提供了相关的优点。


技术实现要素：

8.本发明提供了一种检测多种靶核酸的方法，所述方法包括(a)使包含含有多种核酸的细胞的样品与多个靶探针组接触，其中每个靶探针组包含一对与靶核酸特异性地杂交的靶探针；(b)使所述样品与前置扩增子组接触，其中所述前置扩增子组包含多个前置扩增子，其中所述多个前置扩增子包含对每个靶探针组具有特异性的前置扩增子，其中每个前置扩增子包含用于所述靶探针组中的一个的靶探针对的结合位点和用于扩增子的多个结合位点；(c)使所述样品与扩增子组接触，其中所述扩增子组包含对每个前置扩增子具有特异性的多个扩增子亚组，其中每个扩增子亚组包含多个扩增子，其中扩增子亚组的扩增子包含用于对靶探针组具有特异性的前置扩增子中的一个的结合位点和用于标记探针的多个结合位点；(d)使所述样品与第一标记探针组接触，其中所述第一标记探针组包含多个第
一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个中的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的标记在所述第一标记探针亚组之间是可区分的并且其中所述标记是可裂解的，并且其中所述第一标记探针组特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第一靶核酸亚组；(e)检测与所述靶核酸结合的第一标记探针组的标记探针，从而检测所述第一靶核酸亚组；(f)从与所述第一靶核酸亚组结合的第一标记探针组裂解所述标记；(g)使所述样品与第二标记探针组接触，其中所述第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一标记探针亚组相比，所述第二标记探针亚组对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的标记在所述第二标记探针亚组之间是可区分的并且其中所述标记是可裂解的，并且其中所述第二标记探针组特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第二靶核酸亚组，所述第二靶核酸亚组不同于所述第一靶核酸亚组；以及(h)检测与所述靶核酸结合的第二标记探针组的标记探针，从而检测所述第二靶核酸亚组，其中检测到多种靶核酸。
9.在一个实施方案中，所述方法还包括(i)从与所述第二靶核酸组结合的第二标记探针组裂解所述标记；(j)使所述样品与第三标记探针组接触，其中所述第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一和第二标记探针亚组相比，所述第三标记探针亚组对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的标记在所述第三标记探针亚组之间是可区分的并且其中所述标记是可裂解的，并且其中所述第三标记探针组特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第三靶核酸亚组，所述第三靶核酸亚组不同于所述第一和第二靶核酸亚组；以及(k)检测与所述靶核酸结合的第三标记探针组的标记探针，从而检测所述第三靶核酸亚组。在一个实施方案中，所述方法包括重复步骤(i)至(k)一次或多次。
10.在一个实施方案中，每个靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
11.在一个实施方案中，所述靶核酸独立地是dna或rna。在一个特定实施方案中，为rna的靶核酸独立地选自由以下组成的组：信使rna(mrna)、微小rna(mirna)、核糖体rna(rrna)、线粒体rna和非编码rna。
12.在这种方法的一个实施方案中，所述样品是组织样本或来源于组织样本。在这种方法的一个实施方案中，所述样品是血液样品或来源于血液样品。在这种方法的一个实施方案中，所述样品是细胞样品或来源于细胞样品。
13.本发明另外提供了一种固定和/或透化细胞的样品，所述样品包含(a)至少一个含有多种靶核酸的固定和/或透化细胞；(b)多个靶探针组，其中每个靶探针组包含一对与靶核酸特异性地杂交的靶探针；(c)前置扩增子组，其中所述前置扩增子组包含多个前置扩增子，其中所述多个前置扩增子包含对每个靶探针组具有特异性的前置扩增子，其中每个前
置扩增子包含用于所述靶探针组中的一个的靶探针对的结合位点和用于扩增子的多个结合位点，其中所述前置扩增子与相应的特异性靶探针对杂交；(d)扩增子组，其中所述扩增子组包含对每个前置扩增子具有特异性的多个扩增子亚组，其中每个扩增子亚组包含多个扩增子，其中扩增子亚组的扩增子包含用于对靶探针组具有特异性的前置扩增子中的一个的结合位点和用于标记探针的多个结合位点，其中所述扩增子与对所述靶探针组具有特异性的相应前置扩增子杂交；(e)第一标记探针组，其中所述第一标记探针组包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个中的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的标记在所述第一标记探针亚组之间是可区分的并且其中所述标记是可裂解的，并且其中所述第一标记探针组与相应的扩增子杂交并特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第一靶核酸亚组，其中所述杂交在所述第一靶核酸亚组上提供可检测的标记。
14.在一个实施方案中，与所述第一靶核酸亚组结合的第一标记探针组的标记被裂解。
15.在这种样品的一个实施方案中，所述样品包含第二标记探针组，其中所述第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一标记探针亚组相比，所述第二标记探针亚组对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的标记在所述第二标记探针亚组之间是可区分的并且其中所述标记是可裂解的，并且其中所述第二标记探针组与相应的扩增子杂交并特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第二靶核酸亚组，所述第二靶核酸亚组不同于所述第一靶核酸亚组，其中所述杂交在所述第二靶核酸亚组上提供可检测的标记。
16.在一个实施方案中，来自与所述第二靶核酸亚组结合的第二标记探针组的标记被裂解。
17.在本发明的这种样品的一个实施方案中，第三标记探针组，其中所述第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一和第二标记探针亚组相比，所述第三标记探针亚组对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的标记在所述第三标记探针亚组之间是可区分的并且其中所述标记是可裂解的，并且其中所述第三标记探针组与相应的扩增子杂交并特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第三靶核酸亚组，所述第三靶核酸亚组不同于所述第一和第二靶核酸亚组，其中所述杂交在所述第三靶核酸亚组上提供可检测的标记。
18.在一个实施方案中，每个靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
19.在本发明的样品的一个实施方案中，所述靶核酸独立地是dna或rna。在一些实施方案中，为rna的靶核酸独立地选自由以下组成的组：信使rna(mrna)、微小rna(mirna)、核糖体rna(rrna)、线粒体rna和非编码rna。
20.在本发明的样品的一个实施方案中，所述样品是组织样本或来源于组织样本。在本发明的样品的一个实施方案中，所述样品是血液样品或来源于血液样品。在本发明的样品的一个实施方案中，所述样品是细胞样品或来源于细胞样品。
21.本发明另外提供了一种载玻片，所述载玻片包含：(a)其上固定有包含至少一个含有靶核酸的固定和/或透化细胞的多个固定和/或透化细胞的载玻片；(b)多个靶探针组，其中每个靶探针组包含一对与靶核酸特异性地杂交的靶探针；(c)前置扩增子组，其中所述前置扩增子组包含多个前置扩增子，其中所述多个前置扩增子包含对每个靶探针组具有特异性的前置扩增子，其中每个前置扩增子包含用于所述靶探针组中的一个的靶探针对的结合位点和用于扩增子的多个结合位点，其中所述前置扩增子与相应的特异性靶探针对杂交；(d)扩增子组，其中所述扩增子组包含对每个前置扩增子具有特异性的多个扩增子亚组，其中每个扩增子亚组包含多个扩增子，其中扩增子亚组的扩增子包含用于对靶探针组具有特异性的前置扩增子中的一个的结合位点和用于标记探针的多个结合位点，其中所述扩增子与对所述靶探针组具有特异性的相应前置扩增子杂交；(e)第一标记探针组，其中所述第一标记探针组包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个中的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的标记在所述第一标记探针亚组之间是可区分的并且其中所述标记是可裂解的，并且其中所述第一标记探针组与相应的扩增子杂交并特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第一靶核酸亚组，其中所述杂交在所述第一靶核酸亚组上提供可检测的标记。
22.在一个实施方案中，与所述第一靶核酸亚组结合的第一标记探针组的标记被裂解。
23.在本发明的载玻片的一个实施方案中，所述载玻片包含第二标记探针组，其中所述第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一标记探针亚组相比，所述第二标记探针亚组对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的标记在所述第二标记探针亚组之间是可区分的并且其中所述标记是可裂解的，并且其中所述第二标记探针组与相应的扩增子杂交并特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第二靶核酸亚组，所述第二靶核酸亚组不同于所述第一靶核酸亚组，其中所述杂交在所述第二靶核酸亚组上提供可检测的标记。
24.在一个实施方案中，来自与所述第二靶核酸亚组结合的第二标记探针组的标记被裂解。
25.在本发明的载玻片的一个实施方案中，所述载玻片包含第三标记探针组，其中所述第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一和第二标记探针亚组相比，所述第三标记探针亚组对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的标记在所述第三标记探针亚组之间
是可区分的并且其中所述标记是可裂解的，并且其中所述第三标记探针组与相应的扩增子杂交并特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第三靶核酸亚组，所述第三靶核酸亚组不同于所述第一和第二靶核酸亚组，其中所述杂交在所述第三靶核酸亚组上提供可检测的标记。
26.在这种载玻片的一个实施方案中，每个靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
27.在这种载玻片的一个实施方案中，所述靶核酸独立地是dna或rna。在一些实施方案中，为rna的靶核酸独立地选自由以下组成的组：信使rna(mrna)、微小rna(mirna)、核糖体rna(rrna)、线粒体rna和非编码rna。
28.在本发明的载玻片的一些实施方案中，所述样品是组织样本或来源于组织样本。在本发明的载玻片的一些实施方案中，所述样品是血液样品或来源于血液样品。在本发明的载玻片的一些实施方案中，所述样品是细胞样品或来源于细胞样品。
29.在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于靶核酸的原位检测的试剂盒，所述试剂盒包含(a)前置扩增子组，其中所述前置扩增子组包含多个前置扩增子，其中所述多个前置扩增子包含对每个靶探针组具有特异性的前置扩增子，其中每个前置扩增子包含用于所述靶探针组中的一个的靶探针对的结合位点和用于扩增子的多个结合位点；(b)扩增子组，其中所述扩增子组包含对每个前置扩增子具有特异性的多个扩增子亚组，其中每个扩增子亚组包含多个扩增子，其中扩增子亚组的扩增子包含用于对靶探针组具有特异性的前置扩增子中的一个的结合位点和用于标记探针的多个结合位点；(c)第一标记探针组，其中所述第一标记探针组包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个中的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的标记在所述第一标记探针亚组之间是可区分的并且其中所述标记是可裂解的，并且其中所述第一标记探针组能够特异性地标记第一靶核酸亚组；(d)第二标记探针组，其中所述第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一标记探针亚组相比，所述第二标记探针亚组对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的标记在所述第二标记探针亚组之间是可区分的并且其中所述标记是可裂解的，并且其中所述第二标记探针组能够特异性地标记与所述第一靶核酸亚组不同的第二靶核酸亚组。
30.在一个实施方案中，所述试剂盒还包含第三标记探针组，其中所述第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一和第二标记探针亚组相比，所述第三标记探针亚组对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的标记在所述第三标记探针亚组之间是可区分的并且其中所述标记是可裂解的，并且其中所述第三标记探针组能够特异性地标记与所述第一和第二靶核酸亚组不同的第三靶核酸亚组。
31.在这种试剂盒的一个实施方案中，所述试剂盒包含一个或多个靶探针组，其中每个靶探针组包含一对与靶核酸特异性地杂交的靶探针。在这种试剂盒的一个实施方案中，每个靶探针组包含两对或更多对能够与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。在这种试剂盒的一个实施方案中，所述试剂盒包含裂解剂以从所述标记探针裂解所述可裂解的标记。在这种试剂盒的一个实施方案中，所述试剂盒包含用于透化细胞的至少一种试剂。
32.在另一个实施方案中，本发明提供了一种检测多种核酸的方法，所述方法包括(a)使包含含有多种核酸的细胞的样品与多个靶探针组接触，其中每个靶探针组包含一对与靶核酸特异性地杂交的靶探针；(b)使所述样品与前置前置扩增子组接触，其中所述前置前置扩增子组包含多对前置前置扩增子，其中所述前置前置扩增子组包含对所述靶探针组的靶探针对中的每个具有特异性的一对前置前置扩增子，其中所述前置前置扩增子对的每个前置前置扩增子包含用于靶探针组的靶探针对的靶探针中的一个的结合位点，并且其中所述前置前置扩增子包含用于前置扩增子的多个结合位点；(c)使所述样品与前置扩增子组接触，其中所述前置扩增子组包含多个前置扩增子，其中所述多个前置扩增子包含对每对前置前置扩增子具有特异性的前置扩增子，其中每个前置扩增子包含用于所述前置前置扩增子组的前置前置扩增子对中的一个的结合位点和用于扩增子的多个结合位点；(d)使所述样品与扩增子组接触，其中所述扩增子组包含对每个前置扩增子具有特异性的多个扩增子亚组，所述每个前置扩增子对每对前置前置扩增子具有特异性，其中扩增子亚组的扩增子包含用于对一对前置前置扩增子具有特异性的前置扩增子中的一个的结合位点和用于标记探针的多个结合位点；(e)使所述样品与第一标记探针组接触，其中所述第一标记探针组包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个中的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的标记在所述第一标记探针亚组之间是可区分的并且其中所述标记是可裂解的，并且其中所述第一标记探针组特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第一靶核酸亚组；(f)检测与所述靶核酸结合的第一标记探针组的标记探针，从而检测所述第一靶核酸亚组；(g)从与所述第一靶核酸亚组结合的第一标记探针组裂解所述标记；(h)使所述样品与第二标记探针组接触，其中所述第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一标记探针亚组相比，所述第二标记探针亚组对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的标记在所述第二标记探针亚组之间是可区分的并且其中所述标记是可裂解的，并且其中所述第二标记探针组特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第二靶核酸亚组，所述第二靶核酸亚组不同于所述第一靶核酸亚组；以及(i)检测与所述靶核酸结合的第二标记探针组的标记探针，从而检测所述第二靶核酸亚组，其中检测到多种靶核酸。
33.在一个实施方案中，所述方法还包括(j)从与所述第二靶核酸组结合的第二标记探针组裂解所述标记；(k)使所述样品与第三标记探针组接触，其中所述第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一和第二标记探针亚组相比，所述第三标记探针亚组对不同扩增
子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的标记在所述第三标记探针亚组之间是可区分的并且其中所述标记是可裂解的，并且其中所述第三标记探针组特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第三靶核酸亚组，所述第三靶核酸亚组不同于所述第一和第二靶核酸亚组；以及(l)检测与所述靶核酸结合的第三标记探针组的标记探针，从而检测所述第三靶核酸亚组。在一个实施方案中，步骤(j)至(l)重复一次或多次。
34.在这种方法的一个实施方案中，每个靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
35.在这种方法的一个实施方案中，所述靶核酸独立地是dna或rna。在一些实施方案中，为rna的靶核酸独立地选自由以下组成的组：信使rna(mrna)、微小rna(mirna)、核糖体rna(rrna)、线粒体rna和非编码rna。
36.在本发明的方法的一些实施方案中，所述样品是组织样本或来源于组织样本。在本发明的方法的一些实施方案中，所述样品是血液样品或来源于血液样品。在本发明的方法的一些实施方案中，所述样品是细胞样品或来源于细胞样品。
37.在另一个实施方案中，本发明提供了一种固定和/或透化细胞的样品，所述样品包含(a)至少一个含有多种靶核酸的固定和/或透化细胞；(b)多个靶探针组，其中每个靶探针组包含一对与靶核酸特异性地杂交的靶探针；(c)前置前置扩增子组，其中所述前置前置扩增子组包含多对前置前置扩增子，其中所述前置前置扩增子组包含对所述靶探针组的靶探针对中的每个具有特异性的一对前置前置扩增子，其中所述前置前置扩增子对的每个前置前置扩增子包含用于靶探针组的靶探针对的靶探针中的一个的结合位点，并且其中所述前置前置扩增子包含用于前置扩增子的多个结合位点，其中所述前置前置扩增子与相应的特异性靶探针对杂交；(d)前置扩增子组，其中所述前置扩增子组包含多个前置扩增子，其中所述多个前置扩增子包含对每对前置前置扩增子具有特异性的前置扩增子，其中每个前置扩增子包含用于所述前置前置扩增子组的前置前置扩增子对中的一个的结合位点和用于扩增子的多个结合位点，其中所述前置扩增子与相应的前置前置扩增子对杂交；(e)扩增子组，其中所述扩增子组包含对每个前置扩增子具有特异性的多个扩增子亚组，所述每个前置扩增子对每对前置前置扩增子具有特异性，其中扩增子亚组的扩增子包含用于对一对前置前置扩增子具有特异性的前置扩增子中的一个的结合位点和用于标记探针的多个结合位点，其中所述扩增子与相应的前置扩增子杂交；(f)第一标记探针组，其中第一标记探针组包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个中的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的标记在所述第一标记探针亚组之间是可区分的并且其中所述标记是可裂解的，并且其中所述第一标记探针组与相应的扩增子杂交并特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第一靶核酸亚组，其中所述杂交在所述第一靶核酸亚组上提供可检测的标记。
38.在一个实施方案中，与所述第一靶核酸亚组结合的第一标记探针组的标记被裂解。
39.在本发明的这种样品的一个实施方案中，所述样品包含第二标记探针组，其中所述第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一标记探针亚组相比，所述第二标记探针亚组对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的标记在所述第二标记探针亚组之间是可区分的并且其中所述标记是可裂解的，并且其中所述第二标记探针组与相应的扩增子杂交并特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第二靶核酸亚组，所述第二靶核酸亚组不同于所述第一靶核酸亚组；并且其中所述杂交在所述第二靶核酸亚组上提供可检测的标记。
40.在一个实施方案中，来自与所述第二靶核酸亚组结合的第二标记探针组的标记被裂解。
41.在本发明的这种样品的一个实施方案中，所述样品包含第三标记探针组，其中所述第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一和第二标记探针亚组相比，所述第三标记探针亚组对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的标记在所述第三标记探针亚组之间是可区分的并且其中所述标记是可裂解的，并且其中所述第三标记探针组与相应的扩增子杂交并特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第三靶核酸亚组，所述第三靶核酸亚组不同于所述第一和第二靶核酸亚组，其中所述杂交在所述第三靶核酸亚组上提供可检测的标记。
42.在这种样品的一个实施方案中，每个靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
43.在这种样品的一个实施方案中，所述靶核酸独立地是dna或rna。在这种样品的一些实施方案中，为rna的靶核酸独立地选自由以下组成的组：信使rna(mrna)、微小rna(mirna)、核糖体rna(rrna)、线粒体rna和非编码rna。
44.在本发明的样品的一些实施方案中，所述样品是组织样本或来源于组织样本。在本发明的样品的一些实施方案中，所述样品是血液样品或来源于血液样品。在本发明的样品的一些实施方案中，所述样品是细胞样品或来源于细胞样品。
45.本发明另外提供了一种载玻片，所述载玻片包含(a)其上固定有包含至少一个含有靶核酸的固定和/或透化细胞的多个固定和/或透化细胞的载玻片；(b)多个靶探针组，其中每个靶探针组包含一对与靶核酸特异性地杂交的靶探针；(c)前置前置扩增子组，其中所述前置前置扩增子组包含多对前置前置扩增子，其中所述前置前置扩增子组包含对所述靶探针组的靶探针对中的每个具有特异性的一对前置前置扩增子，其中所述前置前置扩增子对的每个前置前置扩增子包含用于靶探针组的靶探针对的靶探针中的一个的结合位点，并且其中所述前置前置扩增子包含用于前置扩增子的多个结合位点，其中所述前置前置扩增子与相应的特异性靶探针对杂交；(d)前置扩增子组，其中所述前置扩增子组包含多个前置扩增子，其中所述多个前置扩增子包含对每对前置前置扩增子具有特异性的前置扩增子，其中每个前置扩增子包含用于所述前置前置扩增子组的前置前置扩增子对中的一个的结
合位点和用于扩增子的多个结合位点，其中所述前置扩增子与相应的前置前置扩增子对杂交；(e)扩增子组，其中所述扩增子组包含对每个前置扩增子具有特异性的多个扩增子亚组，所述每个前置扩增子对每对前置前置扩增子具有特异性，其中扩增子亚组的扩增子包含用于对一对前置前置扩增子具有特异性的前置扩增子中的一个的结合位点和用于标记探针的多个结合位点，其中所述扩增子与相应的前置扩增子杂交；(f)第一标记探针组，其中第一标记探针组包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个中的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的标记在所述第一标记探针亚组之间是可区分的并且其中所述标记是可裂解的，并且其中所述第一标记探针组与相应的扩增子杂交并特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第一靶核酸亚组，其中所述杂交在所述第一靶核酸亚组上提供可检测的标记。
46.在一个实施方案中，与所述第一靶核酸亚组结合的第一标记探针组的标记被裂解。
47.在这种载玻片的一个实施方案中，所述载玻片包含第二标记探针组，其中所述第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一标记探针亚组相比，所述第二标记探针亚组对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的标记在所述第二标记探针亚组之间是可区分的并且其中所述标记是可裂解的，并且其中所述第二标记探针组与相应的扩增子杂交并特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第二靶核酸亚组，所述第二靶核酸亚组不同于所述第一靶核酸亚组；并且其中所述杂交在所述第二靶核酸亚组上提供可检测的标记。
48.在一个实施方案中，来自与所述第二靶核酸亚组结合的第二标记探针组的标记被裂解。
49.在这种载玻片的一个实施方案中，所述载玻片包含第三标记探针组，其中所述第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一和第二标记探针亚组相比，所述第三标记探针亚组对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的标记在所述第三标记探针亚组之间是可区分的并且其中所述标记是可裂解的，并且其中所述第三标记探针组与相应的扩增子杂交并特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第三靶核酸亚组，所述第三靶核酸亚组不同于所述第一和第二靶核酸亚组，其中所述杂交在所述第三靶核酸亚组上提供可检测的标记。
50.在这种载玻片的一个实施方案中，每个靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
51.在这种载玻片的一个实施方案中，所述靶核酸独立地是dna或rna。在一些实施方案中，为rna的靶核酸独立地选自由以下组成的组：信使rna(mrna)、微小rna(mirna)、核糖
体rna(rrna)、线粒体rna和非编码rna。
52.在这种载玻片的一个实施方案中，所述样品是组织样本或来源于组织样本。在这种载玻片的一个实施方案中，所述样品是血液样品或来源于血液样品。在这种载玻片的一个实施方案中，所述样品是细胞样品或来源于细胞样品。
53.在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于靶核酸的原位检测的试剂盒，所述试剂盒包含(a)前置前置扩增子组，其中所述前置前置扩增子组包含多对前置前置扩增子，其中所述前置前置扩增子组包含对靶探针组的靶探针对中的每个具有特异性的一对前置前置扩增子，其中所述前置前置扩增子对的每个前置前置扩增子包含用于靶探针组的靶探针对的靶探针中的一个的结合位点，并且其中所述前置前置扩增子包含用于前置扩增子的多个结合位点；(b)前置扩增子组，其中所述前置扩增子组包含多个前置扩增子，其中所述多个前置扩增子包含对每对前置前置扩增子具有特异性的前置扩增子，其中每个前置扩增子包含用于所述前置前置扩增子组的前置前置扩增子对中的一个的结合位点和用于扩增子的多个结合位点；(c)扩增子组，其中所述扩增子组包含对每个前置扩增子具有特异性的多个扩增子亚组，所述每个前置扩增子对每对前置前置扩增子具有特异性，其中扩增子亚组的扩增子包含用于对一对前置前置扩增子具有特异性的前置扩增子中的一个的结合位点和用于标记探针的多个结合位点；(d)第一标记探针组，其中所述第一标记探针组包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个中的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的标记在所述第一标记探针亚组之间是可区分的并且其中所述标记是可裂解的，并且其中所述第一标记探针组能够特异性地标记第一靶核酸亚组；(e)第二标记探针组，其中所述第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一标记探针亚组相比，所述第二标记探针亚组对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的标记在所述第二标记探针亚组之间是可区分的并且其中所述标记是可裂解的，并且其中所述第二标记探针组能够特异性地标记与所述第一靶核酸亚组不同的第二靶核酸亚组；并且。
54.在这种试剂盒的一个实施方案中，所述试剂盒包含第三标记探针组，其中所述第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一和第二标记探针亚组相比，所述第三标记探针亚组对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的标记在所述第三标记探针亚组之间是可区分的并且其中所述标记是可裂解的，并且其中所述第三标记探针组能够特异性地标记与所述第一和第二靶核酸亚组不同的第三靶核酸亚组。
55.在这种试剂盒的一个实施方案中，所述试剂盒包含一个或多个靶探针组，其中每个靶探针组包含一对与靶核酸特异性地杂交的靶探针。在这种试剂盒的一个实施方案中，每个靶探针组包含两对或更多对能够与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
56.在这种试剂盒的一个实施方案中，所述试剂盒包含裂解剂以从所述标记探针裂解所述可裂解的标记。在一个实施方案中，所述试剂盒包含用于透化细胞的至少一种试剂。
57.在一个实施方案中，本发明提供了一种检测多种靶核酸的方法，所述方法包括(a)使包含含有多种核酸的细胞的样品与多个靶探针组接触，其中每个靶探针组包含一对与靶核酸特异性地杂交的靶探针；(b)使所述样品与前置前置扩增子组接触，其中所述前置前置扩增子组包含多个前置前置扩增子，其中所述多个前置前置扩增子包含对每个靶探针组具有特异性的前置前置扩增子，其中每个前置前置扩增子包含用于所述靶探针组中的一个的靶探针对的结合位点和用于前置扩增子的多个结合位点；(c)使所述样品与前置扩增子组接触，其中所述前置扩增子组包含对每个前置前置扩增子具有特异性的多个前置扩增子亚组，其中每个前置扩增子亚组包含多个前置扩增子，其中前置扩增子亚组的前置扩增子包含用于对靶探针组具有特异性的前置前置扩增子中的一个的结合位点和用于扩增子的多个结合位点；(d)使所述样品与扩增子组接触，其中所述扩增子组包含对每个前置扩增子亚组具有特异性的多个扩增子亚组，其中每个扩增子亚组包含多个扩增子，其中扩增子亚组的扩增子包含用于所述前置扩增子亚组中的一个的前置扩增子的结合位点和用于标记探针的多个结合位点；(e)使所述样品与第一标记探针组接触，其中所述第一标记探针组包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个中的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的标记在所述第一标记探针亚组之间是可区分的并且其中所述标记是可裂解的，并且其中所述第一标记探针组特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第一靶核酸亚组；(f)检测与所述靶核酸结合的第一标记探针组的标记探针，从而检测所述第一靶核酸亚组；(g)从与所述第一靶核酸亚组结合的第一标记探针组裂解所述标记；(h)使所述样品与第二标记探针组接触，其中所述第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一标记探针亚组相比，所述第二标记探针亚组对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的标记在所述第二标记探针亚组之间是可区分的并且其中所述标记是可裂解的，并且其中所述第二标记探针组特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第二靶核酸亚组，所述第二靶核酸亚组不同于所述第一靶核酸亚组；以及(i)检测与所述靶核酸结合的第二标记探针组的标记探针，从而检测所述第二靶核酸亚组；其中检测到多种靶核酸。
58.在这种方法的一个实施方案中，所述方法还包括(j)从与所述第二靶核酸组结合的第二标记探针组裂解所述标记；(k)使所述样品与第三标记探针组接触，其中所述第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一和第二标记探针亚组相比，所述第三标记探针亚组对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的标记在所述第三标记探针亚组之间是可区分的并且其中所述标记是可裂解的，并且其中所述第三标记探针组特异性地标记与所述多
个靶探针组杂交的第三靶核酸亚组，所述第三靶核酸亚组不同于所述第一和第二靶核酸亚组；以及(l)检测与所述靶核酸结合的第三标记探针组的标记探针，从而检测所述第三靶核酸亚组。在这种方法的一个实施方案中，所述方法包括重复步骤(j)至(l)一次或多次。
59.在这种方法的一个实施方案中，每个靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
60.在这种方法的一个实施方案中，所述靶核酸独立地是dna或rna。在一个实施方案中，为rna的靶核酸独立地选自由以下组成的组：信使rna(mrna)、微小rna(mirna)、核糖体rna(rrna)、线粒体rna和非编码rna。
61.在这种方法的一个实施方案中，所述样品是组织样本或来源于组织样本。在另一个实施方案中，所述样品是血液样品或来源于血液样品。在另一个实施方案中，所述样品是细胞样品或来源于细胞样品。
62.在一个实施方案中，本发明提供了一种固定和/或透化细胞的样品，所述样品包含(a)至少一个含有多种靶核酸的固定和/或透化细胞；(b)多个靶探针组，其中每个靶探针组包含一对与靶核酸特异性地杂交的靶探针；(c)前置前置扩增子组，其中所述前置前置扩增子组包含多个前置前置扩增子，其中所述多个前置前置扩增子包含对每个靶探针组具有特异性的前置前置扩增子，其中每个前置前置扩增子包含用于所述靶探针组中的一个的靶探针对的结合位点和用于前置扩增子的多个结合位点，其中所述前置前置扩增子与相应的特异性靶探针对杂交；(d)前置扩增子组，其中所述前置扩增子组包含对每个前置前置扩增子具有特异性的多个前置扩增子亚组，其中每个前置扩增子亚组包含多个前置扩增子，其中前置扩增子亚组的前置扩增子包含用于对靶探针组具有特异性的前置前置扩增子中的一个的结合位点和用于扩增子的多个结合位点，其中所述前置扩增子与对所述靶探针组具有特异性的相应前置前置扩增子杂交；(e)扩增子组，其中所述扩增子组包含对每个前置扩增子亚组具有特异性的多个扩增子亚组，其中每个扩增子亚组包含多个扩增子，其中扩增子亚组的扩增子包含用于所述前置扩增子亚组中的一个的前置扩增子的结合位点和用于标记探针的多个结合位点，其中所述扩增子与相应的前置扩增子杂交；(f)第一标记探针组，其中第一标记探针组包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个中的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的标记在所述第一标记探针亚组之间是可区分的并且其中所述标记是可裂解的，并且其中所述第一标记探针组与相应的扩增子杂交并特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第一靶核酸亚组；其中所述杂交在所述第一靶核酸亚组上提供可检测的标记。
63.在这种样品的一个实施方案中，与所述第一靶核酸亚组结合的第一标记探针组的标记被裂解。
64.在这种样品的一个实施方案中，所述样品包含第二标记探针组，其中所述第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一标记探针亚组相比，所述第二标记探针亚组对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结
合位点，其中每个第二标记探针亚组中的标记在所述第二标记探针亚组之间是可区分的并且其中所述标记是可裂解的，并且其中所述第二标记探针组与相应的扩增子杂交并特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第二靶核酸亚组，所述第二靶核酸亚组不同于所述第一靶核酸亚组，其中所述杂交在所述第二靶核酸亚组上提供可检测的标记。
65.在这种样品的一个实施方案中，来自与所述第二靶核酸亚组结合的第二标记探针组的标记被裂解。
66.在这种样品的一个实施方案中，所述样品包含第三标记探针组，其中所述第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一和第二标记探针亚组相比，所述第三标记探针亚组对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的标记在所述第三标记探针亚组之间是可区分的并且其中所述标记是可裂解的，并且其中所述第三标记探针组与相应的扩增子杂交并特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第三靶核酸亚组，所述第三靶核酸亚组不同于所述第一和第二靶核酸亚组，其中所述杂交在所述第三靶核酸亚组上提供可检测的标记。
67.在这种样品的一个实施方案中，每个靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
68.在这种样品的一个实施方案中，所述靶核酸独立地是dna或rna。在一个实施方案中，为rna的靶核酸独立地选自由以下组成的组：信使rna(mrna)、微小rna(mirna)、核糖体rna(rrna)、线粒体rna和非编码rna。
69.在这种样品的一个实施方案中，所述样品是组织样本或来源于组织样本。在这种样品的另一个实施方案中，所述样品是血液样品或来源于血液样品。在另一个实施方案中，所述样品是细胞样品或来源于细胞样品。
70.在一个实施方案中，本发明提供了一种载玻片，所述载玻片包含(a)其上固定有包含至少一个含有靶核酸的固定和/或透化细胞的多个固定和/或透化细胞的载玻片；(b)多个靶探针组，其中每个靶探针组包含一对与靶核酸特异性地杂交的靶探针；(c)前置前置扩增子组，其中所述前置前置扩增子组包含多个前置前置扩增子，其中所述多个前置前置扩增子包含对每个靶探针组具有特异性的前置前置扩增子，其中每个前置前置扩增子包含用于所述靶探针组中的一个的靶探针对的结合位点和用于前置扩增子的多个结合位点，其中所述前置前置扩增子与相应的特异性靶探针对杂交；(d)前置扩增子组，其中所述前置扩增子组包含对每个前置前置扩增子具有特异性的多个前置扩增子亚组，其中每个前置扩增子亚组包含多个前置扩增子，其中前置扩增子亚组的前置扩增子包含用于对靶探针组具有特异性的前置前置扩增子中的一个的结合位点和用于扩增子的多个结合位点，其中所述前置扩增子与对所述靶探针组具有特异性的相应前置前置扩增子杂交；(e)扩增子组，其中所述扩增子组包含对每个前置扩增子亚组具有特异性的多个扩增子亚组，其中每个扩增子亚组包含多个扩增子，其中扩增子亚组的扩增子包含用于所述前置扩增子亚组中的一个的前置扩增子的结合位点和用于标记探针的多个结合位点，其中所述扩增子与相应的前置扩增子杂交；(f)第一标记探针组，其中第一标记探针组包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含
多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个中的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的标记在所述第一标记探针亚组之间是可区分的并且其中所述标记是可裂解的，并且其中所述第一标记探针组与相应的扩增子杂交并特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第一靶核酸亚组；其中所述杂交在所述第一靶核酸亚组上提供可检测的标记。
71.在这种载玻片的一个实施方案中，与所述第一靶核酸亚组结合的第一标记探针组的标记被裂解。
72.在这种载玻片的一个实施方案中，所述载玻片包含第二标记探针组，其中所述第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一标记探针亚组相比，所述第二标记探针亚组对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的标记在所述第二标记探针亚组之间是可区分的并且其中所述标记是可裂解的，并且其中所述第二标记探针组与相应的扩增子杂交并特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第二靶核酸亚组，所述第二靶核酸亚组不同于所述第一靶核酸亚组，其中所述杂交在所述第二靶核酸亚组上提供可检测的标记。
73.在这种载玻片的一个实施方案中，来自与所述第二靶核酸亚组结合的第二标记探针组的标记被裂解。
74.在这种载玻片的一个实施方案中，所述载玻片包含第三标记探针组，其中所述第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一和第二标记探针亚组相比，所述第三标记探针亚组对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的标记在所述第三标记探针亚组之间是可区分的并且其中所述标记是可裂解的，并且其中所述第三标记探针组与相应的扩增子杂交并特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第三靶核酸亚组，所述第三靶核酸亚组不同于所述第一和第二靶核酸亚组，其中所述杂交在所述第三靶核酸亚组上提供可检测的标记。
75.在这种载玻片的一个实施方案中，每个靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
76.在这种载玻片的一个实施方案中，所述靶核酸独立地是dna或rna。在一个实施方案中，为rna的靶核酸独立地选自由以下组成的组：信使rna(mrna)、微小rna(mirna)、核糖体rna(rrna)、线粒体rna和非编码rna。
77.在这种载玻片的一个实施方案中，所述样品是组织样本或来源于组织样本。在这种载玻片的另一个实施方案中，所述样品是血液样品或来源于血液样品。在另一个实施方案中，所述样品是细胞样品或来源于细胞样品。
78.在一个实施方案中，本发明提供了用于靶核酸的原位检测的试剂盒，所述试剂盒包含(a)前置前置扩增子组，其中所述前置前置扩增子组包含多个前置前置扩增子，其中所述多个前置前置扩增子包含对每个靶探针组具有特异性的前置前置扩增子，其中每个前置
前置扩增子包含用于所述靶探针组中的一个的靶探针对的结合位点和用于前置扩增子的多个结合位点；(b)前置扩增子组，其中所述前置扩增子组包含对每个前置前置扩增子具有特异性的多个前置扩增子亚组，其中每个前置扩增子亚组包含多个前置扩增子，其中前置扩增子亚组的前置扩增子包含用于对靶探针组具有特异性的前置前置扩增子中的一个的结合位点和用于扩增子的多个结合位点；(c)扩增子组，其中所述扩增子组包含对每个前置扩增子亚组具有特异性的多个扩增子亚组，其中每个扩增子亚组包含多个扩增子，其中扩增子亚组的扩增子包含用于所述前置扩增子亚组中的一个的前置扩增子的结合位点和用于标记探针的多个结合位点；(d)第一标记探针组，其中所述第一标记探针组包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个中的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的标记在所述第一标记探针亚组之间是可区分的并且其中所述标记是可裂解的，并且其中所述第一标记探针组能够特异性地标记第一靶核酸亚组；(e)第二标记探针组，其中所述第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一标记探针亚组相比，所述第二标记探针亚组对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的标记在所述第二标记探针亚组之间是可区分的并且其中所述标记是可裂解的，并且其中所述第二标记探针组能够特异性地标记与所述第一靶核酸亚组不同的第二靶核酸亚组。
79.在这种试剂盒的一个实施方案中，所述试剂盒还包含第三标记探针组，其中所述第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一和第二标记探针亚组相比，所述第三标记探针亚组对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的标记在所述第三标记探针亚组之间是可区分的并且其中所述标记是可裂解的，并且其中所述第三标记探针组能够特异性地标记与所述第一和第二靶核酸亚组不同的第三靶核酸亚组。
80.在这种试剂盒的一个实施方案中，所述试剂盒包含一个或多个靶探针组，其中每个靶探针组包含一对与靶核酸特异性地杂交的靶探针。
81.在这种试剂盒的一个实施方案中，每个靶探针组包含两对或更多对能够与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
82.在这种试剂盒的一个实施方案中，所述试剂盒包含裂解剂以从所述标记探针裂解所述可裂解的标记。在这种试剂盒的一个实施方案中，所述试剂盒包含用于透化细胞的至少一种试剂。
83.在一个实施方案中，本发明提供了一种检测多种靶核酸的方法，所述方法包括(a)使包含含有多种核酸的细胞的样品与多个靶探针组接触，其中每个靶探针组包含一对与靶核酸特异性地杂交的靶探针；(b)使所述样品与前置扩增子组接触，其中所述前置扩增子组包含多个前置扩增子，其中所述多个前置扩增子包含对每个靶探针组具有特异性的前置扩
增子，其中每个前置扩增子包含用于所述靶探针组中的一个的靶探针对的结合位点和用于扩增子的多个结合位点；(c)使所述样品与扩增子组接触，其中所述扩增子组包含对每个前置扩增子具有特异性的多个扩增子亚组，其中每个扩增子亚组包含多个扩增子，其中扩增子亚组的扩增子包含用于对靶探针组具有特异性的前置扩增子中的一个的结合位点和用于标记探针的多个结合位点；(d)使所述样品与第一标记探针组接触，其中所述第一标记探针组包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个中的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的标记在所述第一标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第一标记探针组特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第一靶核酸亚组；(e)检测与所述靶核酸结合的第一标记探针组的标记探针，从而检测所述第一靶核酸亚组；(f)在高于所述标记探针与扩增子之间的解链温度且低于所述靶探针、前置扩增子与扩增子之间的解链温度的温度下孵育所述样品，从而从与所述第一靶核酸亚组结合的第一标记探针组中除去所述标记；(g)使所述样品与第二标记探针组接触，其中所述第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一标记探针亚组相比，所述第二标记探针亚组对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的标记在所述第二标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第二标记探针组特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第二靶核酸亚组，所述第二靶核酸亚组不同于所述第一靶核酸亚组；以及(h)检测与所述靶核酸结合的第二标记探针组的标记探针，从而检测所述第二靶核酸亚组；其中检测到多种靶核酸。
84.在一个实施方案中，所述方法还包括(i)在高于所述标记探针与扩增子之间的解链温度且低于所述靶探针、前置扩增子与扩增子之间的解链温度的温度下孵育所述样品，从而从与所述第二靶核酸组结合的第二标记探针组除去所述标记；(j)使所述样品与第三标记探针组接触，其中所述第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一和第二标记探针亚组相比，所述第三标记探针亚组对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的标记在所述第三标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第三标记探针组特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第三靶核酸亚组，所述第三靶核酸亚组不同于所述第一和第二靶核酸亚组；以及(k)检测与所述靶核酸结合的第三标记探针组的标记探针，从而检测所述第三靶核酸亚组。在一个实施方案中，所述方法包括重复步骤(i)至(k)一次或多次。
85.在一个实施方案中，每个靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交
的靶探针。
86.在一个实施方案中，所述靶核酸独立地是dna或rna。在一个实施方案中，为rna的靶核酸独立地选自由以下组成的组：信使rna(mrna)、微小rna(mirna)、核糖体rna(rrna)、线粒体rna和非编码rna。
87.在这种方法的一个实施方案中，所述样品是组织样本或来源于组织样本。在一个实施方案中，所述样品是血液样品或来源于血液样品。在一个实施方案中，所述样品是细胞样品或来源于细胞样品。
88.本发明另外提供了一种固定和/或透化细胞的样品，所述样品包含(a)至少一个含有多种靶核酸的固定和/或透化细胞；(b)多个靶探针组，其中每个靶探针组包含一对与靶核酸特异性地杂交的靶探针；(c)前置扩增子组，其中所述前置扩增子组包含多个前置扩增子，其中所述多个前置扩增子包含对每个靶探针组具有特异性的前置扩增子，其中每个前置扩增子包含用于所述靶探针组中的一个的靶探针对的结合位点和用于扩增子的多个结合位点，其中所述前置扩增子与相应的特异性靶探针对杂交；(d)扩增子组，其中所述扩增子组包含对每个前置扩增子具有特异性的多个扩增子亚组，其中每个扩增子亚组包含多个扩增子，其中扩增子亚组的扩增子包含用于对靶探针组具有特异性的前置扩增子中的一个的结合位点和用于标记探针的多个结合位点，其中所述扩增子与对所述靶探针组具有特异性的相应前置扩增子杂交；(e)第一标记探针组，其中所述第一标记探针组包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个中的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的标记在所述第一标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第一标记探针组与相应的扩增子杂交并特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第一靶核酸亚组；其中所述杂交在所述第一靶核酸亚组上提供可检测的标记。
89.在一个实施方案中，通过在高于所述标记探针与扩增子之间的解链温度且低于所述靶探针、前置扩增子与扩增子之间的解链温度的温度下孵育所述样品来除去与所述第一靶核酸亚组结合的第一标记探针组的标记。
90.在这种样品的一个实施方案中，所述样品包含第二标记探针组，其中所述第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一标记探针亚组相比，所述第二标记探针亚组对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的标记在所述第二标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第二标记探针组与相应的扩增子杂交并特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第二靶核酸亚组，所述第二靶核酸亚组不同于所述第一靶核酸亚组，其中所述杂交在所述第二靶核酸亚组上提供可检测的标记。
91.在一个实施方案中，通过在高于所述标记探针与扩增子之间的解链温度且低于所述靶探针、前置扩增子与扩增子之间的解链温度的温度下孵育所述样品来除去来自与所述
第二靶核酸亚组结合的第二标记探针组的标记。
92.在本发明的这种样品的一个实施方案中，第三标记探针组，其中所述第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一和第二标记探针亚组相比，所述第三标记探针亚组对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的标记在所述第三标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第三标记探针组与相应的扩增子杂交并特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第三靶核酸亚组，所述第三靶核酸亚组不同于所述第一和第二靶核酸亚组，其中所述杂交在所述第三靶核酸亚组上提供可检测的标记。
93.在一个实施方案中，每个靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
94.在一个实施方案中，所述靶核酸独立地是dna或rna。在一个实施方案中，为rna的靶核酸独立地选自由以下组成的组：信使rna(mrna)、微小rna(mirna)、核糖体rna(rrna)、线粒体rna和非编码rna。
95.在本发明的样品的一个实施方案中，所述样品是组织样本或来源于组织样本。在一个实施方案中，所述样品是血液样品或来源于血液样品。在一个实施方案中，所述样品是细胞样品或来源于细胞样品。
96.本发明另外提供了一种载玻片，所述载玻片包含(a)其上固定有包含至少一个含有靶核酸的固定和/或透化细胞的多个固定和/或透化细胞的载玻片；(b)多个靶探针组，其中每个靶探针组包含一对与靶核酸特异性地杂交的靶探针；(c)前置扩增子组，其中所述前置扩增子组包含多个前置扩增子，其中所述多个前置扩增子包含对每个靶探针组具有特异性的前置扩增子，其中每个前置扩增子包含用于所述靶探针组中的一个的靶探针对的结合位点和用于扩增子的多个结合位点，其中所述前置扩增子与相应的特异性靶探针对杂交；(d)扩增子组，其中所述扩增子组包含对每个前置扩增子具有特异性的多个扩增子亚组，其中每个扩增子亚组包含多个扩增子，其中扩增子亚组的所述扩增子包含用于对靶探针组具有特异性的前置扩增子中的一个的结合位点和用于标记探针的多个结合位点，其中所述扩增子与对所述靶探针组具有特异性的相应前置扩增子杂交；(e)第一标记探针组，其中所述第一标记探针组包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个中的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的标记在所述第一标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第一标记探针组与相应的扩增子杂交并特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第一靶核酸亚组；其中所述杂交在所述第一靶核酸亚组上提供可检测的标记。
97.在一个实施方案中，通过在高于所述标记探针与扩增子之间的解链温度且低于所述靶探针、前置扩增子与扩增子之间的解链温度的温度下孵育所述样品来除去与所述第一
靶核酸亚组结合的第一标记探针组的标记，从而除去所述标记。
98.在一个实施方案中，所述载玻片包含第二标记探针组，其中所述第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一标记探针亚组相比，所述第二标记探针亚组对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的标记在所述第二标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第二标记探针组与相应的扩增子杂交并特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第二靶核酸亚组，所述第二靶核酸亚组不同于所述第一靶核酸亚组，其中所述杂交在所述第二靶核酸亚组上提供可检测的标记。
99.在一个实施方案中，通过在高于所述标记探针与扩增子之间的解链温度且低于所述靶探针、前置扩增子与扩增子之间的解链温度的温度下孵育所述样品来除去来自与所述第二靶核酸亚组结合的第二标记探针组的标记，从而除去。
100.在一个实施方案中，所述载玻片包含第三标记探针组，其中所述第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一和第二标记探针亚组相比，所述第三标记探针亚组对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的标记在所述第三标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第三标记探针组与相应的扩增子杂交并特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第三靶核酸亚组，所述第三靶核酸亚组不同于所述第一和第二靶核酸亚组，其中所述杂交在所述第三靶核酸亚组上提供可检测的标记。
101.在一个实施方案中，每个靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
102.在这种载玻片的一个实施方案中，所述靶核酸独立地是dna或rna。在一个实施方案中，为rna的靶核酸独立地选自由以下组成的组：信使rna(mrna)、微小rna(mirna)、核糖体rna(rrna)、线粒体rna和非编码rna。
103.在这种载玻片的一个实施方案中，所述样品是组织样本或来源于组织样本。在一个实施方案中，所述样品是血液样品或来源于血液样品。在一个实施方案中，所述样品是细胞样品或来源于细胞样品。
104.本发明还提供了一种用于靶核酸的原位检测的试剂盒，所述试剂盒包含(a)前置扩增子组，其中所述前置扩增子组包含多个前置扩增子，其中所述多个前置扩增子包含对每个靶探针组具有特异性的前置扩增子，其中每个前置扩增子包含用于所述靶探针组中的一个的靶探针对的结合位点和用于扩增子的多个结合位点；(b)扩增子组，其中所述扩增子组包含对每个前置扩增子具有特异性的多个扩增子亚组，其中每个扩增子亚组包含多个扩增子，其中扩增子亚组的扩增子包含用于对靶探针组具有特异性的前置扩增子中的一个的结合位点和用于标记探针的多个结合位点；(c)第一标记探针组，其中所述第一标记探针组
包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个中的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的标记在所述第一标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第一标记探针组能够特异性地标记第一靶核酸亚组；(d)第二标记探针组，其中所述第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一标记探针亚组相比，所述第二标记探针亚组对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的标记在所述第二标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第二标记探针组能够特异性地标记与所述第一靶核酸亚组不同的第二靶核酸亚组。
105.在一个实施方案中，所述试剂盒包含第三标记探针组，其中所述第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一和第二标记探针亚组相比，所述第三标记探针亚组对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的标记在所述第三标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第三标记探针组能够特异性地标记与所述第一和第二靶核酸亚组不同的第三靶核酸亚组。
106.在一个实施方案中，所述试剂盒包含一个或多个靶探针组，其中每个靶探针组包含一对与靶核酸特异性地杂交的靶探针。在一个实施方案中，每个靶探针组包含两对或更多对能够与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
107.在一个实施方案中，所述试剂盒包含用于透化细胞的至少一种试剂。
108.本发明还提供了一种检测多种核酸的方法，所述方法包括(a)使包含含有多种核酸的细胞的样品与多个靶探针组接触，其中每个靶探针组包含一对与靶核酸特异性地杂交的靶探针；(b)使所述样品与前置前置扩增子组接触，其中所述前置前置扩增子组包含多对前置前置扩增子，其中所述前置前置扩增子组包含对所述靶探针组的靶探针对中的每个具有特异性的一对前置前置扩增子，其中所述前置前置扩增子对的每个前置前置扩增子包含用于靶探针组的靶探针对的靶探针中的一个的结合位点，并且其中所述前置前置扩增子包含用于前置扩增子的多个结合位点；(c)使所述样品与前置扩增子组接触，其中所述前置扩增子组包含多个前置扩增子，其中所述多个前置扩增子包含对每对前置前置扩增子具有特异性的前置扩增子，其中每个前置扩增子包含用于所述前置前置扩增子组的前置前置扩增子对中的一个的结合位点和用于扩增子的多个结合位点；(d)使所述样品与扩增子组接触，其中所述扩增子组包含对每个前置扩增子具有特异性的多个扩增子亚组，所述每个前置扩增子对前置前置扩增子具有特异性，其中扩增子亚组的扩增子包含用于对一对前置前置扩
增子具有特异性的前置扩增子中的一个的结合位点和用于标记探针的多个结合位点；(e)使所述样品与第一标记探针组接触，其中所述第一标记探针组包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个中的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的标记在所述第一标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第一标记探针组特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第一靶核酸亚组；(f)检测与所述靶核酸结合的第一标记探针组的标记探针，从而检测所述第一靶核酸亚组；(g)在高于所述标记探针与扩增子之间的解链温度且低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度的温度下孵育所述样品，从而从与所述第一靶核酸亚组结合的第一标记探针组中除去所述标记；(h)使所述样品与第二标记探针组接触，其中所述第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一标记探针亚组相比，所述第二标记探针亚组对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的标记在所述第二标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第二标记探针组特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第二靶核酸亚组，所述第二靶核酸亚组不同于所述第一靶核酸亚组；以及(i)检测与所述靶核酸结合的第二标记探针组的标记探针，从而检测所述第二靶核酸亚组；其中检测到多种靶核酸。
109.在一个实施方案中，所述方法还包括(j)在高于所述标记探针与扩增子之间的解链温度且低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度的温度下孵育所述样品，从而从与所述第二靶核酸组结合的第二标记探针组除去所述标记；(k)使所述样品与第三标记探针组接触，其中所述第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一和第二标记探针亚组相比，所述第三标记探针亚组对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的标记在所述第三标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第三标记探针组特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第三靶核酸亚组，所述第三靶核酸亚组不同于所述第一和第二靶核酸亚组；以及(l)检测与所述靶核酸结合的第三标记探针组的标记探针，从而检测所述第三靶核酸亚组。
110.在一个实施方案中，所述方法包括重复步骤(j)至(l)一次或多次。
111.在一个实施方案中，每个靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
112.在一个实施方案中，所述靶核酸独立地是dna或rna。在一个实施方案中，为rna的
靶核酸独立地选自由以下组成的组：信使rna(mrna)、微小rna(mirna)、核糖体rna(rrna)、线粒体rna和非编码rna。
113.在一个实施方案中，所述样品是组织样本或来源于组织样本。在一个实施方案中，所述样品是血液样品或来源于血液样品。在一个实施方案中，所述样品是细胞样品或来源于细胞样品。
114.本发明还提供了一种固定和/或透化细胞的样品，所述样品包含(a)至少一个含有多种靶核酸的固定和/或透化细胞；(b)多个靶探针组，其中每个靶探针组包含一对与靶核酸特异性地杂交的靶探针；(c)前置前置扩增子组，其中所述前置前置扩增子组包含多对前置前置扩增子，其中所述前置前置扩增子组包含对所述靶探针组的靶探针对中的每个具有特异性的一对前置前置扩增子，其中所述前置前置扩增子对的每个前置前置扩增子包含用于靶探针组的靶探针对的靶探针中的一个的结合位点，并且其中所述前置前置扩增子包含用于前置扩增子的多个结合位点，其中所述前置前置扩增子与相应的特异性靶探针对杂交；(d)前置扩增子组，其中所述前置扩增子组包含多个前置扩增子，其中所述多个前置扩增子包含对每对前置前置扩增子具有特异性的前置扩增子，其中每个前置扩增子包含用于所述前置前置扩增子组的前置前置扩增子对中的一个的结合位点和用于扩增子的多个结合位点，其中所述前置扩增子与相应的前置前置扩增子对杂交；(e)扩增子组，其中所述扩增子组包含对每个前置扩增子具有特异性的多个扩增子亚组，所述每个前置扩增子对每对前置前置扩增子具有特异性，其中扩增子亚组的扩增子包含用于对一对前置前置扩增子具有特异性的前置扩增子中的一个的结合位点和用于标记探针的多个结合位点，其中所述扩增子与相应的前置扩增子杂交；(f)第一标记探针组，其中第一标记探针组包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个中的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的标记在所述第一标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第一标记探针组与相应的扩增子杂交并特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第一靶核酸亚组；其中所述杂交在所述第一靶核酸亚组上提供可检测的标记。
115.在一个实施方案中，通过在高于所述标记探针与扩增子之间的解链温度且低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度的温度下孵育所述样品来除去与所述第一靶核酸亚组结合的第一标记探针组的标记。
116.在一个实施方案中，所述样品包含第二标记探针组，其中所述第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一标记探针亚组相比，所述第二标记探针亚组对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的标记在所述第二标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第二标记探针组与相应的扩增子杂交并特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第二靶核酸亚组，所述第二靶核酸亚组不同于所述第一靶核
酸亚组；并且其中所述杂交在所述第二靶核酸亚组上提供可检测的标记。
117.在一个实施方案中，通过在高于所述标记探针与扩增子之间的解链温度且低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度的温度下孵育所述样品来除去来自与所述第二靶核酸亚组结合的第二标记探针组的标记。
118.在一个实施方案中，所述样品包含第三标记探针组，其中所述第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一和第二标记探针亚组相比，所述第三标记探针亚组对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的标记在所述第三标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第三标记探针组与相应的扩增子杂交并特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第三靶核酸亚组，所述第三靶核酸亚组不同于所述第一和第二靶核酸亚组，其中所述杂交在所述第三靶核酸亚组上提供可检测的标记。
119.在一个实施方案中，每个靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
120.在一个实施方案中，所述靶核酸独立地是dna或rna。在一个实施方案中，为rna的靶核酸独立地选自由以下组成的组：信使rna(mrna)、微小rna(mirna)、核糖体rna(rrna)、线粒体rna和非编码rna。
121.在一个实施方案中，所述样品是组织样本或来源于组织样本。在一个实施方案中，所述样品是血液样品或来源于血液样品。在一个实施方案中，所述样品是细胞样品或来源于细胞样品。
122.本发明还提供了一种载玻片，所述载玻片包含(a)其上固定有包含至少一个含有靶核酸的固定和/或透化细胞的多个固定和/或透化细胞的载玻片；(b)多个靶探针组，其中每个靶探针组包含一对与靶核酸特异性地杂交的靶探针；(c)前置前置扩增子组，其中所述前置前置扩增子组包含多对前置前置扩增子，其中所述前置前置扩增子组包含对所述靶探针组的靶探针对中的每个具有特异性的一对前置前置扩增子，其中所述前置前置扩增子对的每个前置前置扩增子包含用于靶探针组的靶探针对的靶探针中的一个的结合位点，并且其中所述前置前置扩增子包含用于前置扩增子的多个结合位点，其中所述前置前置扩增子与相应的特异性靶探针对杂交；(d)前置扩增子组，其中所述前置扩增子组包含多个前置扩增子，其中所述多个前置扩增子包含对每对前置前置扩增子具有特异性的前置扩增子，其中每个前置扩增子包含用于所述前置前置扩增子组的前置前置扩增子对中的一个的结合位点和用于扩增子的多个结合位点，其中所述前置扩增子与相应的前置前置扩增子对杂交；(e)扩增子组，其中所述扩增子组包含对每个前置扩增子具有特异性的多个扩增子亚组，所述每个前置扩增子对每对前置前置扩增子具有特异性，其中扩增子亚组的扩增子包含用于对一对前置前置扩增子具有特异性的前置扩增子中的一个的结合位点和用于标记探针的多个结合位点，其中所述扩增子与相应的前置扩增子杂交；(f)第一标记探针组，其中第一标记探针组包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记
探针亚组中的每个中的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的标记在所述第一标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第一标记探针组与相应的扩增子杂交并特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第一靶核酸亚组；其中所述杂交在所述第一靶核酸亚组上提供可检测的标记。
123.在一个实施方案中，通过在高于所述标记探针与扩增子之间的解链温度且低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度的温度下孵育所述样品来除去与所述第一靶核酸亚组结合的第一标记探针组的标记。
124.在一个实施方案中，所述载玻片包含第二标记探针组，其中所述第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一标记探针亚组相比，所述第二标记探针亚组对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的标记在所述第二标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第二标记探针组与相应的扩增子杂交并特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第二靶核酸亚组，所述第二靶核酸亚组不同于所述第一靶核酸亚组；并且其中所述杂交在所述第二靶核酸亚组上提供可检测的标记。
125.在一个实施方案中，通过在高于所述标记探针与扩增子之间的解链温度且低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度的温度下孵育所述样品来除去来自与所述第二靶核酸亚组结合的第二标记探针组的标记。
126.在一个实施方案中，所述载玻片包含第三标记探针组，其中所述第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一和第二标记探针亚组相比，所述第三标记探针亚组对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的标记在所述第三标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第三标记探针组与相应的扩增子杂交并特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第三靶核酸亚组，所述第三靶核酸亚组不同于所述第一和第二靶核酸亚组，其中所述杂交在所述第三靶核酸亚组上提供可检测的标记。
127.在一个实施方案中，每个靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
128.在这种载玻片的一个实施方案中，所述靶核酸独立地是dna或rna。在一个实施方案中，为rna的靶核酸独立地选自由以下组成的组：信使rna(mrna)、微小rna(mirna)、核糖体rna(rrna)、线粒体rna和非编码rna。
129.在一个实施方案中，所述样品是组织样本或来源于组织样本。在一个实施方案中，所述样品是血液样品或来源于血液样品。在一个实施方案中，所述样品是细胞样品或来源
于细胞样品。
130.本发明另外提供了一种用于靶核酸的原位检测的试剂盒，所述试剂盒包含(a)前置前置扩增子组，其中所述前置前置扩增子组包含多对前置前置扩增子，其中所述前置前置扩增子组包含对靶探针组的靶探针对中的每个具有特异性的一对前置前置扩增子，其中所述前置前置扩增子对的每个前置前置扩增子包含用于靶探针组的靶探针对的靶探针中的一个的结合位点，并且其中所述前置前置扩增子包含用于前置扩增子的多个结合位点；(b)前置扩增子组，其中所述前置扩增子组包含多个前置扩增子，其中所述多个前置扩增子包含对每对前置前置扩增子具有特异性的前置扩增子，其中每个前置扩增子包含用于所述前置前置扩增子组的前置前置扩增子对中的一个的结合位点和用于扩增子的多个结合位点；(c)扩增子组，其中所述扩增子组包含对每个前置扩增子具有特异性的多个扩增子亚组，所述每个前置扩增子对每对前置前置扩增子具有特异性，其中扩增子亚组的扩增子包含用于对一对前置前置扩增子具有特异性的前置扩增子中的一个的结合位点和用于标记探针的多个结合位点；(d)第一标记探针组，其中所述第一标记探针组包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个中的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的标记在所述第一标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第一标记探针组能够特异性地标记第一靶核酸亚组；(e)第二标记探针组，其中所述第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一标记探针亚组相比，所述第二标记探针亚组对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的标记在所述第二标记探针亚组之间是可区分的并且其中所述标记是可裂解的，并且其中所述第二标记探针组能够特异性地标记与所述第一靶核酸亚组不同的第二靶核酸亚组；并且。
131.在一个实施方案中，所述试剂盒还包含第三标记探针组，其中所述第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一和第二标记探针亚组相比，所述第三标记探针亚组对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的标记在所述第三标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第三标记探针组能够特异性地标记与所述第一和第二靶核酸亚组不同的第三靶核酸亚组。
132.在一个实施方案中，所述试剂盒包含一个或多个靶探针组，其中每个靶探针组包含一对与靶核酸特异性地杂交的靶探针。在一个实施方案中，每个靶探针组包含两对或更多对能够与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
133.在一个实施方案中，所述试剂盒包含用于透化细胞的至少一种试剂。
134.本发明还提供了一种检测多种靶核酸的方法，所述方法包括(a)使包含含有多种核酸的细胞的样品与多个靶探针组接触，其中每个靶探针组包含一对与靶核酸特异性地杂交的靶探针；(b)使所述样品与前置前置扩增子组接触，其中所述前置前置扩增子组包含多个前置前置扩增子，其中所述多个前置前置扩增子包含对每个靶探针组具有特异性的前置前置扩增子，其中每个前置前置扩增子包含用于所述靶探针组中的一个的靶探针对的结合位点和用于前置扩增子的多个结合位点；(c)使所述样品与前置扩增子组接触，其中所述前置扩增子组包含对每个前置前置扩增子具有特异性的多个前置扩增子亚组，其中每个前置扩增子亚组包含多个前置扩增子，其中前置扩增子亚组的前置扩增子包含用于对靶探针组具有特异性的前置前置扩增子中的一个的结合位点和用于扩增子的多个结合位点；(d)使所述样品与扩增子组接触，其中所述扩增子组包含对每个前置扩增子亚组具有特异性的多个扩增子亚组，其中每个扩增子亚组包含多个扩增子，其中扩增子亚组的扩增子包含用于所述前置扩增子亚组中的一个的前置扩增子的结合位点和用于标记探针的多个结合位点；(e)使所述样品与第一标记探针组接触，其中所述第一标记探针组包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个中的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的标记在所述第一标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第一标记探针组特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第一靶核酸亚组；(f)检测与所述靶核酸结合的第一标记探针组的标记探针，从而检测所述第一靶核酸亚组；(g)在高于所述标记探针与扩增子之间的解链温度且低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度的温度下孵育所述样品，从而从与所述第一靶核酸亚组结合的第一标记探针组中除去所述标记；(h)使所述样品与第二标记探针组接触，其中所述第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一标记探针亚组相比，所述第二标记探针亚组对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的标记在所述第二标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第二标记探针组特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第二靶核酸亚组，所述第二靶核酸亚组不同于所述第一靶核酸亚组；以及(i)检测与所述靶核酸结合的第二标记探针组的标记探针，从而检测所述第二靶核酸亚组；其中检测到多种靶核酸。
135.在一个实施方案中，所述方法还包括(j)在高于所述标记探针与扩增子之间的解链温度且低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度的温度下孵育所述样品，从而从与所述第二靶核酸组结合的第二标记探针组除去所述标记；(k)使所述样品与第三标记探针组接触，其中所述第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一和第二标记探针亚组相比，所述第三标记探针亚组对不同扩增子亚组的扩增子具有特异
性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的标记在所述第三标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第三标记探针组特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第三靶核酸亚组，所述第三靶核酸亚组不同于所述第一和第二靶核酸亚组；以及(l)检测与所述靶核酸结合的第三标记探针组的标记探针，从而检测所述第三靶核酸亚组。
136.在一个实施方案中，所述方法包括重复步骤(j)至(l)一次或多次。
137.在一个实施方案中，每个靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
138.在一个实施方案中，所述靶核酸独立地是dna或rna。在一个实施方案中，为rna的靶核酸独立地选自由以下组成的组：信使rna(mrna)、微小rna(mirna)、核糖体rna(rrna)、线粒体rna和非编码rna。
139.在一个实施方案中，所述样品是组织样本或来源于组织样本。在一个实施方案中，所述样品是血液样品或来源于血液样品。在一个实施方案中，所述样品是细胞样品或来源于细胞样品。
140.在一个实施方案中，本发明另外提供了一种固定和/或透化细胞的样品，所述样品包含(a)至少一个含有多种靶核酸的固定和/或透化细胞；(b)多个靶探针组，其中每个靶探针组包含一对与靶核酸特异性地杂交的靶探针；(c)前置前置扩增子组，其中所述前置前置扩增子组包含多个前置前置扩增子，其中所述多个前置前置扩增子包含对每个靶探针组具有特异性的前置前置扩增子，其中每个前置前置扩增子包含用于所述靶探针组中的一个的靶探针对的结合位点和用于前置扩增子的多个结合位点，其中所述前置前置扩增子与相应的特异性靶探针对杂交；(d)前置扩增子组，其中所述前置扩增子组包含对每个前置前置扩增子具有特异性的多个前置扩增子亚组，其中每个前置扩增子亚组包含多个前置扩增子，其中前置扩增子亚组的前置扩增子包含用于对靶探针组具有特异性的前置前置扩增子中的一个的结合位点和用于扩增子的多个结合位点，其中所述前置扩增子与对所述靶探针组具有特异性的相应前置前置扩增子杂交；(e)扩增子组，其中所述扩增子组包含对每个前置扩增子亚组具有特异性的多个扩增子亚组，其中每个扩增子亚组包含多个扩增子，其中扩增子亚组的扩增子包含用于所述前置扩增子亚组中的一个的前置扩增子的结合位点和用于标记探针的多个结合位点，其中所述扩增子与相应的前置扩增子杂交；(f)第一标记探针组，其中第一标记探针组包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个中的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的标记在所述第一标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第一标记探针组与相应的扩增子杂交并特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第一靶核酸亚组；其中所述杂交在所述第一靶核酸亚组上提供可检测的标记。
141.在一个实施方案中，通过在高于所述标记探针与扩增子之间的解链温度且低于所
述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度的温度下孵育所述样品来除去与所述第一靶核酸亚组结合的第一标记探针组的标记。
142.在一个实施方案中，所述样品包含第二标记探针组，其中所述第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一标记探针亚组相比，所述第二标记探针亚组对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的标记在所述第二标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第二标记探针组与相应的扩增子杂交并特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第二靶核酸亚组，所述第二靶核酸亚组不同于所述第一靶核酸亚组，其中所述杂交在所述第二靶核酸亚组上提供可检测的标记。
143.在一个实施方案中，通过在高于所述标记探针与扩增子之间的解链温度且低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度的温度下孵育所述样品来除去来自与所述第二靶核酸亚组结合的第二标记探针组的标记。
144.在一个实施方案中，所述样品包含第三标记探针组，其中所述第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一和第二标记探针亚组相比，所述第三标记探针亚组对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的标记在所述第三标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第三标记探针组与相应的扩增子杂交并特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第三靶核酸亚组，所述第三靶核酸亚组不同于所述第一和第二靶核酸亚组，其中所述杂交在所述第三靶核酸亚组上提供可检测的标记。
145.在一个实施方案中，每个靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
146.在一个实施方案中，所述靶核酸独立地是dna或rna。在一个实施方案中，为rna的靶核酸独立地选自由以下组成的组：信使rna(mrna)、微小rna(mirna)、核糖体rna(rrna)、线粒体rna和非编码rna。
147.在一个实施方案中，所述样品是组织样本或来源于组织样本。在一个实施方案中，所述样品是血液样品或来源于血液样品。在一个实施方案中，所述样品是细胞样品或来源于细胞样品。
148.在一个实施方案中，本发明另外提供了一种载玻片，所述载玻片包含(a)其上固定有包含至少一个含有靶核酸的固定和/或透化细胞的多个固定和/或透化细胞的载玻片；(b)多个靶探针组，其中每个靶探针组包含一对与靶核酸特异性地杂交的靶探针；(c)前置前置扩增子组，其中所述前置前置扩增子组包含多个前置前置扩增子，其中所述多个前置前置扩增子包含对每个靶探针组具有特异性的前置前置扩增子，其中每个前置前置扩增子包含用于所述靶探针组中的一个的靶探针对的结合位点和用于前置扩增子的多个结合位
点，其中所述前置前置扩增子与相应的特异性靶探针对杂交；(d)前置扩增子组，其中所述前置扩增子组包含对每个前置前置扩增子具有特异性的多个前置扩增子亚组，其中每个前置扩增子亚组包含多个前置扩增子，其中前置扩增子亚组的前置扩增子包含用于对靶探针组具有特异性的前置前置扩增子中的一个的结合位点和用于扩增子的多个结合位点，其中所述前置扩增子与对所述靶探针组具有特异性的相应前置前置扩增子杂交；(e)扩增子组，其中所述扩增子组包含对每个前置扩增子亚组具有特异性的多个扩增子亚组，其中每个扩增子亚组包含多个扩增子，其中扩增子亚组的扩增子包含用于所述前置扩增子亚组中的一个的前置扩增子的结合位点和用于标记探针的多个结合位点，其中所述扩增子与相应的前置扩增子杂交；(f)第一标记探针组，其中第一标记探针组包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个中的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的标记在所述第一标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第一标记探针组与相应的扩增子杂交并特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第一靶核酸亚组；其中所述杂交在所述第一靶核酸亚组上提供可检测的标记。
149.在一个实施方案中，通过在高于所述标记探针与扩增子之间的解链温度且低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度的温度下孵育所述样品来除去与所述第一靶核酸亚组结合的第一标记探针组的标记。
150.在一个实施方案中，所述载玻片包含第二标记探针组，其中所述第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一标记探针亚组相比，所述第二标记探针亚组对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的标记在所述第二标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第二标记探针组与相应的扩增子杂交并特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第二靶核酸亚组，所述第二靶核酸亚组不同于所述第一靶核酸亚组，其中所述杂交在所述第二靶核酸亚组上提供可检测的标记。
151.在一个实施方案中，通过在高于所述标记探针与扩增子之间的解链温度且低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度的温度下孵育所述样品来除去来自与所述第二靶核酸亚组结合的第二标记探针组的标记。
152.在一个实施方案中，所述载玻片包含第三标记探针组，其中所述第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一和第二标记探针亚组相比，所述第三标记探针亚组对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的标记在所述第三标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置前置扩增子、前
置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第三标记探针组与相应的扩增子杂交并特异性地标记与所述多个靶探针组杂交的第三靶核酸亚组，所述第三靶核酸亚组不同于所述第一和第二靶核酸亚组，其中所述杂交在所述第三靶核酸亚组上提供可检测的标记。
153.在一个实施方案中，每个靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
154.在一个实施方案中，所述靶核酸独立地是dna或rna。在一个实施方案中，为rna的靶核酸独立地选自由以下组成的组：信使rna(mrna)、微小rna(mirna)、核糖体rna(rrna)、线粒体rna和非编码rna。
155.在一个实施方案中，所述样品是组织样本或来源于组织样本。在一个实施方案中，所述样品是血液样品或来源于血液样品。
156.在一个实施方案中，所述样品是细胞样品或来源于细胞样品。
157.在一个实施方案中，本发明另外提供了一种用于靶核酸的原位检测的试剂盒，所述试剂盒包含(a)前置前置扩增子组，其中所述前置前置扩增子组包含多个前置前置扩增子，其中所述多个前置前置扩增子包含对每个靶探针组具有特异性的前置前置扩增子，其中每个前置前置扩增子包含用于所述靶探针组中的一个的靶探针对的结合位点和用于前置扩增子的多个结合位点；(b)前置扩增子组，其中所述前置扩增子组包含对每个前置前置扩增子具有特异性的多个前置扩增子亚组，其中每个前置扩增子亚组包含多个前置扩增子，其中前置扩增子亚组的前置扩增子包含用于对靶探针组具有特异性的前置前置扩增子中的一个的结合位点和用于扩增子的多个结合位点；(c)扩增子组，其中所述扩增子组包含对每个前置扩增子亚组具有特异性的多个扩增子亚组，其中每个扩增子亚组包含多个扩增子，其中扩增子亚组的扩增子包含用于所述前置扩增子亚组中的一个的前置扩增子的结合位点和用于标记探针的多个结合位点；(d)第一标记探针组，其中所述第一标记探针组包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个中的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的标记在所述第一标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第一标记探针组能够特异性地标记第一靶核酸亚组；(e)第二标记探针组，其中所述第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一标记探针亚组相比，所述第二标记探针亚组对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的标记在所述第二标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第二标记探针组能够特异性地标记与所述第一靶核酸亚组不同的第二靶核酸亚组。
158.在一个实施方案中，所述试剂盒还包含第三标记探针组，其中所述第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个的扩增子具有特异性，其中与所述第一和第二标记探针亚组相比，所述第三标记探针亚组对不同
扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中所述标记探针亚组中的每个的标记探针包含标记和用于所述扩增子亚组中的一个的扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的标记在所述第三标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第三标记探针组能够特异性地标记与所述第一和第二靶核酸亚组不同的第三靶核酸亚组。
159.在一个实施方案中，所述试剂盒包含一个或多个靶探针组，其中每个靶探针组包含一对与靶核酸特异性地杂交的靶探针。在一个实施方案中，每个靶探针组包含两对或更多对能够与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
160.在一个实施方案中，所述试剂盒包含用于透化细胞的至少一种试剂。
附图说明
161.图1示出多路复用测定的示意图。这种测定的某些实施方案在本文中被称为rnascope
tm hiplex探针杂交和扩增系统。在所描绘的实施方案中，原始rnascope
tm
探针设计和分支dna样信号放大方法(参见，例如，美国专利号7,709,198、美国公布2008/0038725和2009/0081688、wo 2007/001986、wo 2007/002006；wang等人,expert rev.mol.diagn.2(2):109
–
119(2002))被采用于rnascope
tm hiplex中以用于靶核酸的多路复用检测。在图1中所描绘的实施方案中，十二个靶序列同时与结合至12个正交信号放大系统(由不同颜色的标记探针表示)的探针对(描绘为双z探针)杂交。
162.图2示出多路复用测定的工作流程(rnascope
tm hiplex测定工作流程)的示意图。在图2中描绘的实施方案中，十二个靶序列与靶探针(描绘为双z探针)杂交，并且信号通过扩增系统如rnascope
tm
同时放大。在所描绘的实施方案中，前四个靶标经由四个非光谱重叠荧光染料缀合的寡核苷酸(标记探针)检测并使用常规荧光显微镜或扫描仪成像。然后使荧光团从标记探针上裂解下来，并且接下来的四个靶标使用相同的方法标记和成像。在各自四个靶标的l(例如，三)轮检测后，使用图像配准软件算法配准图像，以创建具有单细胞分辨率的叠加图像的最终合成。
163.图3a-3c示出靶核酸的正交标记的示意图。图3a示出基于rnascope
tm
测定的靶核酸的正交标记。图3a示出用相应的信号生成复合物(sgc)标记三种示例性靶核酸。图3a示出靶探针对1(tp1a和tp1b)与靶核酸1的结合。示出前置扩增子(pa1)与靶探针对(tp1a和tp1b)结合。示出多个扩增子(amp1)与pa1结合。示出多个标记探针(lp1)与扩增子结合。图3a示出靶标2和3的类似配置，其中sgc的组分(靶探针、前置扩增子、扩增子、标记探针)对于相应靶标中的每一个具有特异性。图3b示出图3a中所示配置的修改。图3b示出用相应的信号生成复合物(sgc)标记两种示例性靶核酸。图3b示出靶探针对1(tp1a和tp1b)与靶核酸1的结合。示出前置前置扩增子(ppa1)与靶探针对(tp1a和tp1b)结合。示出多个前置扩增子(pa1)与ppa1结合。示出多个扩增子(amp1)与pa1结合。为了简单起见，显示了扩增子与一个前置扩增子结合，但是应当理解，扩增子可结合至所有前置扩增子。示出多个标记探针(lp1)与扩增子结合。图3b示出靶标2的类似配置，其中sgc的组分(靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子、扩增子、标记探针)对于相应靶标中的每一个具有特异性。图3c中示出基于basescope
tm
测定的靶核酸的正交标记。图3c中示出用相应的信号生成复合物(sgc)标记两种示例性靶
核酸。图3c示出靶探针对1(tp1a和tp1b)与靶核酸1的结合。示出一对前置前置扩增子(ppa1a和ppa1b)与相应的靶探针对(tp1a和tp1b)结合。示出前置扩增子(pa1)与前置前置扩增子对(ppa1a和ppa1b)结合。示出多个扩增子(amp1)与pa1结合。为了简单起见，显示了扩增子与一个前置扩增子结合，但是应当理解，扩增子可结合至所有前置扩增子。示出多个标记探针(lp1)与扩增子结合。图3c示出靶标2的类似配置，其中sgc的组分(靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子、扩增子、标记探针)对于相应靶标中的每一个具有特异性。
164.图4a-4c示出在三轮荧光检测中检测到hela细胞中的12种阳性对照基因。将12种不同靶标的探针对与制备为福尔马林固定石蜡包埋切片的hela细胞杂交，并且通过与前置扩增子和扩增子序列的连续几轮杂交将杂交信号一起放大。图4a示出与靶核酸、rna聚合酶ii亚基a(polr2a)、肽基脯氨酰异构酶b(ppib)、泛素c(ubc)和次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1(hprt1)基因结合的标记的第一轮可视化的检测。将polr2a、ppib、ubc和hprt1分别用荧光团alexa 488、atto 550、atto 647n和alexa 750标记。在单独的载玻片上，使用相同荧光标记的细菌二氢二皮考啉酸还原酶(dapb)基因的阴性对照探针用于评估非特异性背景。将细胞核用dapi(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)(蓝色)染色。图4b示出在第一轮中结合的标记裂解后，分别使用荧光团alexa 488、atto 550、atto 647n和alexa 750，与靶核酸、微管蛋白βi类(tubb)、核糖体蛋白l28(rpl28)、核糖体蛋白l5(rpl5)和β-2微球蛋白(b2m)结合的标记物的第二轮可视化的检测。图4c示出在第二轮中结合的标记裂解后，分别使用荧光团alexa 488、atto 550、atto 647n和alexa 750，与靶核酸、肌动蛋白β(actb)、乳酸脱氢酶a(ldha)、核糖体蛋白侧茎亚基p0(rplp0)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)结合的标记的第三轮可视化的检测。
165.图5示出新鲜冷冻小鼠大脑中神经元标志物的检测和图像配准。进行三轮标记探针杂交以使用alexa 488、atto 550、atto 647n和alexa 750荧光团检测5-羟色胺(血清紧张素)受体7(htr7)、原钙粘蛋白8(pcdh8)、meis同源框1(meis1)、酪氨酸羟化酶(th)、晶体蛋白、mu(crym)、突触蛋白(synpr)、多巴胺受体d1(drd1a)、大麻素受体1(脑)(cnr1)、wolframin er跨膜糖蛋白(wfs1)、多巴胺受体d2(drd2)和钙结合蛋白1(calb1)，随后使用atto 550使用抗neun(由rna结合蛋白、fox-1同源物(秀丽隐杆线虫)3编码)抗体进行免疫荧光检测，从而产生一组四张图像，然后通过使用图像分析软件将12个靶信号叠加在相同单独细胞上来将所述图像配准。
166.图6a-6c示出使用信号产生复合物(sgc)检测核酸靶标的前述方法的示意图。ppa，前置前置扩增子；pa，前置扩增子；amp，扩增子；lp，标记探针。
具体实施方式
167.本发明涉及例如通过原位杂交来进行核酸的多路复用分析的方法。本发明的方法允许检测同一样品内和同一细胞内的多种靶核酸。
168.一种核酸检测方法利用称为rnascope
tm
的rna ish技术，所述技术使用专门设计的寡核苷酸探针，有时称为“双z”或zz探针，与分支dna样信号放大系统组合来在标准明视野显微镜下以单分子灵敏度可靠地检测小至1千碱基的rna(anderson等人,j.cell.biochem.117(10):2201
–
2208(2016)；wang等人,j.mol.diagn.14(1):22-29(2012))。这种探针设计极大地提高信号放大的特异性，因为只有当每对中的两个探针均与
它们的预期靶标结合时才能发生信号放大。rnascope
tm
技术可使用荧光检测同时区分多达四个或五个rna靶标。然而，先前尚未描述使用rnascope
tm
检测多于四至五个靶标的方法。
169.本文描述了一种测定和检测策略，其使用检测系统如rnascope
tm
信号放大系统和具有共同光谱特征的荧光染料，以迭代方式以单细胞分辨率提供对两个或多个靶核酸序列的特异性检测。这是通过所有靶序列的同时靶杂交和扩增，然后在连续轮次中进行一般三至五个核酸靶标的迭代检测来实现的。为了提供执行迭代检测步骤的能力，标记如荧光染料是可裂解的，例如化学可裂解的，从而允许使用与第一轮中相同的标记进行后续几轮检测。在一轮中，利用可使用常规荧光显微镜进行光谱分离的荧光染料缀合物。然后裂解荧光染料。一种示例性裂解剂是还原剂三(2-羧乙基)膦(tcep)。在裂解可检测标记(如荧光染料)后，进行后续几轮靶标检测和成像。所述测定策略无需使用苛刻的条件从前一轮中剥离标记探针(这可能破坏与剩余靶标相关的现有信号放大复合物)，并且还保留组织和rna的完整性以实现最大程度的检测。
170.本发明涉及允许对细胞中的核酸序列进行高灵敏度和特异性检测的方法。本发明的方法在研究和诊断中具有许多实际应用(hu等人,biomark.res.2(1):1-13,doi:10.1186/2050-7771-2-3(2014)；ratan等人,cureus 9(6):e1325.doi:10.7759/cureus.1325(2017)；weier等人,expert rev.mol.diagn.2(2):109-119(2002))。本发明的方法可用于，例如，在高度复杂的组织(如神经系统和肿瘤微环境)中绘制空间组构、鉴定已知细胞类型和新细胞类型、鉴定细胞状态、检测患病细胞和组织中的基因表达改变、在特定细胞类型中定位改变的基因表达、分析肿瘤异质性、检测癌症诊断和预后或其他疾病状况的生物标志物，检测伴随诊断的生物标志物，以及检测和鉴定病原体(例如，细菌、病毒、真菌、微生物寄生虫。)
171.本发明将rnascope
tm
技术(wang等人,同上,2012)核心的探针设计原理和分支dna样信号放大扩展至相同细胞和/或组织切片中的多个核酸靶标(大于一种以迭代方式检测到的靶核酸)的高灵敏度和特异性序列检测。与rnascope
tm
探针一样，每个靶探针都含有结合至靶核酸中的特定序列的靶结合片段(靶结合位点)。如本文所述，探针还含有结合至信号放大分子的“尾”序列。两个探针成对结合至靶核酸序列中的相邻位点。只有当两个探针都结合至其相应的靶位点时，才能形成信号放大分子(例如，如图3a中的前置扩增子或如图3b和3c中的前置前置扩增子)的完整结合位点，从而导致成功的信号放大和检测。用于不同靶序列的探针被设计为具有针对相应正交扩增分子的独立且不同的结合序列。可使用适当的算法容易地设计此类序列，以实现并行的多个靶标的探针杂交和信号放大(参见图1和图3)。使用可检测标记(如荧光团)在多轮中检测靶标，所述标记在每一轮内在光谱上是不同的。
172.相同的迭代测定设计策略可用于basescope
tm
信号放大系统(baker等人,nat.commun.8(1):1998,doi:10.1038/s41467-017-02295-5(2017))，其可应用于检测短序列。所述方法还可应用于多个靶标的dna检测。本发明的方法还可应用于本领域中已知的其他信号放大方法，如杂交链反应(hcr)(choi等人,development 145(12),pii:dev165753,doi:10.1242/dev.165753(2018))。hcr(hcr v3.0)的最新版本采用与rnascope
tm
类似的配对探针设计(choi等人,同上,2018)。可应用本发明的方法的其他信号放大系统包括但不限于滚环扩增(larsson等人,nature methods 7(5):395
–
397(2010)；clampfish
(rouhanifard等人,biorxiv,222794(doi.org/10.1101/222794)(2018)；以及saber(kishi等人,nat.methods 16:533
–
544(2019))。
173.本发明的方法可用于标记单个细胞和/或组织切片中的多个基因靶标，具有与rnascope
tm
技术相同水平的灵敏度和特异性。它可与基于荧光的检测以及成像质谱流式细胞术一起使用(schulz等人,cell syst.6(1):25-36(2018))，用于检测组织微环境的空间背景下的大量生物标志物。所述方法可用于研究和诊断应用中。
174.在图1-3和6中，靶探针以“z”配置描绘，如例如在美国专利号7,709,198、美国公布2008/0038725和2009/0081688以及wo 2007/001986和wo 2007/002006中所描述。图1-3和6中所示的z配置具有在靶探针的前置扩增子(图3a和6a)或前置前置扩增子(图3b、3c、6b和6c)结合位点5'的靶结合位点。可理解，如图1-3和6中描绘的这种配置仅仅是示例性的，并且取向可以是相反的，即靶结合位点可以在前置扩增子或前置前置扩增子结合位点的3'。应当理解，靶探针对可独立地处于任一取向，即，靶探针对中的一个成员可具有在前置扩增子或前置前置扩增子结合位点的5'或3'的靶结合位点，并且可与第二探针配对，所述第二探针具有在前置扩增子或前置前置扩增子的5'或3'的结合位点。
175.如本文所用，术语“标记探针”是指直接或间接，通常间接地结合靶分子并允许靶标被检测的实体。标记探针(或“lp”)含有通常为单链多核苷酸或寡核苷酸的核酸结合部分，其包含一个或多个直接或间接提供可检测信号的标记。标记可以与多核苷酸共价连接，或者多核苷酸可以被配置成与标记结合。例如，生物素化的多核苷酸可以结合与链霉亲和素结合的标记。标记探针可例如与靶核酸直接杂交。通常，标记探针可与核酸杂交，所述核酸又与靶核酸杂交或与一种或多种与靶核酸杂交的其他核酸杂交。因此，标记探针可包含与靶核酸的多核苷酸序列，特别是一部分互补的多核苷酸序列。或者，标记探针可包含至少一个与本文所述的扩增子、前置扩增子、前置前置扩增子、信号产生复合物(sgc)等中的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。通常，在本发明的实施方案中，标记探针与扩增子结合。如本文所用，包含酶标记的标记探针是指包含核酸结合部分如寡核苷酸和与核酸结合部分偶联的酶的标记探针。如本文所公开的，酶与核酸结合部分的偶联可以是共价的或通过高亲和力结合相互作用，如生物素/抗生物素蛋白或其他类似的高亲和力结合分子。
176.如本文所用，“靶探针”是能够与靶核酸杂交并捕获或结合标记探针或信号产生复合物(sgc)组分(例如扩增子，前置扩增子或前置前置扩增子)至所述靶核酸的多核苷酸。靶探针可与标记探针直接杂交，或其可与一种或多种核酸杂交，所述核酸又与标记探针杂交；例如，靶探针可与sgc中的扩增子，前置扩增子或前置前置扩增子杂交。因此，靶探针包括与靶核酸的多核苷酸序列互补的第一多核苷酸序列和与标记探针、扩增子、前置扩增子、前置前置扩增子等的多核苷酸序列互补的第二多核苷酸序列。通常，在本发明的实施方案中，靶探针结合至前置扩增子，如图3a和6a所示，或结合至前置前置扩增子，如图3b、3c、6b和6c所示。靶探针通常是单链的，使得互补序列可用于与相应的靶核酸、标记探针、扩增子、前置扩增子或前置前置扩增子杂交。在本发明的实施方案中，靶探针成对提供。
177.如本文所用，“扩增子”是能够与多个标记探针杂交的分子，通常是多核苷酸。通常，扩增子与多个相同的标记探针杂交。扩增子还可与靶核酸杂交，与一对靶探针中的至少一个靶探针杂交，与一对靶探针中的两个靶探针杂交，或与结合靶探针的核酸杂交，如扩增子、前置扩增子或前置前置扩增子。例如，扩增子可与至少一个靶探针和多个标记探针杂
交，或与前置扩增子和多个标记探针杂交。通常，在本发明的实施方案中，扩增子可以与前置扩增子杂交。扩增子可以是例如线性、叉状、梳状或分支核酸。如本文对所有多核苷酸所述，扩增子可包括修饰的核苷酸和/或非标准核苷酸间连接以及标准脱氧核糖核苷酸，核糖核苷酸和/或磷酸二酯键。例如，在美国专利号5,635,352、5,124,246、5,710,264、5,849,481和7,709,198以及美国公开案2008/0038725和2009/0081688中描述了合适的扩增子，所述专利中的每一个以引用的方式并入。通常，在本发明的实施方案中，扩增子结合至前置扩增子和标记探针(参见图3和6)。
178.如本文所用，“前置扩增子”是用作一个或多个靶探针与一个或多个扩增子之间的中间结合组分的分子，通常是多核苷酸。通常，前置扩增子同时与一个或多个靶探针和多个扩增子杂交。例如在美国专利号5,635,352、5,681,697和7,709,198以及美国公开案2008/0038725、2009/0081688和2017/0101672中描述了示例性前置扩增子，其各自以引用的方式并入。通常，在本发明的实施方案中，前置扩增子结合至靶探针对的两个成员(参见图3a和6a)，结合至可结合至靶探针对的前置前置扩增子(图3b和6b)，或者结合至可结合至靶探针对的前置前置扩增子对的两个成员(参见图3c和6c)。前置扩增子也结合至扩增子(参见图3和6)。
179.如本文所用，“前置前置扩增子”是用作一个或多个靶探针与一个或多个前置扩增子之间的中间结合组分的分子，通常是多核苷酸。通常，前置前置扩增子同时与一个或多个靶探针和多个前置扩增子杂交。例如，在2017/0101672中描述了示例性前置前置扩增子，其以引用的方式并入本文。通常，在本发明的实施方案中，前置前置扩增子结合至靶探针对(参见图3b和6b)或者结合至靶探针对的成员(参见图3c和6c)和结合至前置扩增子。
180.如本文所用，术语“多个”应理解为意指两个或更多个。因此，多个可以指例如2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多、11个或更多、12个或更多、13个或更多、14个或更多、15个或更多、16个或更多、17个或更多、18个或更多、19个或更多、20个或更多、21个或更多、22个或更多、23个或更多、24个或更多、25个或更多、26个或更多、27个或更多、28个或更多、29个或更多、30个或更多、31个或更多、32个或更多、33个或更多、34个或更多、35个或更多、36个或更多、37个或更多、38个或更多、39个或更多、40个或更多、41个或更多、42个或更多、43个或更多、44个或更多、45个或更多、46个或更多、47个或更多、48个或更多、49个或更多、50个或更多、55个或更多、60个或更多、65个或更多、70个或更多、75个或更多、80个或更多、85个或更多、90个或更多、95个或更多、100个或更多、110个或更多、120个或更多、130个或更多、140个或更多、150个或更多、160个或更多、170个或更多、180个或更多、190个或更多、200个或更多、300个或更多、400个或更多、500个或更多、600个或更多、700个或更多、800个或更多、900个或更多、或1000个或更多、或甚至更大的数量，如果需要用于特定用途。
181.如本文所述，本发明涉及靶核酸的多路复用检测，其中所述方法提供比先前所述的原位杂交方法更高数目的靶核酸的检测。图1描绘了示例性实施方案，其中描绘了十二种靶核酸的检测。特别地，所述方法可采用正交扩增系统以在迭代检测轮次中清楚地检测多种靶核酸。
182.如图2所示，在一个实施方案中，本发明的方法采用多种靶核酸的靶探针的同时杂交和用于检测所述靶核酸的扩增系统。然而，不是一次检测所有靶核酸，而是在迭代轮次中
进行靶核酸的标记和检测，其中在第一轮中仅检测靶探针所结合的靶核酸亚组。这在图2中示意性地描述为第一轮中靶标1-4的检测。在第一轮中对与靶核酸(图2中的靶标1-4)结合的可检测标记进行成像后，通过使用可裂解标记(图2中的“荧光团裂解”)从样品中除去标记。一旦在第一轮中与靶核酸结合的标记已被裂解，则通过添加第二组标记来应用第二轮检测，所述第二组标记通常检测不同的靶核酸亚组(在图2中描绘为靶标5-8)。通过从靶核酸裂解第一轮标记，可在第二轮中使用与第一轮中相同的可检测标记(在图2中描绘为荧光团)。这种裂解与靶核酸结合的标记并添加标记以检测新的靶核酸亚组的循环允许在相同样品和相同细胞中检测比先前描述的方法多得多的核酸靶标。
183.本发明的方法利用i(i＝2，3，4，...)靶标的l(l＝1，2，3，
…
)轮(在图2中标记为“n个循环”)迭代荧光标记，随后进行标记的成像和裂解，在图2中显示为荧光团裂解。迭代检测方法提供来自单轮杂交和扩增步骤的l x i个不同靶序列(n)的同时可视化。“n”表示待检测的靶标总数，并且上述“i”表示在l轮的每一轮中每次迭代的靶标数量。通常，每轮标记迭代中的靶标(i)的数量将是2个或更多、3个或更多个、4个或更多个，等等直到可在单轮中清楚地标记和检测到所述数量，如本文所公开。如果需要，可在一轮中检测单一靶核酸(i＝1)。在一些实施方案中，i中靶标的数量在每一轮中可不同。例如，在三轮检测中，其中i在每一相应轮中是4、4和1，将检测到总计9个靶标。因此，靶标的数量n＝总和(i1，i2，i3...il)，其中i1、i2、i3是每个迭代轮次中检测到的靶标的数量，其可相同或不同，并且l是轮次总数。在每一轮中数字“i”相同的情况下，n＝lxi。
184.通常，当使用不同的和可区分的标记用于靶核酸的多路复用检测时，对可并行区分的不同标记的数目存在限制。例如，在荧光标记的情况下，为了同时检测多个标记，应该对荧光团的发射进行光谱分离，以便荧光显微镜可以并行区分荧光团。需要对荧光团的发射进行分离光谱，这限制了可以同时可视化的荧光团的数量。本发明通过迭代地检测标记来避免这种限制，使得相同的荧光团可用于连续轮次以检测不同的靶核酸。
185.可用于本发明方法中的检测系统的正交性质在图3中描绘。图3a示出本发明的一个实施方案，其利用三种示例性靶核酸和相应的正交检测系统，在本文中也称为信号生成复合物(sgc)。如图3a所示，每种靶核酸与特异性靶探针对(tp1a和tp1b，tp2a和tp2b，tp3a和tp3b)杂交，再与相应特异性前置扩增子(pa1，pa2，pa3)杂交，再与相应特异性多个扩增子(amp1，amp2，amp3)杂交，再与相应特异性多个标记探针(lp1，lp2，lp3)杂交。图3b示出本发明的另一个实施方案，其利用两种示例性靶核酸和相应的正交检测系统。如图3b所示，每种靶核酸与特异性靶探针对(tp1a和tp1b，tp2a和tp2b)杂交，再与相应的特异性前置前置扩增子(ppa1，ppa2)杂交，再与相应的特异性多个前置扩增子(pa1，pa2)杂交，再与相应的特异性多个扩增子(amp1，amp2)杂交，再与相应的特异性多个标记探针(lp1，lp2)杂交。图3c示出本发明的另一个实施方案，其利用两种示例性靶核酸和相应的正交检测系统。如图3c所示，每种靶核酸与特异性靶探针对(tp1a和tp1b，tp2a和tp2b)杂交，再与相应特异性前置前置扩增子对(ppa1a和ppa1b，ppa2a和ppa2b)杂交，再与相应特异性前置扩增子(pa1和pa2)杂交，再与相应特异性扩增子(amp1和amp2)杂交，再与相应特异性标记探针(lp1和lp2)杂交。为简单起见，描述了多个扩增子与前置扩增子中的一个结合，但应了解，扩增子可结合至前置扩增子中的每一个。如图3所示，每个核酸靶标具有特异性检测系统，其组分的结合由独特的结合位点介导，所述独特结合位点提供与一种特异性复合物的结合而不提
供与另一种的结合。用于sgc组分与特定靶核酸杂交的这种独特结合位点可以通过设计结合位点(核酸序列)以提供所需的特异性来实现，如本领域所熟知的和本文所描述的。其中每个靶标被独特标记的这种正交检测系统允许检测同一样品中的多种靶核酸。
186.因此，本发明涉及使用多个核酸靶标的独特标记和靶核酸亚组的迭代检测以实现靶核酸的更高多路复用检测。如实施例中所述，本文已经证明了本发明的方法用于在迭代轮次中进行靶核酸的多路复用检测的有效性。
187.在一些实施方案中，在每一轮中检测单一靶核酸。在这种情况下，不是使样品与针对多种靶核酸的多个靶探针组接触，而是使样品与能够与靶核酸特异性地杂交的靶探针组接触。
188.本发明是基于利用正交扩增系统来独特地标记靶核酸，使得可在同一样品中且甚至在同一细胞中分析多种靶核酸。本发明利用对特定靶核酸具有特异性的信号产生复合物(sgc)的构建，使得每个靶核酸可以被独特地鉴定。在一个实施方案中，使样品与包含可与靶核酸特异性杂交的一对靶探针的靶探针组接触。还使样品与前置扩增子组接触，所述前置扩增子组包括对每个靶探针组具有特异性的前置扩增子，并且可与和相应靶核酸杂交的靶探针对杂交。这种实施方案在图3a中示意性地示出。还使样品与扩增子接触，其中扩增子包括对每个前置扩增子具有特异性的扩增子亚组，所述前置扩增子对靶探针对具有特异性，所述靶探针对对靶核酸具有特异性。因此，每种靶核酸具有提供靶核酸之间的区别的sgc的独特组分，靶探针对、前置扩增子和扩增子的组装。在另一个实施方案中，前置前置扩增子可作为靶探针对与前置扩增子之间的额外扩增层结合至靶探针对(参见图3b和6b)。
189.在另一个实施方案中，将样品与包含可与靶核酸特异性杂交的一对靶探针的靶探针组接触。还使样品与前置前置扩增子组接触，所述前置前置扩增子组包括对每个靶探针组具有特异性的一对前置前置扩增子，并且可与和相应靶核酸杂交的靶探针对杂交。这种实施方案在图3c中示意性地示出。还使样品与前置扩增子组接触，所述前置扩增子组包括可特异性地结合至两对前置前置扩增子的前置扩增子，所述前置前置扩增子对靶探针对具有特异性，所述靶探针对对靶核酸具有特异性。还使样品与扩增子接触，其中扩增子包括对每个前置扩增子具有特异性的扩增子亚组，所述前置扩增子对前置前置扩增子对具有特异性，所述前置前置扩增子对对靶探针对具有特异性，所述靶探针对对靶核酸具有特异性。因此，每个靶核酸具有提供靶核酸之间区别的sgc的独特组分，靶探针对、前置前置扩增子、前置扩增子和扩增子的组装。
190.为了检测靶核酸，将标记探针组与样品接触。不是将样品与可检测所有靶核酸的标记探针接触，而是将样品与一组可检测靶核酸亚组的标记探针接触。因此，不是一次检测所有靶核酸，而是在迭代的检测轮次中检测靶核酸。在一个轮次中，对相应靶核酸具有特异性的标记探针可彼此区分，使得与第一轮次的施加的标记探针相关的所有靶核酸可被并行检测到。
191.可在单个轮次中并行检测到的靶核酸的数目将取决于标记探针中使用的标记的类型和如何区分这些标记。例如，在使用荧光标记的情况下，在单个轮次中使用的荧光团需要是可区分的，因此应该对荧光团的发射进行光谱分离。根据检测系统和可用于区分具有重叠发射的荧光团的滤波器和/或软件的可用性，可并行区分的荧光团的数量高达10个，如果它们可被区分，则认为它们具有光谱分离，这是本领域公知的。用于检测多个荧光标记的
成像系统是本领域公知的(例如，vectra polaris、perkin elmer、waltham ma)。
192.在一个实施方案中，本发明的方法用于每轮检测一种或多种靶核酸，例如，在每轮中检测到1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种靶核酸。如本文所公开，本领域技术人员可选择合适的不同标记和合适的检测轮数以允许检测样品中所需数目的靶核酸。
193.为了在后续轮次中利用在第一轮检测中使用的标记的可区分特征，在一些实施方案中，标记探针上的标记是可裂解的。因此，一旦对靶核酸亚组进行了第一轮检测，连接至靶核酸的标记就被裂解以从所述第一靶核酸亚组中除去所述标记。标记与标记探针的示例性可裂解缀合物在本文中描述。一旦标记被裂解，就通过使所述样品与第二标记探针组接触来进行第二轮检测，所述第二标记探针组通常对与第一轮中检测到的靶核酸不同的靶核酸具有特异性。由于第一轮的标记已从相应的靶核酸裂解，因此现在可在第二轮检测的标记探针中使用相同的可区分标记。应该理解，虽然可在靶核酸亚组的迭代轮次检测中使用相同的标记，但不要求在连续检测轮次中使用相同的标记，只要在同一轮中使用的标记是可区分的即可。
194.一旦进行了靶核酸亚组的第二轮检测，任选地就可对样品应用额外一轮或多轮的裂解、标记和检测。例如，在检测第二靶核酸亚组之后，标记可从组装在第二靶核酸亚组上的sgc裂解，并且可进行第三轮标记和检测以检测与第一和第二靶核酸亚组不同的第三靶核酸亚组。可进行靶核酸的这种迭代轮次检测以使用所需数目的检测迭代来检测所需数量的多种靶核酸。应当理解，在最后一轮迭代检测中，标记探针没有必要包含可裂解的标记，因为不再进行更多轮检测。因此，在最后一轮迭代检测中，任选使用包含可裂解标记的标记探针，即所述标记探针可包含或可以不包含可裂解标记。通常进行多轮检测，以使得在每一轮中检测不同的靶核酸。然而，应理解，在一些实施方案中，后续轮次检测可包括检测与先前轮次重叠的靶核酸，只要在每个连续轮次中检测到的靶核酸亚组彼此不同。在另一个实施方案中，如果需要，可对相同靶核酸进行连续轮次的检测。因此，在一些实施方案中，可在一个或多个连续轮次中检测相同的靶核酸或重叠的靶核酸。当在每一轮中以预定的颜色序列检测相同靶核酸时，在连续轮次中对相同靶核酸或重叠靶核酸的这种检测可用于生成每种靶核酸的时间条形码。此类方法先前已被描述为例如序列条形码化荧光原位杂交(seqfish)(参见shah等人,neuron 92(2):342-357(2016))。
195.本发明的方法应用于靶核酸的多路复用检测。如本文所公开的，本发明的方法在靶核酸亚组的迭代检测轮次中进行。如本文还公开的，在一轮中可检测到的靶核酸的数量取决于所使用的标记探针的类型以及在同时检测时区分对不同靶核酸具有特异性的标记探针的能力。通过迭代检测轮次实现更高水平的多路复用。例如，在图2所描绘的示例性实施方案中，一轮标记和检测提供四种靶核酸的检测，第二轮标记和检测提供八种靶核酸的检测，并且第三轮标记和检测提供十二种靶核酸的检测。本领域技术人员可容易地确定在本发明的测定中检测的靶核酸的所需数量。在一些实施方案中，在本发明的方法中使用两轮标记和检测。在一些实施方案中，使用三轮标记和检测。在一些实施方案中，可使用4、5、6、7、8、9或10轮或更多轮标记和检测，只要有足够数量的sgc可用于唯一地标记和检测每种靶核酸，并且sgc在测定条件期间保持与靶核酸充分结合以检测所述靶核酸。本领域技术人员可容易地确定可应用于本发明方法中的标记和检测轮次的数量，其中可在每一轮中检测靶核酸。
196.当对样品应用后续轮次检测时，随后获得的靶核酸的检测可与先前检测轮次的靶核酸检测配准，使得可在同一样品中，并且甚至在同一细胞中测定所有检测到的靶核酸的表达(参见图2)。靶核酸检测轮次的配准可通过使用图像分析软件将不同轮次中检测到的靶核酸图像进行叠加来实现。用于对齐和叠加多个图像的这种配准算法在本领域中是众所周知的，例如，尺度不变特征变换(sift)算法(lowe"distinctive image features from scale-invariant keypoints",internat.j.computer vision 60(2):91-110(2004))。本质上，这些算法将输入图像与参考图像进行比较，以生成变换矩阵来将移位和旋转考虑在内。例如，在imagej中存在可自动执行此任务的工具(imagej.net/registration)(schneider等人,nature methods 9(7):671-675(2012)；schindelin等人,mol.reprod.dev.82(7-8):518-529(2015))。
197.通过使用相同的sgc组件，但使用针对不同靶核酸的不同靶探针组，可实现额外的多路复用。在这种情况下，在用在靶核酸亚组的迭代标记轮次中检测到的sgc复合物检测初始靶核酸组后，可使用适当的条件从靶核酸中除去sgc复合物以使sgc与靶核酸的杂交变性。一旦已从样品中除去sgc复合物，就可将相同的前置扩增子/扩增子/标记探针或前置前置扩增子/前置扩增子/扩增子/标记探针与被设计为对与在第一轮sgc检测中检测到的靶核酸组不同的靶核酸组具有特异性的靶探针组一起使用。以这种方式，可实现对额外靶核酸的检测。
198.在又另一个实施方案中，本发明的方法可用于同时检测双链核酸和单链核酸，例如检测同一样品中的dna和rna。在这种情况下，可以设计探针以检测单链核酸，例如rna(参见，例如，美国专利号7,709,198、美国公开2008/0038725和2009/0081688，和2017/0101672)和双链核酸，使得可以在同一样品中检测双链核酸和单链核酸，例如dna和rna。
199.在本发明的一些实施方案中，对靶核酸具有特异性的每个靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。在这种情况下，对靶核酸具有特异性的靶探针组中的靶探针对与靶核酸的不同和非重叠序列结合。当使用具有两对或更多对可与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针的靶探针组时，结合至靶探针对的分子，无论是前置扩增子(参见图1、3a和6a)，还是前置前置扩增子(参见图3b、3c、6b和6c)，对于相同靶探针组中的靶探针对通常是相同的(参见图1，其示出与用于相同靶标的多个靶探针对结合的相同前置前置扩增子)。因此，结合至相同靶核酸的靶探针对可被设计成包含用于sgc中结合至靶探针对的分子(即前置扩增子或前置前置扩增子)的相同结合位点。这样的实施方案在图1中举例说明，其示意性地示出与相应靶核酸结合的四个靶探针对并且描绘与靶核酸结合的大于四的数目(由“...”表示)。使用多个靶探针对检测靶核酸提供了与多个sgc在相同靶核酸上的组装相关的更高信号。在一些实施方案中，用于结合相同靶核酸的靶探针对的数目为每个靶标1-10、1-20、1-30、1-40、1-50、1-60、1-70、1-80、1-90、1-100、1-110、1-120、1-130、1-140、1-150、1-160、1-170、1-180、1-190或1-200对，或更大数目的对，或其间的任何整数数目的对，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、
120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200等。
200.本发明的方法可用于实现所需靶核酸的检测。在一个实施方案中，用多个靶探针对检测靶核酸。在这种情况下，靶探针对被设计成结合靶核酸的多于一个区域以允许多个sgc组装到靶核酸上。应当理解，如果多个靶探针对用于结合相同的靶核酸，则一个靶探针对的靶结合位点不与另一个靶探针对的靶结合位点重叠。
201.在本发明的实施方案中，通过本发明的方法检测的靶核酸可以是存在于细胞样品中的任何核酸，包括但不限于rna，包括信使rna(mrna)、微小rna(mirna)、核糖体rna(rrna)、线粒体rna、非编码rna等，或dna等。在一个特定实施方案中，核酸是rna。在用于核酸多路复用检测的本发明方法中，应当理解，靶核酸可以独立地是dna或rna。换句话说，待检测的靶核酸可以是但不一定是相同类型的核酸。因此，在本发明的测定中待检测的靶核酸可以是dna和rna。在靶核酸是rna的情况下，应理解，靶核酸可独立地选自由组成的组：信使rna(mrna)、微小rna(mirna)、核糖体rna(rrna)、线粒体rna和非编码rna。因此，靶核酸可以独立地是dna或任何类型的rna。
202.如本文所述，本发明的方法总体上涉及靶核酸的原位检测。用于核酸的原位检测的方法是本领域技术人员熟知的(参见例如us 2008/0038725；us 2009/0081688；hicks等人,j.mol.histol.35:595-601(2004))。如本文所用，“原位杂交”或“ish”是指使用直接或间接标记的互补dna或rna链(例如探针)(原位)结合并定位样品(特别是组织或细胞的一部分或切片)中的特定核酸(例如dna或rna)的杂交类型。探针类型可以是双链dna(dsdna)、单链dna(ssdna)、单链互补rna(sscrna)、信使rna(mrna)、微小rna(mirna)、核糖体rna、线粒体rna和/或合成的寡核苷酸。术语“荧光原位杂交”或“fish”是指利用荧光标记的ish类型。术语“发色原位杂交”或“cish”是指具有发色标记的ish类型。ish，fish和cish方法是本领域技术人员熟知的(参见例如stoler,clinics in laboratory medicine 10(1):215-236(1990)；in situ hybridization.a practical approach,wilkinson,编,irl press,oxford(1992)；schwarzacher和heslop-harrison,practical in situ hybridization,bios scientific publishers ltd,oxford(2000))。
203.对于用于原位检测细胞中核酸靶的本发明的方法，包括但不限于原位杂交或流式细胞术，任选地在靶探针杂交之前固定和/或透化细胞。将细胞固定和透化可促进核酸靶保留在细胞中并允许靶探针、标记探针、扩增子、前置扩增子、前置前置扩增子等进入细胞并到达靶核酸分子。任选地洗涤细胞以除去未被捕获到核酸靶上的物质。细胞可以在多个步骤中任一个之后洗涤，例如，在靶探针与核酸靶杂交以除去未结合的靶探针之后，在前置前置扩增子、前置扩增子、扩增子和/或标记探针与靶探针杂交之后，等等。用于固定和透化细胞以原位检测核酸的方法，以及用于杂交、洗涤和检测靶核酸的方法也是本领域公知的(参见例如us 2008/0038725；us 2009/0081688；hicks等人,j.mol.histol.35:595-601(2004)；stoler,clinics in laboratory medicine 10(1):215-236(1990)；in situ hybridization.a practical approach,wilkinson,编,irl press,oxford(1992)；
schwarzacher和heslop-harrison,practical in situ hybridization,bios scientific publishers ltd,oxford(2000)；shapiro,practical flow cytometry第3版,wiley-liss,new york(1995)；ormerod,flow cytometry,第2版,springer(1999))。示例性固定剂包括但不限于醛(甲醛、戊二醛等)、丙酮、醇(甲醇、乙醇等)。示例性透化剂包括但不限于醇(甲醇、乙醇等)、酸(冰醋酸等)、去污剂(triton、np-40、tween
tm 20等)、皂苷、洋地黄皂苷、leucoperm
tm
(biorad,hercules,ca)和酶(例如溶菌酶、脂肪酶、蛋白酶和肽酶)。透化也可以通过机械破裂发生，例如在组织切片中。
204.对于双链核酸的原位检测，通常处理样品以使样品中的双链核酸变性，以使靶探针通过杂交与靶双链核酸的链结合。使双链核酸变性的条件是本领域熟知的，包括热和化学变性，例如用碱(naoh)、甲酰胺、二甲亚砜等(参见wang等人,environ.health toxicol.29:e2014007(doi:10.5620/eht.2014.29.e2014007)2014；sambrook等人,molecular cloning:a laboratory manual,第三版,cold spring harbor laboratory,new york(2001)；ausubel等人,current protocols in molecular biology,john wiley and sons,baltimore,md(1999))。例如，naoh、lioh或koh或其他高ph缓冲液(ph》11)可用于使双链核酸如dna变性。另外，热和化学变性方法可以组合使用。
205.这种原位检测方法可用于固定在载玻片上的组织样本，用于悬浮液中的单细胞，例如从血样中分离的外周血单核细胞(pbmc)等。组织样本包括例如组织活检样品。血样包括例如为诊断目的而采集的血样。在血样的情况下，可以直接分析血液，例如在血涂片中，或者可以处理血液，例如裂解红细胞，分离pbmc或白细胞，分离靶细胞等，使得通过本发明方法分析的样品中的细胞在血样中或来源于血样。类似地，可处理组织样本，例如，切碎并物理或酶处理组织样本以将组织破碎成单个细胞或细胞簇。另外，如果需要，可处理细胞样品以分离细胞或破坏细胞簇。因此，可以使用本领域公知的方法获得和处理组织、血液和细胞样品。本发明的方法可用于诊断应用以基于作为指示病理的生物标记的核酸靶的存在或不存在来鉴定病理细胞的存在或不存在。
206.本领域技术人员应理解，许多合适的样品中的任一种可用于使用本发明的方法检测靶核酸。用于本发明方法的样品通常是生物样品或组织样品。这样的样品可以从生物受试者获得，包括生物组织或流体来源的样品，其收集自个体或生物材料的一些其他来源，例如活检、尸检或法医材料。生物样品还包括来自含有或疑似含有癌前或癌细胞或组织的生物受试者区域的样品，例如组织活检，包括细针抽吸物、血液样品或细胞学样本。这样的样品可以是，但不限于，从生物体如哺乳动物分离的器官、组织、组织级分和/或细胞。示例性生物样品包括但不限于细胞培养物，包括原代细胞培养物、细胞系、组织、器官、细胞器、生物流体等。另外的生物样品包括但不限于皮肤样品、组织活检(包括细针抽吸物)、细胞样品、粪便、体液(包括血液和/或血清样品)、唾液、精液等。这些样品可用于医学或兽医诊断目的。样品也可以从其他来源获得，例如食物、土壤、物体表面等，以及需要检测靶核酸的其他材料。因此，本发明的方法可用于从得自个体或其他来源的生物样品中检测一种或多种病原体，如病毒、细菌、真菌、单细胞生物体如寄生虫等。
207.用于通过本发明的方法分析的细胞样品的收集是本领域公知的(参见例如，dey,“cytology sample procurement,fixation and processing”in basic and advanced laboratory techniques in histopathology and cytology第121-132页,springer,
singapore(2018)；“non-gynocological cytology practice guideline”american society of cytopathology,asc执行委员会于2004年3月2日通过)。处理用于分析宫颈组织的样品(包括组织活检和细胞样品)的方法是本领域公知的(参见例如，cecil textbook of medicine,bennett和plum,编,第20版,wb saunders,philadelphia(1996)；colposcopy and treatment of cervical intraepithelial neoplasia:a beginner’s manual,sellors和sankaranarayanan,编,international agency for research on cancer,lyon,france(2003)；kalaf和cooper,j.clin.pathol.60:449-455(2007)；brown和trimble,best pract.res.clin.obstet.gynaecol.26:233-242(2012)；waxman等人,obstet.gynecol.120:1465-1471(2012)；cervical cytology practice guidelines toc,美国细胞病理学会(asc)执行委员会批准，2000年11月10日))。在一个实施方案中，细胞样品是宫颈样品，例如巴氏涂片。在一个实施方案中，样品是细针抽吸物。
208.在本发明的特定实施方案中，样品是组织样本或来源于组织样本。在本发明的其他特定实施方案中，样品是血液样品或来源于血液样品。在本发明的另其他特定实施方案中，样品是细胞样品或来源于细胞样品。
209.本发明基于在靶核酸之间构建复合物以用可检测标记来标记靶核酸。这种复合物有时被称为信号生成复合物(sgc；参见例如us20170101672)。这种复合物或sgc通过构建允许大量标记连接到靶核酸的分子层来实现。
210.本发明的方法可以使用信号生成复合物(sgc)，其中sgc包含多个分子而不是单个分子。这种sgc特别适用于放大可检测信号，提供对靶核酸的更高敏感性检测。此类用于放大信号的方法描述于例如美国专利号5,635,352、5,124,246、5,710,264、5,849,481和7,709,198，以及美国公开案2008/0038725和2009/0081688，以及wo 2007/001986和wo 2012/054795中，其各自通过引用并入本文。sgc的生成是rnascope
tm
测定的原理(参见美国专利号7,709,198、8,658,361和9,315,854，美国公开案2008/0038725、2009/0081688和2016/0201117，以及wo 2007/001986和wo 2012/054795，其各自通过引用并入本文)。
211.基本信号生成复合物(sgc)在图6a中示出(也参见us2009/0081688，其通过引用并入本文)。图6中描绘为一对“z”的一对靶探针与标记为“靶标”的互补分子序列杂交。每个靶探针含有与前置扩增子分子(pa)互补的另一序列，其必须同时与靶探针对的两个成员杂交以便稳定结合。前置扩增子分子由两个结构域组成：一个结构域具有与每个靶探针杂交的区域，并且一个结构域含有一系列核苷酸序列重复，每个与扩增子分子(amp)上的序列互补。此序列的多个重复的存在允许多个扩增子分子与一个前置扩增子杂交，这增加了整体信号放大。每个扩增子分子由两个结构域组成，一个结构域具有与前置扩增子杂交的区域，并且一个结构域含有一系列核苷酸序列重复，每个与标记探针(lp)上的序列互补，从而允许多个标记探针与每个扩增子分子杂交，这进一步增加了整体信号放大。每个标记探针含有两种组分。一种组分由与扩增子分子上的重复序列互补以允许标记探针杂交的核苷酸序列组成。此核苷酸序列与第二组分连接，所述第二组分可以是任何信号生成实体，包括用于直接可视化的荧光或发色标记，可直接检测的金属同位素，或能够促进化学反应产生荧光、发色或其他可检测信号的酶或其他化学品，如本文所述。在图6a中，标记探针被描绘为代表核酸组分的线和代表信号生成组分的星号。从靶探针到标记探针的组装一起被称为信号生成复合物(sgc)。
212.图6b示出通过添加扩增分子层(在这种情况下为前置前置扩增子分子(ppa))而放大的sgc。ppa结合一个结构域中的靶探针和另一个结构域中的多个前置扩增子(pa)。
213.图6c示出在前置扩增子水平上使用协同杂交的不同sgc结构(参见us 2017/0101672，其以引用的方式并入本文)。与图6a和6b中形成的sgc类似，一对靶探针与靶分子序列杂交。每个靶探针含有与独特的前置前置扩增子分子(ppa-1；ppa-2)互补的另一序列。使用两个独立的分子建立了需要协同杂交的基础。每个前置前置扩增子分子由两个结构域组成，一个结构域具有与靶探针中一个杂交的区域，并且一个结构域含有一系列核苷酸序列重复，每个包含与前置扩增子分子(pa)内的序列互补的序列，以及促进ppa-pa结合效率的间隔区序列。为了稳定地连接到生长的sgc上，每个pa必须同时与两个ppa分子杂交。每个前置扩增子分子由两个结构域组成，一个结构域含有与两个前置前置扩增子互补以允许杂交的序列，并且一个结构域含有一系列核苷酸序列重复，每个与扩增子分子(amp)上的序列互补。扩增子杂交序列的多个重复允许多个扩增子分子与每个前置扩增子杂交，进一步增加信号放大。为了简化说明，扩增子分子被示为与一个前置扩增子分子杂交，但是应当理解，扩增子可以与每个前置扩增子结合。每个扩增子分子含有与标记探针(lp)内的序列互补的一系列核苷酸序列重复，从而允许几个标记探针与每个扩增子分子杂交。每个标记探针包含信号生成元件以提供信号检测。
214.如上所述，无论使用图3a、3b、6a或6b所示的配置，还是图3c和6c所示的配置，设计sgc的组分使得需要结合两个靶探针以构建sgc。在图3a、3b、6a或6b的配置的情况下，前置扩增子(或图3b和6b中的前置前置扩增子)必须结合至靶探针对的两个成员以发生稳定结合。这通过设计靶探针和前置扩增子(或前置前置扩增子)之间的结合位点来实现，使得两个靶探针与前置扩增子(或前置前置扩增子)的结合具有比单个靶探针与前置扩增子(或前置前置扩增子)的结合更高的解链温度(tm)，并且其中单个靶探针的结合在测定条件下是不稳定的。此设计先前已描述于例如美国专利号7,709,198、美国公开2008/0038725和2009/0081688、wo 2007/001986 wo 2007/002006，wang等人，同上，2012，anderson等人，同上，2016)中。通过以这种方式配置sgc组分，当两个靶探针都结合至靶核酸和前置扩增子时实现了sgc的组装，从而由于最小化作为假阳性的sgc的组装而降低了背景噪声。
215.在图3c和6c的配置的情况下，仅在靶探针对的两个成员都结合至靶核酸时才形成sgc的要求是通过要求前置扩增子结合至两个前置前置扩增子来实现的，这两个前置前置扩增子又分别结合至靶探针对的两个成员。此要求通过以下来实现：设计前置前置扩增子和前置扩增子之间的结合位点，使得两个前置前置扩增子与前置扩增子的结合之间的解链温度(tm)高于任一单独的前置前置扩增子的解链温度，并且其中一个前置前置扩增子与前置扩增子的结合在测定条件下是不稳定的。这种设计先前已经描述于例如us 20170101672、wo 2017/066211和baker等人，同上，2017)中。除非前置扩增子与两个前置前置扩增子结合，否则扩增子和标记探针不能组装成与靶核酸结合的sgc，从而由于最小化作为假阳性的sgc的组装而降低了背景噪声。
216.如本文所公开的，本发明的方法可基于构建与靶核酸结合的信号生成复合物(sgc)以检测细胞中靶核酸的存在。用于构建sgc的组分通常包含核酸，使得核酸杂交反应用于将sgc的组分结合至靶核酸。选择合适区域并设计与靶核酸结合的特异性和选择性试剂的方法，特别是与靶核酸或sgc的其他组分特异性和选择性结合的寡核苷酸或探针，是本
领域技术人员众所周知的(参见sambrook等人,molecular cloning:a laboratory manual,第三版,cold spring harbor laboratory,new york(2001)；ausubel等人,current protocols in molecular biology,john wiley and sons,baltimore,md(1999))。设计靶探针使得探针与靶核酸特异性杂交。可使用对靶核酸区域以及适当长度的结合剂如寡核苷酸或探针的适当选择来实现所需的特异性，并且这种选择方法是本领域技术人员众所周知的。本领域技术人员将容易理解并且可容易地确定合适的试剂，如寡核苷酸或探针，其可用于靶向一种特定靶核酸而不是另一种靶核酸或者而不是非靶核酸，或者提供与sgc组分的结合。因此，应理解“特异性地杂交”、“特异性地标记”和“特异性地结合”(或其语法变型)是指与靶核酸而不是非靶核酸(例如，不需要被靶向的另一种或多种靶核酸)的杂交、标记或结合。可通过使用对独特序列的适当选择，使得靶特异性sgc的给定组分(例如，靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子、扩增子、标记探针)将与相应的组分结合，使得靶特异性sgc与特异性靶标结合而不是与另一种靶核酸结合来实现靶特异性sgc的类似特异性(参见图3)。
217.如本文所述，本发明的实施方案包括使用靶探针对。在一对靶探针结合至同一前置扩增子(图3a和6a)或前置前置扩增子(图3b和6b)的情况下，可使用探针配置，有时称为“z”配置。这种配置及其用于增加敏感性和减少背景的优点例如在美国专利号7,709,198、美国公开2008/0038725和2009/0081688，以及wo 2007/001986和wo 2007/002006中进行了描述，其各自以引用的方式并入本文。美国专利号7,709,198和美国公开2008/0038725和2009/0081688另外描述了用于选择靶探针(例如靶探针对)的特征的细节，包括长度、取向、杂交条件等。本领域技术人员可以基于本文的教导和例如美国专利号7,709,198、美国公开2008/0038725和2009/0081688以及wo 2007/001986和wo 2007/002006中的教导容易地确定合适的配置。
218.如本文所述，靶探针对中的靶探针的靶结合位点可呈任何所需的取向和组合。例如，靶探针对的一个成员的靶结合位点相对于前置扩增子或前置前置扩增子结合位点可以是5
′
或3
′
，并且所述对的另一个成员可以独立地将靶结合位点相对于前置扩增子或前置前置扩增子结合位点定位于5
′
或3
′
。
219.在另一个实施方案中，用于检测靶核酸存在的sgc是基于sgc的一个或多个组分的协同杂交(参见us 20170101672和wo 2017/066211，其各自通过引用并入本文)。这种协同杂交在本文中也称为basescope
tm
。在协同杂交效应中，sgc的两个组分之间的结合通过两个结合位点介导，并且同时与两个位点结合的解链温度高于单独一个位点结合的解链温度(参见us 20170101672和wo 2017/066211)。协同杂交效应可通过如us 20170101672和wo 2017/066211中所述的靶探针组配置来增强。
220.本发明的方法和相关组合物可利用协同杂交来增加特异性并降低核酸靶的原位检测中的背景，其中复杂的生理化学环境和大量非靶分子的存在可产生高噪音。使用这种协同杂交方法，标记探针的结合仅在sgc与靶核酸结合时发生。如us 20170101672和wo 2017/066211中所述及其图1中所示，通过增加sgc的一个或多个组分中协同杂交的数目，可以容易地修改所述方法以提供所需的信噪比。
221.在另一个实施方案中，协同杂交可应用于sgc的各种组分。例如，如本文所述，sgc的组分之间的结合可以是稳定的反应，或者也如本文所述，结合可以被配置成需要协同杂
交。在这种情况下，设计用于协同杂交的结合组分，使得所述组分含有与另一组分结合的两个区段。
222.因此，用于检测靶核酸的方法可利用协同杂交用于检测系统中提供与靶核酸特异性结合的sgc的任一个或所有组分之间的结合反应。可以基于所需的测定条件、被测定的样品类型、所需的测定敏感性等选择应用协同杂交的组分的数目和哪些组分。协同杂交结合反应的任一种或组合可用于增加测定的敏感性和特异性。在本发明的实施方案中，协同杂交可以在前置前置扩增子和前置扩增子之间、在前置扩增子和扩增子之间、在扩增子和标记探针之间，或其组合(参见例如us 20170101672和wo 2017/066211)。
223.如本文所公开的，组分通常彼此直接结合。在含有核酸的组分的情况下，结合反应通常通过杂交进行。在杂交反应的情况下，组分之间的结合是直接的。如果需要，可以包括中间组分，使得一种组分与另一种组分的结合是间接的，例如，中间组分含有互补结合位点以桥接两个其他组分。
224.如本文所述，可选择各种组分的配置以提供所需的稳定或协同杂交结合反应(参见例如us 20170101672)。应理解，即使结合反应在本文中示例为稳定的或不稳定的反应，例如对于协同杂交，任何结合反应可根据需要进行修饰，只要检测到靶核酸。还应当理解，可以根据所用的测定和杂交条件改变和选择配置。通常，如果期望结合反应是稳定的，则组分之间的互补核酸序列的区段通常在10至50个核苷酸或更多的范围内，例如16至30个核苷酸，如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸或更多。如果期望结合反应相对不稳定，例如当使用协同杂交结合反应时，组分之间的互补核酸序列的区段通常在5至18个核苷酸的范围内，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个核苷酸。应当理解，对于稳定或不稳定杂交，核苷酸长度可以稍短或稍长，这取决于测定中使用的序列(例如gc含量)和条件。还应当理解，如本文所公开的，修饰的核苷酸如锁核酸(lna)或桥核酸(bna)可用于增加修饰碱基处的结合强度，从而允许减少结合区段的长度。因此，应理解，关于与其他核酸区段互补的核酸区段的长度，如果需要，可进一步减少本文所述的长度。本领域技术人员可以容易地确定合适的探针设计，包括长度、修饰核苷酸的存在等，以实现核酸组分之间所需的相互作用。
225.在设计包含互补序列的两个核酸序列之间的结合位点时，可以任选地设计互补序列以最大化解链温度的差异(dtm)。这可通过使用本领域已知的解链温度计算算法来完成(参见例如santalucia,proc.natl.acad.sci.u.s.a.95:1460
–
1465(1998))。此外，已知人工修饰的碱基如锁核酸(lna)或桥核酸(bna)和天然存在的2
′‑
o-甲基rna增强互补对之间的结合强度(petersen和wengel,trends biotechnol.21:74
–
81(2003)；majlessi等人,nucl.acids res.26:2224
–
2229(1998))。这些修饰的碱基可以根据需要策略性地引入到sgc组分之间的结合位点中。
226.一种方法是利用修饰的核苷酸(lna、bna或2
′‑
o-甲基rna)。因为每个修饰的碱基可以增加解链温度，所以两个核酸序列(即互补序列)之间的结合区的长度可以显著缩短。修饰的碱基与其补体的结合强度更强，并且解链温度的差异(dtm)增加。又另一个实施方案是在待杂交的核酸组分的互补序列中或在例如信号生成复合物(sgc)的两个核酸组分之间使用三个修饰碱基(例如三个lna，bna或2
′‑
o-甲基rna碱基，或两个或三个不同修饰碱基的
组合)。这样的组分可以是例如前置前置扩增子、前置扩增子、扩增子、标记探针或靶探针对。
227.修饰的碱基，如lna或bna，可用于sgc选定组分的区段中，特别是介导核酸组分之间结合的那些，这增加了碱基与其互补碱基的结合强度，使得互补区段的长度减少(参见例如petersen和wengel,trends biotechnol.21:74
–
81(2003)；美国专利号7,399,845)。扩展天然4字母表如人工扩展的遗传信息系统(aegis；yang等人,nucl.acids res.34(21):6095-6101(2006))的人工碱基可以掺入sgc的相互作用组分之间的结合位点中。这些人工碱基可增加相互作用组分的特异性，这又可允许较低严格性杂交反应产生较高信号。
228.关于靶探针对，可以将靶探针对设计成结合靶核酸的紧邻区段或在靶探针对的靶探针结合位点之间具有一至多个碱基的区段上。通常，靶探针对被设计成结合靶核酸，使得在靶核酸上的结合位点之间通常存在0至500个碱基，例如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480或500个碱基，或其间的任何整数长度。在特定的实施方案中，靶探针对的结合位点为0-100、0-200、或0-300个碱基，或其间的任何整数长度。在靶探针组中使用多于一个靶探针对以结合相同靶核酸(rna或单链dna)的情况下，并且在一对靶探针之间的结合位点中存在间隙的情况下，应理解不同靶探针对的结合位点不重叠。在检测双链核酸如dna的情况下，不同靶探针对之间可发生一些重叠，只要靶探针对能够并行地结合双链靶核酸的相应结合位点。
229.sgc还包含多个标记探针(lp)。每个lp包括可检测的区段。可检测组分可直接连接至lp，或者lp可与包含可检测组分(即标记)的另一种核酸杂交。如本文所用，“标记”是促进分子检测的部分。本发明上下文中的常见标记包括荧光、发光、光散射和/或比色标记。合适的标记包括酶、荧光和发色部分、以及放射性核素、底物、辅因子、抑制剂、化学发光部分、磁性颗粒、稀土金属、金属同位素等。在本发明的一个特定实施方案中，标记是酶。示例性酶标记包括但不限于辣根过氧化物酶(hrp)、碱性磷酸酶(ap)、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶等以及各种蛋白酶。其他标记包括但不限于荧光团、二硝基苯基(dnp)等。标记是本领域技术人员熟知的，例如描述于hermanson,bioconjugate techniques,academic press,san diego(1996)，以及美国专利号3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；和4,366,241。许多标记是可商购的并且可用于本发明的方法和测定中，包括可检测的酶/底物组合(pierce,rockford il；santa cruz biotechnology,dallas tx；life technologies,carlsbad ca)。在本发明的一个特定实施方案中，酶可利用发色或荧光底物以产生可检测信号，如本文所述。本文描述了示例性标记。
230.可以使用多种酶或非酶标记中的任一种，只要可以分别检测到酶活性或非酶标记。酶由此产生可检测信号，其可用于检测靶核酸。特别有用的可检测信号是发色或荧光信号。因此，用作标记的特别有用的酶包括可获得发色或荧光底物的酶。这样的发色或荧光底物可以通过酶促反应转化为容易检测的发色或荧光产物，其可以使用显微镜或光谱法容易地检测和/或定量。这些酶是本领域技术人员熟知的，包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶等(参见hermanson,bioconjugate techniques,academic press,san diego(1996))。具有众所周知的发色或荧光底物的其他酶包括各种肽酶，其中发色或荧光肽底物可用于检测蛋白水解裂解反应。发色和荧光底物的使用在细
菌诊断学中也是众所周知的，包括但不限于使用α-和β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、6-磷酸-β-d-半乳糖苷6-磷酸半乳糖苷水解酶、β-葡糖苷酶、α-葡糖苷酶、淀粉酶、神经氨酸酶、酯酶、脂肪酶等(manafi等人,microbiol.rev.55:335-348(1991))，这些具有已知发色或荧光底物的酶可容易地适用于本发明的方法。
231.产生可检测信号的各种发色或荧光底物是本领域技术人员熟知的并且是可商购的。可用于产生可检测信号的示例性底物包括但不限于用于辣根过氧化物酶的3,3'-二氨基联苯胺(dab)、3,3’,5,5
’‑
四甲基联苯胺(tmb)、氯萘酚(4-cn)(4-氯-1-萘酚)、2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(abts)、邻苯二胺二盐酸盐(opd)和3-氨基-9-乙基咔唑(aec)；用于碱性磷酸酶的5-溴-4-氯-3-吲哚基-1-磷酸(bcip)、氮蓝四唑(nbt)、固红(固红tr/as-mx)和对硝基苯基磷酸酯(pnpp)；用于β-半乳糖苷酶的1-甲基-3-吲哚基-β-d-吡喃半乳糖苷和2-甲氧基-4-(2-硝基乙烯基)苯基β-d-吡喃半乳糖苷；用于β-葡糖苷酶的2-甲氧基-4-(2-硝基乙烯基)苯基β-d-吡喃葡萄糖苷等。示例性荧光底物包括但不限于用于碱性磷酸酶的4-(三氟甲基)伞形基磷酸酯；用于磷酸酶的4-甲基伞形基磷酸酯双(2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇)、4-甲基伞形基磷酸酯双(环己基铵)和4-甲基伞形基磷酸酯；用于辣根过氧化物酶的quantablu
tm
和quantared
tm
；用于β-半乳糖苷酶的4-甲基伞形基β-d-吡喃半乳糖苷、荧光素二(β-d-吡喃半乳糖苷)和萘荧光素二(β-d-吡喃半乳糖苷)；用于β-葡糖苷酶的3-乙酰基伞形基β-d-吡喃葡糖苷和4-甲基伞形基-β-d-吡喃葡糖苷；和用于α-半乳糖苷酶的4-甲基伞形基-α-d-吡喃半乳糖苷。用于产生可检测信号的示例性酶和底物也描述于例如美国公开案2012/0100540中。各种可检测的酶底物(包括发色或荧光底物)是熟知的且可商购的(pierce,rockford il；santa cruz biotechnology,dallas tx；invitrogen,carlsbad ca；42life science；biocare)。通常，将底物转化为形成沉淀的产物，沉淀沉积在靶核酸的位点。其他示例性底物包括但不限于hrp-green(42life science)、betazoid dab、cardassian dab、romulin aec、bajoran紫、vina绿、deep space black
tm
、warp red
tm
、vulcan固红和来自biocare的ferangi蓝(concord ca；biocare.net/products/detection/chromogens)。
232.适合作为可检测标记的示例性稀土金属和金属同位素包括但不限于镧系元素(iii)同位素，例如141pr、142nd、143nd、144nd、145nd、146nd、147sm、148nd、149sm、150nd、151eu、152sm、153eu、154sm、155gd、156gd、158gd、159tb、160gd、161dy、162dy、163dy、164dy、165ho、166er、167er、168er、169tm、170er、171yb、172yb、173yb、174yb、175lu和176yb。金属同位素可以例如使用飞行时间质谱法(tof-ms)(例如，fluidigm helios和hyperion systems,fluidigm.com/systems；south san francisco,ca)测量。
233.生物素-抗生物素蛋白(或生物素-链霉抗生物素蛋白)是众所周知的信号放大系统，其基于以下事实：两个分子彼此具有特别高的亲和力且一个抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白分子可结合四个生物素分子。抗体被广泛用于免疫组织化学和ish中的信号放大。酪酰胺信号放大(tsa)是基于因过氧化物酶活性导致大量半抗原化的酪酰胺分子沉积。酪胺是酚类化合物。在少量过氧化氢存在下，固定的辣根过氧化物酶(hrp)将标记的底物转化成短寿命、极具反应性的中间体。然后活化的底物分子在过氧化物酶结合位点处或附近与蛋白质的富电子部分如酪氨酸非常迅速地反应并共价结合。这样，可以在杂交位点原位引入许多与酪酰胺缀合的半抗原分子。随后，沉积的酪酰胺-半抗原分子可以直接或间接可视
化。例如在美国公开2012/0100540中更详细地描述了这种检测系统。
234.本文所述的实施方案可利用酶使用合适的发色或荧光底物产生可检测信号。可以理解，替代地，标记探针可以具有直接偶联到标记探针的核酸部分的可检测标记。示例性可检测标记是本领域技术人员熟知的，包括但不限于发色或荧光标记(参见hermanson,bioconjugate techniques,academic press,san diego(1996))。可用作标记的示例性荧光团包括但不限于罗丹明衍生物，例如四甲基罗丹明、罗丹明b、罗丹明6g、磺基罗丹明b、德克萨斯红(磺基罗丹明101)、罗丹明110及其衍生物，如四甲基罗丹明-5-(或6)、丽丝胺罗丹明b等；7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑(nbd)；荧光素及其衍生物；萘如丹磺酰(5-二甲基氨基萘-1-磺酰基)；香豆素衍生物，例如7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸(amca)、7-二乙基氨基-3-[(4'-(碘乙酰基)氨基)苯基]-4-甲基香豆素(dcia)、alexa荧光染料(molecular probes)等；4,4-二氟-4-硼杂-3a,4a-二氮杂-s-引达省(bodipy
tm
)及其衍生物(molecular probes；eugene,or)；芘和磺化芘，例如cascade blue
tm
及其衍生物，包括8-甲氧基芘-1,3,6-三磺酸等；吡啶基恶唑衍生物和达巴氧基衍生物(molecular probes)；荧光黄(3,6-二磺酸-4-氨基-萘二酰亚胺)及其衍生物；cydye
tm
荧光染料(amersham/ge healthcare life sciences；piscataway nj)；atto 390、dylight 395xl、atto 425、atto 465、atto 488、atto 490ls、atto 495、atto 514、atto 520、atto 532、atto rho6g、atto 542、atto 550、atto 565、atto rho3b、atto rho11、atto rho12、atto thio12、atto rho101、atto 590、atto 594、atto rho13、atto 610、atto 620、atto rho14、atto 633、atto 643、atto 647、atto 647n、atto 655、atto oxa12、atto 665、atto 680、atto 700、atto 725、atto 740、cyan 500nhs-酯(atto-tech,siegen,德国)等。示例性发色团包括但不限于酚酞、孔雀石绿、硝基芳族化合物如硝基苯基、重氮染料、dabsyl(4-二甲基氨基偶氮苯-4'-磺酰基)等。
[0235]
如本文所公开的，本发明的方法可利用多种靶核酸的并行检测。在使用荧光团作为标记的情况下，选择用于检测多个靶核酸的荧光团，使得每种荧光团是可区分的，并且在并行检测靶核酸的情况下可以在荧光显微镜中被并行地检测。选择这样的荧光团以使发射光谱分离，使得可以并行检测靶核酸的不同标记。选择用于本发明方法的合适的可区分荧光团的方法是本领域熟知的(参见例如johnson和spence,“molecular probes handbook,a guide to fluorescent probes and labeling technologies,第11版,life technologies(2010))。
[0236]
可利用熟知的方法如显微术、细胞计数法(例如，质量细胞计数法，通过飞行时间的细胞计数法(cytof)，流式细胞术)或光谱法来可视化与相应靶核酸相关的发色、荧光或金属可检测信号。通常，如果在同一测定中使用不同的标记，则将发色底物或荧光底物，或发色或荧光标记，或稀土金属同位素用于特定测定，使得可以使用单一类型的仪器来检测同一样品中的核酸靶。
[0237]
如本文所公开的，标记探针可被设计成使得标记是任选地可裂解的。如本文所用，可裂解标记是指与标记探针连接或缀合的标记，使得标记可sgc除去，例如，以便在靶核酸的后续标记和检测轮次中使用相同的标记。通常，标记通过可裂解的化学接头与标记探针缀合。将标记与标记探针缀合以使标记可裂解的方法是本领域技术人员众所周知的(参见例如，hermanson,bioconjugate techniques,academic press,san diego(1996)；daniel等人,biotechniques 24(3):484-489(1998))。用于标记寡核苷酸的一种特定系统是
fasttag
tm
系统(daniel等人,同上,1998；vector laboratories,burlinghame ca)。接头中可包含各种可裂解的部分，以使得标记可从标记探针裂解。此类可裂解部分包括可被化学、光化学或酶促裂解的基团。可裂解的化学接头可包括可裂解的化学部分，如可通过还原裂解的二硫化物、可通过高碘酸盐裂解的乙二醇或二醇、可通过连二亚硫酸酯裂解的重氮键、可通过羟胺裂解的酯、可通过碱裂解的砜等(参见hermanson,同上,1996)。一种特别有用的可裂解接头是含有二硫键的接头，其可通过还原二硫键而裂解。在其他实施方案中，接头可包含用于通过酶裂解的位点。例如，接头可含有蛋白水解裂解位点。通常，这种裂解位点用于序列特异性蛋白酶。此类蛋白酶包括但不限于人鼻病毒3c蛋白酶(裂解位点levlfq/gp；seq id no:1)、肠激酶(裂解位点ddddk/；seq id no:2)、因子xa(裂解位点iegr/；seq id no:3)、烟草蚀刻病毒蛋白酶(裂解位点enlyfq/g；seq id no:4)和凝血酶(裂解位点lvpr/gs；seq id no:5)(参见例如，oxford genetics,oxford,uk)。另一个可裂解部分可以是例如尿嘧啶-dna(含有尿嘧啶的dna)，其可通过尿嘧啶-dna糖基化酶(ung)裂解(参见例如，sidorenko等人,febs lett.582(3):410
–
404(2008))。
[0238]
本发明涉及使用可裂解的标记，使得与靶核酸结合的标记可从靶核酸中除去。如本文所公开，在最后一轮检测中，标记可任选地是可裂解的，因为在最后一轮检测中不需要裂解标记。可通过施加剂(如化学试或光)来裂解标记并使其从标记探针释放来除去可裂解标记。如上所述，用于化学裂解的有用裂解剂包括但不限于还原剂、高碘酸盐、连二亚硫酸酯、羟胺、碱等(参见hermanson,同上,1996)。用于裂解含有二硫键的接头的一种有用方法是使用三(2-羧乙基)膦(tcep)(参见moffitt等人,proc.natl.acad.sci.usa 113:11046-11051(2016))。在一个实施方案中，tcep用作使标记从标记探针裂解的剂。
[0239]
在另一个实施方案中，代替使用可裂解的标记，可通过在高于标记探针-扩增子结合序列的tm的温度下暴露与靶核酸连接的sgc而选择性地除去或洗掉与sgc结合的标记探针。通过选择合适的温度和条件来破坏sgc中标记探针与扩增子之间的结合而选择性地除去sgc的组分，如除去与sgc中的扩增子结合的标记探针的方法是本领域熟知的并且在本文公开。在使用从sgc选择性除去标记探针的情况下，sgc的组分被设计为使得除了标记探针-扩增子相互作用之外，sgc的其他组分的相互作用在破坏标记探针与扩增子的结合的条件期间保持稳定。类似于使用包含可裂解标记的标记探针，应理解，在最后一轮检测中，标记探针与扩增子之间的解链温度不必低于靶探针、前置前置扩增子(如果使用)、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，因为不需要进行进一步的检测轮次。因此，在最后一轮迭代检测中，标记探针与扩增子之间的解链温度低于靶探针、前置前置扩增子(如果使用)、前置扩增子与扩增子之间的解链温度是任选的，以使得标记探针和标记在最后一轮迭代检测时保持与sgc结合。
[0240]
本文所述的本发明总体上涉及检测样品中的多种靶核酸。应当理解，本发明的方法还可用于检测样品中的多个靶核酸和任选的其他分子，特别是在与靶核酸相同的细胞中。例如，除了检测多个靶核酸外，细胞中表达的蛋白质也可使用本文所述用于检测靶核酸的类似原理并行地检测。在这种情况下，在多个靶核酸的一轮或多轮检测中，可以任选地检测细胞中表达的一种或多种蛋白质，例如，通过使用可检测的标记来检测蛋白质。如果在较早轮次的靶核酸检测中检测到蛋白质，则可以使用可裂解标记来检测蛋白质，所述可裂解标记类似于用于检测靶核酸的标记。如果在最后一轮检测中检测到蛋白质，则标记不需要
是可裂解的。细胞中蛋白质的检测是本领域技术人员熟知的，例如，通过使用任何熟知的检测系统(包括本文描述的用于检测靶核酸的那些)检测蛋白质特异性抗体的结合。在实施例中描述了在同一细胞中检测靶核酸和蛋白质(还参见schulz等人,cell syst.6(1):25-36(2018))。
[0241]
应当理解，本发明可以以任何期望的顺序进行，只要检测到靶核酸。因此，在本发明的方法中，使细胞与用于组装sgc的任何组分接触的步骤可以按任何所需顺序进行，可以按顺序进行，或可以同时进行，或一些步骤可以按顺序进行，而其他步骤可以按所需同时进行，只要检测到靶核酸。还应当理解，本文公开的实施方案可以根据需要独立地与本文公开的其他实施方案组合，以利用各种配置、组分大小、测定条件、测定敏感性等。
[0242]
应当理解，本发明可以以提供靶核酸检测的任何形式进行。尽管本文已经使用原位杂交一般性地描述了本发明的实施，但是应当理解，如本领域所熟知的，本发明可以用于以其他形式检测靶核酸，特别是用于检测细胞中的靶核酸。可用于检测细胞中的靶核酸的一种方法是流式细胞术，如本领域熟知的(参见例如shapiro,practical flow cytometry第3版,wiley-liss,new york(1995)；ormerod,flow cytometry,第2版,springer(1999))。因此，本发明的方法，样品和试剂盒可用于原位杂交测定形式或其他形式，如流式细胞术。核酸检测方法(包括原位杂交)对流式细胞术的应用先前已有描述(参见例如hanley等人,plos one,8(2):e57002.doi:10.1371/journal.pone.0057002(2013)；baxter等人,nature protocols 12(10):2029-2049(2017))。
[0243]
在一些情况下，可能需要减少测定步骤的数目，例如减少杂交和洗涤步骤的数目。减少测定步骤数目的一种方式是在与细胞接触之前预组装sgc的一些或全部组分。这种预组装可以通过在接触靶核酸之前将sgc的一些或全部组分杂交在一起来进行。
[0244]
本发明还提供了包含一个或多个细胞的样品。细胞可任选地被固定。细胞可任选地被透化。将细胞固定和/或透化特别适用于原位杂交测定。
[0245]
本发明另外提供了包含一个或多个细胞的载玻片。任选地，将一个或多个细胞固定在载玻片上。任选地，将一个或多个细胞透化。在特定的实施方案中，将载玻片上的细胞固定和/或透化用于原位测定。
[0246]
本发明还提供了一种包含如本文所述的sgc的组分的试剂盒，其中所述试剂盒不包含靶核酸。如本文所公开的，这样的试剂盒可以包含前置扩增子(pa)、扩增子(amp)和标记探针(lp)，以及任选的前置前置扩增子(ppa)。任选地，试剂盒可包含针对特定靶核酸或多种靶核酸的靶探针(tp)。本发明试剂盒的组分可以任选地在容器中，并且可以任选地提供使用试剂盒的说明书。
[0247]
应当理解，在本文提供的本发明的定义内还提供了基本上不影响本发明的各种实施方案的活性的修改。因此，以下实施例旨在说明而非限制本发明。
[0248]
实施例i
[0249]
在迭代轮次的荧光检测中检测靶核酸
[0250]
此实施例描述在三轮荧光检测中检测到hela细胞中的12种阳性对照基因。
[0251]
将12种不同靶标的探针对与制备为福尔马林固定石蜡包埋切片的hela细胞杂交，并且通过与前置扩增子和扩增子序列的连续几轮杂交将杂交信号一起放大。图4a-4c分别示出在三轮荧光检测中检测到hela细胞中的12种阳性对照基因。12种靶基因中的四种，
polr2a、ppib、ubc和hprt1，在第1轮中使用对应于分配给这四个靶探针的信号放大系统的荧光标记探针进行检测。将polr2a、ppib、ubc和hprt1分别用荧光团alexa 488、atto 550、atto 647n和alexa 750标记。在单独的载玻片上，细菌dapb基因的阴性对照探针用于评估非特异性背景。将细胞核用dapi(蓝色)染色。图4a示出与靶核酸结合的第一轮可视化标记的检测。在使荧光团从来自第一轮的标记探针上裂解下来后，使第二标记探针组杂交分别以使用荧光团alexa 488、atto 550、atto 647n和alexa 750检测tubb、rpl28、rpl5和b2m(参见图4b)。在使荧光团从来自第二轮的标记探针上裂解下来后，使第三标记探针组杂交以分别使用荧光团alexa 488、atto 550、atto 647n和alexa 750检测actb、ldha、rplp0和gapdh(参见图4c)。
[0252]
这些结果表明迭代轮次的标记、检测和裂解可用于检测多种靶核酸。
[0253]
实施例ii
[0254]
在迭代轮次的荧光检测中检测靶核酸
[0255]
此实施例描述新鲜冷冻小鼠大脑中神经元标志物的检测和图像配准。
[0256]
使用标准组织加工方法制备新鲜冷冻的小鼠大脑10μm切片。将11种不同靶标的探针对与小鼠大脑切片杂交，并且通过与前置扩增子和扩增子序列的连续几轮杂交将杂交信号一起放大。进行三轮标记探针杂交以使用alexa 488、atto 550、atto 647和alexa 750荧光团检测htr7、pcdh8、meis1、th、crym、synpr、drd1a、cnr1、wfs1、drd2、calb1。使用atto 550进行使用抗neun抗体的免疫荧光检测。将细胞核用dapi染色。来自每轮检测的dapi图像用于使用图像配准软件(advanced cell diagnostics)配准(叠加)来自四轮的图像。通过使用相同的软件为每个靶标选择伪色来叠加配准的图像，并将叠加的图像导出到tiff。以这种方式揭示了相同单独细胞上的十二个靶信号。代表性重叠图像在图5中示出。这些结果表明，迭代轮次的标记、检测和裂解可用于检测多种靶核酸，并且靶核酸的多轮检测可叠加以揭示样品中的所有靶核酸和蛋白质的表达。
[0257]
在整个申请中，引用了各种出版物。这些出版物的公开内容全部特此以引用的方式并入本技术，以便更全面地描述本发明所涉及的技术现状。尽管已参考以上提供的实施例描述本发明，但应理解在不脱离本发明精神的情况下可做出各种修改。