一种壳聚糖-硫酸软骨素纳米颗粒、一种载药关节润滑剂的制作方法

1.本发明涉及关节润滑剂技术领域，特别涉及一种壳聚糖-硫酸软骨素纳米颗粒、一种载药关节润滑剂。


背景技术：

2.骨性关节炎是一种导致膝关节功能失常的疾病，主要与关节软骨的退行性变和损伤有关。在我国有上亿人忍受着关节炎疾病的痛苦，其中有超过半数的患者为老年人。严重的关节炎患者需要进行人工关节置换手术，给患者带来很大的痛苦和经济压力(参见calcif.tissue int.2014,95,495
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505.)。但对于早期症状较轻的患者，向关节腔注射人工关节润滑剂，以此来降低受损软骨界面的磨损可能是更好的选择。
3.在关节炎的注射治疗过程中，关节润滑剂需要具有良好的减摩润滑性能和生物相容性。传统的润滑药物载体多为二氧化硅(sio2)、金(au)等惰性硬质纳米颗粒，其生物相容性不佳，限制了其在关节润滑剂中的应用。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明目的在于提供一种壳聚糖-硫酸软骨素纳米颗粒、一种载药关节润滑剂，本发明提供的壳聚糖-硫酸软骨素纳米颗粒具有良好的减摩润滑性和生物相容性。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供了一种壳聚糖-硫酸软骨素纳米颗粒，包括壳聚糖纳米颗粒和负载在所述壳聚糖纳米颗粒表面的硫酸软骨素。
7.优选的，所述壳聚糖纳米颗粒的粒径为50～300nm；所述壳聚糖纳米颗粒的脱乙酰度为75～85％，黏度为5～200mpa.s。
8.优选的，所述壳聚糖纳米颗粒与硫酸软骨素的质量比为1.5～3:1。
9.本发明提供了上述壳聚糖-硫酸软骨素纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
10.将硫酸软骨素、羧基活化剂与缓冲液混合，进行羧基活化，得到活化羧基的硫酸软骨素；
11.将所述活化羧基的硫酸软骨素与壳聚糖纳米颗粒混合，进行化学接枝反应，得到壳聚糖-硫酸软骨素纳米颗粒。
12.优选的，所述羧基活化剂包括1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和琥珀酰亚胺；
13.所述硫酸软骨素与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量比为1:1～1.2；
14.所述硫酸软骨素与琥珀酰亚胺的质量比为1:1.2～1.5。
15.优选的，所述羧基活化的温度为25～75℃，时间为1～2h；
16.所述化学接枝反应的温度为25～37℃，时间为12～36h。
17.本发明提供了一种载药关节润滑剂，包括上述壳聚糖-硫酸软骨素纳米颗粒，和负
载在所述壳聚糖-硫酸软骨素纳米颗粒表面的药物。
18.优选的，所述药物为双氯芬酸钠、异芒果苷、芒果苷、非诺洛芬、阿司匹林、洛索洛芬、布洛芬和尼美舒利中的一种或几种。
19.优选的，所述载药关节润滑剂中药物的负载量为10～40wt％。
20.本发明提供上述载药关节润滑剂的制备方法，包括以下步骤：
21.将壳聚糖-硫酸软骨素纳米颗粒、药物与缓冲液混合，进行载药，得到载药关节润滑剂。
22.本发明提供了一种壳聚糖-硫酸软骨素纳米颗粒，包括壳聚糖纳米颗粒和负载在所述壳聚糖纳米颗粒表面的硫酸软骨素。在本发明中，壳聚糖(cs)具有良好的生物相容性、血液相容性、生物降解和人体代谢等优点，能够作为安全可靠的药物载体用于治疗关节炎，且壳聚糖自身具有良好的杀菌性能。硫酸软骨素含有大量的亲水性磺酸基，可赋予壳聚糖纳米颗粒优异的水润滑性能，使壳聚糖-硫酸软骨素纳米颗粒具有良好的减摩效果；硫酸软骨素(chi)自身具有软骨修复功能，能够促进软骨的生长，为关节润滑剂的载药治疗和修复功能打下良好的基础。由于壳聚糖纳米颗粒微观上具有柔软的网络结构，其作为药物载体时，在动态加载和受剪切过程中，包裹在其中的药物可以在关节受损界面缓慢释放，呈现出优异的应力诱导缓释效果。
23.本发明提供了上述壳聚糖-硫酸软骨素纳米颗粒的制备方法，本发明先对硫酸软骨素进行羧基活化，再加入壳聚糖纳米颗粒进行化学接枝，得到壳聚糖-硫酸软骨素纳米颗粒。本发明提供的制备方法操作简单，易于工业化批量生产。同时，由于壳聚糖纳米颗粒与硫酸软骨素化学连接，使得壳聚糖-硫酸软骨素纳米颗粒具有良好的稳定性。
24.本发明提供了一种载药关节润滑剂，包括上述壳聚糖-硫酸软骨素纳米颗粒，和负载在所述壳聚糖-硫酸软骨素纳米颗粒表面的药物。本发明提供的载药关节润滑剂集水润滑、载药治疗和软骨修复性能一体化，且具有良好的生物相容性和药物缓释效果，具有良好的骨关节治疗应用前景。
附图说明
25.图1为cs和cs-chi纳米颗粒的透射电镜图；
26.图2为cs-chi纳米颗粒润滑剂在不同生理介质中的溶解和分散状况；
27.图3为cs-chi纳米颗粒润滑剂的生物相容性评估；
28.图4为chi生物大分子和cs-chi纳米颗粒润滑剂在人工关节材料ti6al4v表面的摩擦测试曲线；
29.图5为生理盐水、cs纳米颗粒和cs-chi纳米颗粒润滑剂在天然牛关节软骨表面的摩擦系数；
30.图6为负载双氯芬酸钠的cs纳米颗粒和cs-chi纳米颗粒润滑剂在ph＝7.4的缓冲液中的药物释放曲线图。
具体实施方式
31.本发明提供了一种壳聚糖-硫酸软骨素纳米颗粒，包括壳聚糖纳米颗粒和负载在所述壳聚糖纳米颗粒表面的硫酸软骨素。
32.在本发明中，所述壳聚糖纳米颗粒的粒径优选为50～300nm，更优选为100～200nm。在本发明中，所述壳聚糖纳米颗粒的脱乙酰度优选为75～85％，更优选为80％；黏度优选为5～200mpa.s，更优选为20～150mpa.s，进一步优选为50～100mpa.s。
33.本发明对所述壳聚糖纳米颗粒的制备方法没有特殊的要求，使用本领域常规市售的壳聚糖纳米颗粒或自行制备均可，当自行制备时，所述制备方法优选包括以下步骤：
34.将壳聚糖、醋酸溶液、三聚磷酸钠和交联剂混合，进行交联反应，得到交联产物；
35.将所述交联产物与还原剂混合，进行还原反应，得到壳聚糖纳米颗粒。
36.本发明将壳聚糖、醋酸溶液、三聚磷酸钠和交联剂混合，进行交联反应，得到交联产物。在本发明中，所述醋酸溶液的ph值优选为3～5，更优选为4；所述壳聚糖的质量与醋酸溶液的体积比优选为100mg：50ml。
37.在本发明中，所述壳聚糖与三聚磷酸钠的质量比优选为1:0.3～0.5，更优选为0.4。在本发明中，所述交联剂优选为戊二醛。在本发明中，所述戊二醛优选以水溶液的形式加入，所述戊二醛水溶液的体积浓度优选为50％，所述壳聚糖的质量与戊二醛水溶液的体积比优选为100mg:1～5ml，更优选为100mg:2～3ml。
38.在本发明中，所述交联反应的温度优选为0～10℃，更优选为4～6℃，时间优选为6～24h，更优选为10～20h。在本发明中，所述交联反应优选在机械搅拌的条件下进行，所述搅拌的速度优选为300rpm。
39.得到所述交联产物后，本发明将所述交联产物与还原剂混合，进行还原反应，得到壳聚糖纳米颗粒。在本发明中，所述还原剂优选为硼氢化钠。在本发明中，所述壳聚糖与还原剂的质量比优选为100mg:55mg；在本发明中，所述还原反应的温度优选为20～10℃，时间优选为2～6h，更优选为2～4h。
40.所述还原反应后，本发明优选对所得还原反应液进行后处理，所述后处理优选包括：
41.对所述还原反应液依次进行离心、透析和冷冻干燥，得到壳聚糖纳米颗粒固体。
42.在本发明中，所述离心的速率优选为10000rpm。在本发明中，所述透析优选在ph为7.4的pbs缓冲液中进行，所述透析的时间优选为2天。本发明对所述冷冻干燥的具体操作方式没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的冷冻干燥的方式即可。
43.在本发明中，所述壳聚糖纳米颗粒与硫酸软骨素的质量比优选为1.5～3:1，更优选为2～2.5:1。
44.与传统的硬质二氧化硅颗粒等药物载体不同，本发明选用以天然大分子壳聚糖为原料制备得到的软质溶胀型纳米颗粒作为药物载体，其生物相容性、软骨面抗磨损损伤性、药物可控释放性和血液相容性更为优异；壳聚糖纳米颗粒本身可以在人体内降解，不会对身体产生损害。
45.在本发明中，壳聚糖纳米颗粒表面接枝的硫酸软骨素大分子中含有大量的亲水性磺酸基，可赋予壳聚糖纳米颗粒优异的水润滑性能；结合硫酸软骨素大分子本身的软骨修复功能，制备得到的壳聚糖-硫酸软骨素纳米颗粒集水润滑、载药治疗和软骨修复性能于一身，适合作为关节润滑剂的载体成分。
46.本发明提供了上述壳聚糖-硫酸软骨素纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
47.将硫酸软骨素、羧基活化剂与缓冲液混合，进行羧基活化，得到活化羧基的硫酸软
骨素；
48.将所述活化羧基的硫酸软骨素与壳聚糖纳米颗粒混合，进行化学接枝反应，得到壳聚糖-硫酸软骨素纳米颗粒。
49.本发明将硫酸软骨素、羧基活化剂与缓冲液混合，进行羧基活化，得到活化羧基的硫酸软骨素。在本发明中，所述羧基活化剂优选包括1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和琥珀酰亚胺。在本发明中，所述硫酸软骨素与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量比优选为1:1～1.2，更优选为1:1.1；所述硫酸软骨素与琥珀酰亚胺的质量比优选为1:1.2～1.5，更优选为1:1.3～1.4。
50.在本发明中，所述缓冲液优选为pbs缓冲液，所述pbs缓冲液的ph值优选为7.4。
51.在本发明中，所述混合优选在超声的条件下进行，所述超声的功率优选为150w，时间优选为20min。
52.在本发明中，所述羧基活化的温度优选为25～75℃，更优选为30～50℃。在本发明中，所述羧基活化的时间优选为1～2h，更优选为1.5h。在本发明中，所述羧基活化优选在机械搅拌的条件下进行。
53.得到所述活化羧基的硫酸软骨素后，本发明将所述活化羧基的硫酸软骨素与壳聚糖纳米颗粒混合，进行化学接枝反应，得到壳聚糖-硫酸软骨素纳米颗粒。在本发明中，所述混合的方式优选为搅拌混合。
54.在本发明中，所述化学接枝反应的温度优选为25～37℃，更优选为28～32℃；时间优选为12～36h，更优选为20～30h。在本发明中，所述化学接枝反应优选在搅拌条件下进行，所述搅拌的速率优选为300rpm。在所述化学接枝反应的过程中，硫酸软骨素的羧基与壳聚糖表面的氨基进行反应，从而接枝在壳聚糖纳米颗粒表面。
55.所述化学接枝反应后，本发明优选对所得化学接枝反应液进行后处理，在本发明中，所述后处理优选包括以下步骤：
56.将所述化学接枝反应液进行过滤，所得滤液依次进行透析和冷冻干燥，得到壳聚糖-硫酸软骨素纳米颗粒固体。
57.本发明优选使用直径为200nm的过滤头进行所述过滤。在本发明中，所述透析优选在ph为7.4的pbs缓冲液中进行，所述透析的截留分子量优选为8000～12000kda，更优选为9000～10000kda；所述透析的时间优选为1～3天，更优选为2天。本发明对所述冷冻干燥的方式没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的冷冻干燥方式即可。
58.本发明提供了一种载药关节润滑剂，包括上述壳聚糖-硫酸软骨素纳米颗粒和负载在所述壳聚糖-硫酸软骨素纳米颗粒表面的药物。
59.在本发明中，所述药物优选为消炎药物。在本发明中，所述药物优选为双氯芬酸钠、异芒果苷、芒果苷、非诺洛芬、阿司匹林、洛索洛芬、布洛芬和尼美舒利中的一种或几种。
60.在本发明中，所述载药关节润滑剂中药物的负载量为10～40wt％，更优选为20～30wt％；所述负载量为药物在载药关节润滑剂中的质量百分含量。
61.本发明提供了上述载药关节润滑剂的制备方法，包括以下步骤：
62.将壳聚糖-硫酸软骨素纳米颗粒、药物与缓冲液混合，进行载药，得到载药关节润滑剂。
63.在本发明中，所述缓冲液优选为pbs缓冲液，所述pbs缓冲液的ph值优选为7.4。
64.在本发明中，所述载药优选在搅拌的条件下进行，所述搅拌的速率优选为100～500rpm，更优选为300～400rpm。在本发明中，所述载药的温度优选为25～37℃，更优选为28～32℃，时间优选为12～36h，更优选为20～30h。
65.下面结合实施例对本发明提供的壳聚糖-硫酸软骨素纳米颗粒、载药关节润滑剂的制备方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
66.实施例1
67.(1)cs纳米颗粒制备
68.称取100mg cs，用50ml 1％的醋酸溶液溶解后加蒸馏水至80ml，再加入40mg三聚磷酸钠。用饱和碳酸钠溶液调解ph至5.6，在4℃机械搅拌的条件下反应2h；逐滴滴加2ml戊二醛水溶液(50％,v/v)，继续4℃机械搅拌的条件下反应12h，随后加入55mg硼氢化钠继续反应4h。反应结束后溶液在10000rpm条件下离心，离心后所得沉淀物在ph为7.4的pbs缓冲液中透析2天，最后冷冻干燥制得cs纳米颗粒。
69.(2)cs纳米颗粒表面接枝chi制备cs-chi纳米颗粒
70.称取50mg chi，溶解于50mlph为7.4的pbs缓冲液，依次加入100mg edc和nhs。超声20min后，常温下机械搅拌活化2h。活化反应结束后，加入75mg cs纳米颗粒。置于常温下机械搅拌反应1天。反应结束后用直径200nm过滤头过滤，所得溶液置于ph为7.4的pbs缓冲液中透析2天，透析后冷冻干燥制得未负载药物的cs-chi纳米颗粒。
71.(3)称取100mg cs-chi纳米颗粒，用ph为7.4的pbs缓冲液溶解。再称取100mg抗炎药物双氯芬酸钠加入溶液中，混合均匀后在室温下搅拌2天。结束后，透析去除杂质。最后所得溶液经冷冻干燥得到载药型cs-chi纳米颗粒。
72.cs纳米颗粒与cs-chi纳米颗粒的透射电镜图如图1所示。由图1可以看出，相比于空白的cs纳米颗粒，cs-chi纳米颗粒表面出现了一层均匀的有机物，表明cs纳米颗粒表面成功接枝了chi分子。
73.性能测试
74.(一)稳定性测试
75.将cs-chi纳米颗粒分别置于ph＝7.4的pbs缓冲液、ph＝5.4的pbs缓冲液以及生理盐水中，浓度为2mg/ml，所得结果分别见图2的(一)、(二)和(三)。图2中(一)、(二)和(三)中从左到右依次是超声溶解、静置一周、静置两周后的分散情况，由图2可以看出，cs-chi纳米颗粒在不同介质中静置两周之后，仍然具有良好的稳定性。
76.(二)生物毒性研究
77.将大鼠原代软骨细胞置于cs纳米颗粒分散液、cs-chi纳米颗粒分散液以及载双氯芬酸钠的cs-chi纳米颗粒分散液中孵育不同时间(分散液的浓度均为1.0mg/ml)，所得存活率结果如图3所示。由图3可以看出，cs-chi纳米颗粒具有良好的生物相容性，该可以安全地应用于生物医学领域。
78.(三)摩擦试验
79.以chi生物大分子与cs-chi纳米颗粒润滑剂作为润滑剂，在人工关节材料ti6al4v表面进行摩擦测试，润滑剂的质量浓度均为1.0mg/ml，摩擦副为pdms(聚二甲基硅氧烷)，滑动频率为1hz，载荷为5n。所得结果如图4所示。
80.由图4可以看出，cs-chi纳米颗粒润滑剂的水润滑性能优异，说明其具有作为人工
关节置换材料润滑剂的应用潜力。
81.以cs纳米颗粒和cs-chi纳米颗粒润滑剂作为润滑剂，在天然的牛软骨表面进行摩擦测试，润滑剂的质量浓度均为1.0mg/ml，摩擦副同样为天然的牛软骨，滑动频率为1hz，载荷为5n。所得结果如图5所示。
82.由图5可以看出，cs-chi纳米颗粒润滑剂较空白的cs纳米颗粒具有更低的摩擦系数，说明其具有作为可注射关节润滑剂的应用潜力。
83.(四)缓释效果测试
84.负载等量的双氯芬酸钠的cs纳米颗粒和cs-chi纳米颗粒润滑剂在pbs缓冲液中的药物释放曲线如图6所示。由图6可以看出，可以看出载药型cs-chi纳米颗粒润滑剂具有可控的药物释放行为，说明其具有用作骨关炎治疗的潜在功能。
85.实施例2
86.与实施例1相比，chi与cs纳米颗粒的质量比为50mg：150mg，其余操作均相同，得到cs-chi纳米颗粒。
87.实施例3
88.与实施例1相比，chi与cs纳米颗粒的质量比为50mg：100mg，其余操作均相同，得到cs-chi纳米颗粒。
89.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。