木霉菌Harzianolide的合成基因簇在制备提高植物灰霉病抗性制剂中的应用的制作方法

木霉菌harzianolide的合成基因簇在制备提高植物灰霉病抗性制剂中的应用
技术领域
1.本发明涉及木霉菌次级代谢产物harzianolide合成基因簇的确定及在提高植物灰霉病抗性中的应用，属于应用微生物技术应用领域。
技术背景
2.木霉属真菌不仅广泛存在于有机物丰富的土壤中，在植物、植物残体及植物根际也普遍存在。其菌丝生长及孢子萌发能够适应较广的温湿度和ph范围，且腐生性强、繁殖速度快，可迅速占据有利空间。目前，木霉属真菌已广泛用于多种植物真菌病害的防治，是一种较理想的生防真菌和植物促生菌(plant growth promoting fungus，pgpf)。目前国内外对木霉菌的促生机制和生防机制已经进行了大量的研究，但因菌株之间的差异，整体理论研究还处于不断完善的阶段，尤其对其次级代谢产物的功能研究未有深入的报道。
3.木霉以产生丰富的次级代谢产物而闻名，其富有多种生物学功能，首先，参与木霉自身形态分化，如孢子的形成和菌丝的延伸等等；其次，参与拮抗多种病原真菌，响应土著微生物竞争，协助木霉定殖于土壤中；再次，调节“木霉-植物”的分子对话，表现出诱导植物抗性和促进植物生长的生物学功能。非核糖体途径合成的酮合酶(polyketide synthase，pks)和非核糖体多肽(nonribosomalpeptide synthetase，nrps)合成的聚酮类物质因其独特的催化过程而成为木霉次生代谢产物多样性的在主要组成部分。而对木霉次级代谢产物的研究水平一直处于化合物鉴定和活性分析，其合成基因簇和代谢物相关性的研究及代谢产物的活性机制仍然极少被研究。随着真菌基因组学的发展，目前已完成多株木霉基因组的测序，发现大量的次级代谢产物合成基因簇，只有很少部分在不同种属之间保守，并且次级代谢基因簇中大部分基因功能未知。利用基因工程技术不断发现催化新的生理活性次级代谢产物合成的关键酶基因，从dna水平上深入分析基因的功能，鉴定木霉次级代谢活性物质及合成途径，对明确木霉菌的促生机制、拮抗机制、菌株筛选与改造、制剂开发与工艺改良和田间应用技术等都具有重要理论意义。另外一方面，结合现代生物合成生物学，拓展木霉菌在农业化学和医药领域上的应用。


技术实现要素：

4.本发明的目的是针对以上现有技术的不足，确定了木霉菌次级代谢产物harzianolide的合成基因簇，且提供了harzianolide在提高植株灰霉病抗性中的应用。
5.本发明的目的可通过以下技术方案实现：
6.木霉菌次级代谢产物harzianolide在制备提高植物灰霉病抗性的制剂中的应用；所述的harzianolide结构式如下所示：
[0007][0008]
本发明提供了harzianolide在提高植物灰霉病抗性中的应用。
[0009]
所述的植物具体可以为番茄。
[0010]
本发明还提供了一种提高植物灰霉病抗性的制剂，所述制剂的有效成分为harzianolide；以1l计，包括：harzianolide 0.01mg。
[0011]
所述的制剂通过如下方法进行制备：将harzianolide先溶解于少量甲醇中，再加水，得到混合溶液；
[0012]
本发明还提供了一种提高植物灰霉病抗性的方法，即：将所述的制剂用水稀释后对植物进行灌根。
[0013]
贵州木霉njau 4742中编码次级代谢产物harzianolide的基因簇，其特征在于由如seq id no.1-seq id no.8所示核苷酸序列组成。
[0014]
本发明所述的基因簇在制备harzianolide中的应用。
[0015]
本发明所述的基因簇在制备提高植物灰霉病抗性的制剂中的应用。
[0016]
一种重组表达突变子，其特征将以hph为筛选标记，puc19为载体敲除harb的重组表达质粒。
[0017]
所述的重组表达质粒，优选通过以下方法构建得到：
[0018]
以保藏号为cgmcc no.12166的njau 4742的基因组为模板，用引物harb-5
’‑
f和harb-5
’‑
r扩增转录因子harb上游编码序列，用引物harb-3
’‑
f和harb-3
’‑
r扩增转录因子harb下游编码序列，以ppcdna1质粒为模板扩增hph片段，扩增产物经确认纯化后采用clonexpress multis one step cloning kit进行同源重组连接至由hind iii和ecor i双酶切后的puc19线性化质粒上，构建得到puc19-harb质粒；
[0019]
一种基因工程菌株，其特征在于将所述的重组质粒转化保藏号为cgmcc no.12166的njau 4742的野生型菌株所得。
[0020]
本发明所述的工程菌株在验证njau 4742中harzianolide合成基因簇的应用。
[0021]
本发明详述：
[0022]
1.确定harzianolide的合成基因簇及该基因簇的组成结构
[0023]
前期依据harzianolide的特点推测并验证了木霉菌njau 4742中编码harzianolide基因簇在富营养pdb摇瓶条件下能够稳定表达。通过antismash、blast和荧光
定量分析，推测har基因簇编码合成harzianolide，且该基因包含8个基因(hara-harh)，并受到harb的调控。通过对har基因簇中8个基因依次进行敲除，结合hplc-ms与nmr技术分离，鉴定出har基因簇编码合成木霉菌njau 4742次级代谢产物harzianolide。
[0024]
2.生物学功能验证
[0025]
本研究发现在较低浓度下(0.01ppm)，harzianolide的促生和诱导植物免疫效果更好，尤其是能诱导植物对灰霉病产生显著抗性。
[0026]
所述的验证次生代谢产物harzianolide的合成基因簇的工程菌株构建过程如下：
[0027]
(1)载体构建
[0028]
利用同源重组双交换敲除技术，以潮霉素磷酸转移酶抗性基因元件(hph cassette)作为筛选标记，对njau 4742中目标基因(hara-harh)进行敲除，具体的敲除及验证流程如图2中所示。以njau 4742基因组dna为模板扩增目标敲除基因的上下游同源臂，以ppcdna1质粒为模板扩增hph片段，引物如表1所示。载体构建所用片段均由高保真酶(phanta max super-fidelity dna polymerase)进行pcr扩增，扩增产物经确认纯化后采用clonexpress multis one step cloning kit进行同源重组连接至由hind iii和ecor i双酶切后的puc 19线性化质粒上，20μl反应体系如下：
[0029][0030]
(2)转化
[0031]
pda平板接种sqr-t037菌块，28℃培养10天后，产生大量新鲜分生孢子；用10ml生理盐水(0.8-0.9％w/v nacl,0.05％w/v tween)洗涤菌丝表面，经玻璃绒过滤，去除菌丝体，得到孢子悬液；
[0032]
在玻璃纸覆盖的pda平板上，取200μl孢子悬液涂布，28℃，避光培养16-20h。观察pda平板上孢子是否萌发，如未萌发，延长培养时间；
[0033]
配制溶解酶溶液：0.15g溶解酶溶于20ml溶液a(1.2m sorbitol，0.1m kh2po4，ph 5.6)，0.2μm滤膜过滤除菌；
[0034]
取玻璃纸，用溶解酶溶液洗涤玻璃纸，收集萌发的孢子；28℃，100rpm培养萌发的孢子悬液90min；萌发的孢子悬液经装有玻璃绒的离心管过滤，除去菌丝，用溶液a冲洗，终悬液体积控制在20-30ml；4℃、2000rpm离心10min，去上清；
[0035]
加20ml溶液a，再次离心，去上清；加1ml溶液b(1m sorbitol，50mm cacl2，10mm trishcl，ph 7.5)，冰上得到原生质体；用血球板观察、计数，稀释原生质体至108个/ml得到原生质体悬浮液。用质粒大提试剂盒分别提取质粒puc19-hara、puc19-harb、puc19-harc等，nanodrop测dna浓度，确保质粒浓度达到1μg/μl；
[0036]
准备15ml离心管中分别加200μl原生质体悬浮液、10μl纯化的质粒，如puc19-hara和50μl peg(25％w/v peg6000，50mm cacl2、10mm trishcl，ph 7.5)；用枪头混匀，冰上放置20min；
[0037]
加2ml peg，轻轻混匀，20℃下放置5min；加2ml溶液b，轻轻混匀；
[0038]
将2ml混合液涂布在覆盖层析纸的含1m蔗糖pda平板上，层析纸预先剪成条形；28℃避光培养24h；
[0039]
将条形层析纸片转到含100mg/l潮霉素的pda平板上，28℃，避光培养36h，待条形层析纸边缘长出菌落后，挑取菌落，转接至新鲜的抗生素平板上，培养10天，至产孢；稀释梯度法进行单孢分离，纯化突变子，得到工程菌株。
[0040]
(3)突变株鉴定与纯化
[0041]
在超净工作台中用牙签挑取适量上述转化子菌丝，使用phire plant direct master mix(thermo scientific)试剂盒进行pcr验证，验证引物列于表1中。
[0042]
分析木霉菌njau 4742产次生代谢产物harzianolide
[0043]
pdb摇瓶发酵条件下的野生型及δhara-δharh发酵液。随后，分别取一定量发酵液至新的50ml离心管中，加入等量乙酸乙酯并充分涡旋，静止萃取分层后，将上层有机相吸取至新的离心管中，重复2次。有机相用氮吹仪吹干后，加入hplc级甲醇充分溶解。液相检测用的样品浓缩20倍。
[0044]
高效液相色谱(hplc)检测使用的仪器为agilent 1200system，色谱柱为反相c18(xbridge 5μm,4.6
×
250mm)，检测条件如下：柱温，35℃；流动相a：水；流动相b：甲醇；流速：0.6ml/min；检测波长，230nm。梯度洗脱：0-20min，80％-20％流动相a；20-25min，20％流动相a；20min-25.10min，80％流动相a；25.10min-30min，80％流动相a。所有样品检测前均使用0.22μm有机相滤膜过滤。
[0045]
本发明的有益效果：
[0046]
本发明以harzianolide为主要有效成分制备的制剂，通过诱导植物体内的相关激素信号路径，可显著增强植物对灰霉病的抗性，减少因灰霉病给植株带来的经济损失。采用本发明制剂防治植物灰霉病简单易行，可显著延迟和抑制灰霉病菌在叶片上的生长及病害的扩散，大大提高了植株对灰霉病的抗性。
[0047]
本发明首次在木霉中鉴定次级代谢产物harzianolide的合成基因簇，该基因簇由8个基因组成，包括zn2cys6转录调节因子harb(氨基酸序列在genbank数据库的登录号为opb46143)、未知蛋白质harc(氨基酸序列在genbank数据库的登录号为opb46144)、异戊醇氧化酶hard(氨基酸序列在genbank数据库的登录号为opb46145)、黄素结合单加氧酶类家族蛋白hare(氨基酸序列在genbank数据库的登录号为opb46146)、未知蛋白质harf(氨基酸序列在genbank数据库的登录号为opb46147)、聚酮合酶hara(氨基酸序列在genbank数据库的登录号为opb46148)、ce12 gdsl脂肪酶harg(氨基酸序列在genbank数据库的登录号为opb46149)和未知蛋白质harh(氨基酸序列在genbank数据库的登录号为opb46150)，同时整个基因簇受转录因子harb的调控；本发明解析了木霉次级代谢产物harzianolide的合成基因簇，对菌株筛选与改造、拓展木霉菌在农业化学和医药领域上的应用有重要的价值。
附图说明
[0048]
图1基因敲除及验证流程图。
[0049]
图2木霉野生型与8个敲除突变株pdb发酵液提取物中物质差异高效液相色谱图；检测波长为230nm。std:标品；wt:野生型；210：δharb；211：δharc；212：δhard；213：δhare；214：δharf；215：δhara；216：δharg；217：δharh；
[0050]
图3物质结构。
[0051]
图4为番茄灰霉病接种3天后，病害发生情况的比较。a为病斑数量比较；b为番茄灰霉病接种5天后，φpsii的定量；c为台盼蓝染色比较病害严重情况；d为番茄灰霉病接种5天后，光系统ii(φpsii)光化学量子产率的代表性叶绿素荧光成像。
[0052]
图5为番茄灰霉病接种12h后，番茄叶片中灰霉病原菌的acitn相对含量的比较
具体实施方式
[0053]
下面结合具体实施案例进一步阐述本发明。列举的实施案例仅用于举例说明本发明的实施方法，不用于限制本发明的使用范围。凡未注明具体实施条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件进行。
[0054]
实施例1.鉴定harzianolide的合成基因簇
[0055]
前期依据harzianolide的特点推测并验证了木霉菌njau 4742中编码harzianolide基因簇在富营养pdb摇瓶条件下能够稳定表达。提取木霉菌njau4742在pdb摇瓶条件的rna进行pks相关基因的转录水平分析，着重分析最显著的两个基因簇，并依次敲除基因簇中包含的各个基因。pdb液体发酵njau 4742及各突变株，乙酸乙酯萃取后旋转蒸发，在溶于甲醇，hplc分析差异峰，其中δhara-δharh缺少目标峰；har基因簇由8个基因组成，包括zn2cys6转录调节因子、未知蛋白质、异戊醇氧化酶、黄素结合单加氧酶类家族蛋白、未知蛋白质、聚酮合酶、ce12 gdsl脂肪酶和未知蛋白质，同时整个基因簇受转录因子harb的调控。
[0056]
(1)突变株δhara-δharh的构建
[0057]
依据harzianolide的特点推测并验证了木霉菌njau 4742中编码harzianolide的基因簇在富营养pdb条件是活跃。构建hara-harh的敲除载体。以njau 4742基因组dna为模板扩增目标敲除基因的上下游同源臂，以ppcdna1质粒为模板扩增hph片段，引物如表3-1所示。载体构建所用片段均由高保真酶(phanta max super-fidelity dna polymerase)进行pcr扩增，扩增体系如下：
[0058][0059]
扩增条件：
[0060][0061][0062]
扩增获得的片段经1％的琼脂糖凝胶检测确认片段大小正确后，采用诺维赞公司的fastpure gel dna extraction mini kit进行纯化。纯化后的片段采用clonexpress multis one step cloning kit进行同源重组连接至由ecor i和hind iii双酶切后的puc 19线性化质粒上，20μl反应体系如下：
[0063][0064]
反应液经移液器轻轻吸打混匀，37℃水浴反应30分钟后立即置于冰上冷却。取10μl重组产物加入到含有100μl的大肠杆菌dh5α的感受态细胞的离心管中，轻弹管壁进行混匀，置于冰上静置30分钟。反应结束后，将离心管置于42℃水浴热激45秒，随后冰上放置3分钟。紧接着，在离心管中加入900μl灭菌的lb液体培养基，37℃摇菌1小时使大肠杆菌复苏。菌株复苏后，5000rpm离心3分钟获得菌体，重悬涂布于含有氨苄青霉素的lb固体平板上，置于37℃培养箱中培养。转化子接种于含有氨苄青霉素的lb试管中，37℃，170rpm过夜培养后使用诺维赞公司的fastpure plasmid mini kit提取质粒。以质粒为模板，分别取上游同源臂5’引物和下游同源臂3’引物进行pcr扩增。pcr产物通过1％琼脂糖凝胶检测后测序验证是否正确。含有测序确认正确质粒的大肠杆菌保存于20％的甘油中。
[0065]
以经验证正确的质粒为模板，继续使用上游同源臂5’引物和下游同源臂3’引物进行pcr扩增，获取足量的融合片段。将获得的pcr产物切胶回收后，依据浓度分装成每管10μl(》500ng/μl)并保存于-20℃冰箱待用。
[0066]
引物见表1。引物hara-5f，hara-5r，hara-hph-f，hara-hph-r，hara-3f和hara-3r用于构建敲除hara的敲除片段；引物hara-p1f，hara-p1r，hara-p2f，hara-p2r，hara-p3f和hara-p3r用于hara阳性突变子的筛选。harb-harh敲除片段的构建及阳性突变子的筛选同hara。
[0067]
(2)高效液相色谱分析差异峰
[0068]
pdb摇瓶发酵条件下的野生型及δhara-δharh发酵液。随后，分别取一定量发酵液至新的50ml离心管中，加入等量乙酸乙酯并充分涡旋，静止萃取分层后，将上层有机相吸取至新的离心管中，重复2次。有机相用氮吹仪吹干后，加入hplc级甲醇充分溶解。液相检测用的样品浓缩20倍。
[0069]
实施例2.木霉菌njau 4742次级代谢产物harzianolide具有促进植物生长诱导植物系统抗性的功能
[0070]
过滤pdb摇瓶发酵条件下njau 4742的发酵液，以除去菌丝。剩余液体以2ml/min流速通过预处理xad-4大孔吸附树脂柱中，之后以纯水洗柱，以60％甲醇溶液洗脱harzianolide，采用tlc方法监测流出物，合并含有harzianolide馏分，蒸干得到粗harzianolide。采用硅胶柱层析精制harzianolide，以300-400目硅胶柱分离，tlc监测化合物洗脱时间并收集含有harzianolide成分，氮吹去除溶剂，得到油状化合物，即为harzianolide纯品。
[0071]
纯化后的样品经过核磁共振鉴定，确定化合物结构，鉴定出该化合物为harzianolide。
[0072]
称取harzianolide纯品5.0mg，量取甲醇溶液10ml；将harzianolide完全溶解于甲醇溶液中，获得母液；量取0.01ml母液，加入499.99ml水混匀，搅拌均匀后获得制剂。
[0073]
选取水培技术，对处理组10天的番茄幼苗灌根施用上述制剂，每周处理两次；而对照组番茄幼苗则用0.01ml甲醇加入499.99ml水混匀，灌根处理，持续40天。灰霉病原菌接种前12h和48h分别再处理两次。接种12h后，摘取相同叶位番茄叶片，对灰霉病病原菌的actin基因表达进行了检测，检测结果如图5，本发明制剂处理的植株叶片比对照的植株叶片具有明显较强的灰霉病抗性,叶片灰霉病原菌的actin基因表达量下降56.78％。接种灰霉病原菌5天后，观察到本发明制剂处理的植株叶片比对照的植株叶片病斑数量明显减少，结果如图4a；通过调制叶绿素荧光成像系统(image-pam)对接种灰霉病原菌5天的叶片对叶片状态进行观测及光系统ii(φpsii)光化学量子产率进行测量，结果如图4d和4b；对叶片进行台盼蓝染色，结果如图4c，本发明制剂处理的植株叶片比对照的植株叶片死细胞数量数量明显减少。
[0074]
表1
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