一种以酪氨酸为底物合成柚皮素的方法

1.本发明属于代谢工程及发酵工程领域，涉及一种对引入了柚皮素合成途径的谷氨酸棒杆菌重组菌株进行发酵方法。


背景技术：

2.柚皮素属于天然的二氢黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化等药理作用，在医药领域具有广阔的应用前景。柚皮素的传统生产方法为植物提取法和化学合成法。工业上主要采用的植物提取法对植物组织原料的需求较大且植物组织中柚皮素的含量较低，使得植物提取法的效率低。此外，提取过程中会产生废水、废渣等大量污染物。而化学合成法由于需在高温高压的苛刻反应条件，且反应产物的纯度和质量会受到副反应的影响，限制了其在工业中的应用。
3.相比于传统的柚皮素生产方法，利用微生物合成柚皮素的方法(简称生物合成)由于不依赖于植物组织原料、环境污染小，因而受到更多的关注。在柚皮素的生物合成途径中，一分子柚皮素的合成需要消耗三分子的丙二酰辅酶a，且细胞内丙二酰辅酶a常常维持在较低水平。当前有两种方法可提高丙二酰辅酶a的细胞内含量，一种是利用乙酰辅酶a在乙酰辅酶a羧化酶(acc)作用下转化为丙二酰辅酶a的原理，在细胞中共表达acc基因、生物素连接酶基因bira和乙酰辅酶a合成酶基因acs；另一种是通过丙二酰辅酶a合成酶直接将丙二酰和辅酶a转化为丙二酰辅酶a，例如中国专利cn103484420a可以通过发酵使得柚皮素的产量达到90mg/l，但是利用大肠杆菌构建的重组菌株在合成柚皮素中存在着发酵体系容易被细菌毒素污染的问题，应用于实际生产的安全风险较高。为此中国专利cn112969782a公开了通过棒状杆菌制备多酚和聚酮的方法，利用了公认为安全的微生物，并且提高了中间体丙二酰辅酶a的浓度，可以用于合成柚皮素(需要添加对香豆酸)。但是，该方法中构建重组菌株的方式复杂，并且底物来源有限、价格昂贵，导致实际生产成本较高。
4.目前亟需提出一种绿色、高效的柚皮素合成方法，以降低生产成本、提高经济效益。


技术实现要素：

5.针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种以酪氨酸为底物合成柚皮素的方法。
6.为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
7.一种合成柚皮素的方法，包括以下步骤：
8.以酪氨酸和丙二酸钠为底物，并利用在棒状细菌中表达的柚皮素合成关键酶系，由该棒状细菌在发酵过程中对柚皮素进行生物合成；所述关键酶系由酪氨酸解氨酶(tal)、4-香豆酸:辅酶a连接酶(4cl)、查尔酮合成酶(chs)、查尔酮异构酶(chi)、丙二酸转运酶(matc)和丙二酰辅酶a合成酶(matb)组成。
9.优选的，所述棒状细菌选自含有用于表达酪氨酸解氨酶基因tal、4-香豆酸:辅酶a
连接酶基因4cl、查尔酮合成酶基因chs及查尔酮异构酶基因chi的第一共表达载体(例如质粒pzm1_tal_4cl_chs_chi)和用于表达丙二酸转运酶基因matc及丙二酰辅酶a合成酶基因matb的第二共表达载体(例如质粒pekex3_matbc)的棒杆菌属或短杆菌属基因工程菌(即通过同时转化第一、二共表达载体构建的相应种属细菌的重组菌株)。
10.优选的，所述4-香豆酸:辅酶a连接酶基因4cl来源于欧芹，查尔酮合成酶基因chs来源于矮牵牛花，查尔酮异构酶基因chi来源于苜蓿，酪氨酸解氨酶基因tal来源于深红酵母；丙二酸转运酶基因matc和丙二酰辅酶a合成酶基因matb来源于三叶草根瘤菌。
11.优选的，所述第一共表达载体采用t7启动子(即采用强启动子)，第二共表达载体采用ptac启动子(即采用中强型启动子)。
12.优选的，所述棒状细菌的构建包括以下步骤：
13.构建两个共表达质粒(例如pzm1_tal_4cl_chs_chi和pekex3_matbc)，将这两个共表达质粒转入谷氨酸棒杆菌出发菌株，然后进行抗性筛选，得到可以表达外源酪氨酸解氨酶基因tal、4-香豆酸:辅酶a连接酶基因4cl、查尔酮合成酶基因chs、查尔酮异构酶基因chi、丙二酸转运酶基因matc及丙二酰辅酶a合成酶基因matb的重组菌株。
14.优选的，所述谷氨酸棒杆菌出发菌株选自c.glutamicum 13032(de3)。
15.优选的，所述合成柚皮素的方法具体包括以下步骤：
16.1)将所述棒状细菌(例如构建的基因工程菌)接种到种子培养基中进行培养；
17.2)将步骤1所得培养物转接到发酵培养基中并培养至od
600
为0.7-0.8(使细胞处于生长对数期)；
18.3)经过步骤2后，在发酵培养体系中加入终浓度0.1-1mm的iptg、300-800mg/l的酪氨酸和1-5g/l的丙二酸钠，继续进行培养直至在该培养体系中获得柚皮素。
19.优选的，所述步骤1中，培养条件包括在30℃、200rpm条件下培养12-16h，种子培养基采用bhi液体培养基；步骤2中，培养条件包括在30℃、200rpm条件下培养，发酵培养基采用amm液体培养基；步骤3中，培养条件包括在30℃、200rpm条件下培养12-72h。
20.优选的，所述步骤2中，步骤1所得培养物在发酵培养基中的接种比例为0.5％-2.5％。
21.本发明有益效果体现在：
22.本发明利用基因工程和代谢工程手段在谷氨酸棒杆菌(例如c.glutamicum 13032(de3))等安全性高的宿主菌中引入一条以酪氨酸和丙二酸钠为底物，并在tal、4cl、chs、chi、matb、matc六个外源基因的作用下合成柚皮素的途径，获得了以廉价底物生物合成柚皮素的方法，不仅节约了人力物力，而且有利于降低成本，便于工业化生产应用。
23.进一步的，本发明通过对不同来源的柚皮素合成途径关键酶基因进行组合后筛选，得到在谷氨酸棒杆菌(例如c.glutamicum 13032(de3))中表达良好的基因组合模块(形成了两个共表达载体)，并通过增强柚皮素合成途径中的关键中间体丙二酰辅酶a的供给，提高重组菌株柚皮素的产量。
24.进一步的，本发明通过对所得种子培养物(步骤1)在发酵培养基中接种比例的优化，提高了重组菌株柚皮素的产量。
附图说明
25.图1a为质粒pzm1_tal_4cl_chs_chi的图谱。
26.图1b为质粒pekex3_matbc的图谱。
27.图2为不同来源基因组合模块的摇瓶发酵柚皮素产量结果。
28.图3为表达matb/c后的摇瓶发酵柚皮素产量结果。
29.图4为种子菌接入比例优化中柚皮素产量结果。
30.图5为重组菌株产柚皮素的hplc检测结果；其中：a为柚皮素标准品hplc图谱，b为发酵上清液hplc图谱。
具体实施方式
31.下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。
32.(一)柚皮素合成途径同功酶基因的筛选
33.在谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum,c.glutamicum)体内，来源于不同植物体内的同功酶由于与宿主细胞的同源性、匹配性、相似性等的差异，使得各自在谷氨酸棒杆菌体内的表达程度和催化活性也有显著的区别。另外，当不同种外源基因同时在谷氨酸棒杆菌体内表达时，会产生一些相互促进或者相互抑制的作用，这些相互作用都会对柚皮素的产量产生一定的影响。因此，为了揭示不同来源的外源基因互相之间不同的组合下，转化有相应外源基因的谷氨酸棒杆菌宿主在柚皮素产量上的差异，将单一来源的tal基因与不同植物来源的4cl、chs、chi三种外源基因进行组合。具体选取了来源于矮牵牛花(petunia x hybrida,ph)、洋兰(cattleya maxima,cm)的chs，来源于苜蓿(medicago sativa,ms)、洋兰的chi、来源于欧芹(petroselinum crispum,pc)、葡萄根(vitis vinifera l,vv)的4cl，组合后构建出含有不同种来源基因组合模块的重组菌株进行摇瓶发酵培养，并且通过柚皮素的产量对比来选择最适合于在谷氨酸棒杆菌中合成柚皮素的这四种基因的组合。
34.其中，重组谷氨酸棒杆菌菌株在30℃、200rpm条件下发酵48h(以酪氨酸为底物，并诱导培养)，用高效液相色谱(hplc)对产物柚皮素进行检测。如图2所示，根据检测结果最终筛选出合成柚皮素的最优基因组合模块，具体为来源于欧芹的4cl、来源于矮牵牛花的chs、来源于苜蓿的chi以及单一来源(来源于深红酵母)的tal。
35.(二)合成中间体丙二酰辅酶a供给的强化
36.在本发明中主要通过引入外源合成途径(matb/c)强化丙二酰辅酶a的合成。具体是在谷氨酸棒杆菌体内再引入来源于三叶草根瘤菌(rhizobium trifolii)的丙二酸转运酶基因matc和丙二酰辅酶a合成酶基因matb，并通过添加丙二酸钠，从而实现在含有酪氨酸的培养体系中利用最终获得的重组菌株合成丙二酰辅酶a，并达到适度强化丙二酰辅酶a的功能的效果，保证细胞正常生长代谢和柚皮素大量合成的需求。如图3所示，在表达matb/c后，柚皮素产量有了明显的提高，最高可增加约7.8mg/l。
37.(三)重组菌株在柚皮素的生物合成中的应用
38.3.1重组菌株的构建
39.(1)出发菌株及筛选培养基
40.出发菌株为c.glutamicum 13032(de3)，购自atcc。
41.lb平板：氯化钠10g/l、蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l及琼脂20g/l。
42.lb 壮观霉素 卡那霉素的抗性平板：在以上培养基成分(lb平板)基础上，额外添加100mg/l壮观霉素和25mg/l卡那霉素。
43.(2)重组质粒构建、转化及重组子筛选
44.本发明通过酶切连接反应构建得到两个共表达质粒：pzm1_tal_4cl_chs_chi、pekex3_matbc，经测序验证。
45.构建以上两个共表达质粒所采用的骨架载体分别为pzm1、pekex3，为本实验室保存，构建方法参考文献。
46.pzm1构建：zha j,zang y,mattozzi m,plassmeier j,gupta m,wu x,clarkson s,koffas mag.metabolic engineering of corynebacterium glutamicum for anthocyanin production.microbial cell factories.2018sep 14；17(1):143.doi:10.1186/s12934-018-0990-z.
47.pekex3构建：kallscheuer n,vogt m,stenzel a,j,bott m,marienhagen j.construction of a corynebacterium glutamicum platform strain for the production of stilbenes and(2s)-flavanones.metabolic engineering.2016nov；38:47-55.doi:10.1016/j.ymben.2016.06.003.
48.如图1a所示，质粒pzm1_tal_4cl_chs_chi携带了来源于深红酵母的酪氨酸解氨酶(tal)基因(kf765779.1)、来源于欧芹的4-香豆酸:辅酶a连接酶(4cl)基因(x13324.1)、来源于矮牵牛花的查尔酮合成酶(chs)基因(af233638.1)及来源于苜蓿的查尔酮异构酶(chi)基因(kf765782.1)的对应表达盒。这四个表达盒分别含有t7启动子、t7终止子以及相应来源的tal、4cl、chs、chi基因各自的开放阅读框，在转化出发菌株后形成的重组子中发挥合成柚皮素作用。质粒pzm1_tal_4cl_chs_chi还含有卡那霉素抗性基因表达盒kanr，以及参与乳糖分解的乳糖操纵子，核糖体结合位点rbs和复制起始位点phm1519ori。
49.如图1b所示，质粒pekex3_matbc携带了来源于三叶草根瘤菌的丙二酸转运酶(matc)基因(af117694.1)和丙二酰辅酶a合成酶(matb)基因(af117694.1)的表达盒。该表达盒含有ptac启动子、matc的开放阅读框、核糖体结合位点rbs、matb的开放阅读框以及t7终止子。质粒pekex3_matbc还含有壮观霉素(spectinomycin)抗性基因表达盒以及复制起始位点pbl1ori。
50.将构建的两个共表达质粒通过电转化转入c.glutamicum 13032(de3)感受态细胞，挑取能在含有壮观霉素(100mg/l)和卡那霉素(25mg/l)两种抗生素的抗性平板上生长的菌落，使其在同样的抗性平板上再连续转接三代，得到遗传稳定的阳性重组子。挑选阳性重组子，通过测序验证六个合成途径基因(tal、4cl、chs、chi、matc、matb)已经成功转入。
51.其中，感受态细胞的制作步骤如下：
52.1)从-80℃冰箱中取出c.glutamicum 13032(de3)，置于冰盒上；
53.2)在超净工作台中，挑取少量菌液，接种于2-5ml bhi液体培养基中，30℃、200rpm过夜培养；
54.3)次日转接到50ml新鲜的bhi液体培养基中，30℃、200rpm培养至od
600
＝1.5(大约4h)；
55.4)冰上孵育15min后，在4℃条件下，4000rpm离心10min，弃上清；
56.5)用50ml、20ml、10ml预冷的10％(v/v)甘油依次清洗细胞，4℃、4000rpm离心10min，弃上清；
57.6)将细胞重悬于1ml预冷的10％(v/v)甘油中，以100μl进行等体积分装，在-80℃冰箱中保存备用。
58.(3)实验结果统计
59.遗传稳定的阳性重组子(简称重组菌株)在平板上所有生长的菌落中的占比为90％以上。
60.对于遗传稳定的阳性重组子的保存：挑取单菌落到3-5ml含有壮观霉素(100mg/l)和卡那霉素(25mg/l)的lb液体培养基中，30℃、200rpm过夜培养，将所得含有壮观霉素和卡那霉素的培养液与甘油混合，使得甘油终浓度为15％(v/v)，存于-80℃。使用时，先进行菌株活化。
61.3.2发酵生产柚皮素的实例
62.(1)发酵培养基
63.amm液体培养基组成为(100ml)：1
×
salt 10ml、40％(质量分数)葡萄糖溶液5ml、1m硫酸镁100μl、0.2mg/ml biotin solution 100μl、0.5mg/ml thiamine hcl 100μl、10
×
mops mix 10ml、0.1m氯化钙100μl及0.2g蛋白胨；去离子水配制，用氢氧化钾固体调节ph至6.8后定容至100ml，用0.22μm滤膜过滤除菌。
[0064]1×
salt的配制(200ml)：称取磷酸二氢钾0.7g、三水磷酸氢二钾0.66g及氯化铵0.6g，去离子水配制，用稀盐酸调节ph至6.3后定容至200ml；
[0065]
10
×
mops mix的配制(100ml)：称取mops 8.372g、七水硫酸亚铁0.028g、氯化铵0.51g、硫酸钾0.048g、六水氯化镁0.235g、氯化钠2.92g及加入micronutrient 20μl，去离子水配制，定容至100ml。
[0066]
其中，micronutrient的配制(50ml)：称取五水硫酸铜0.009g、硼酸0.063g、四水氯化锰0.045g、七水硫酸锌0.0125g及四水合钼酸铵0.009g，去离子水配制，定容至50ml，用0.22μm滤膜过滤除菌。
[0067]
bhi液体培养基组成为：脑心浸液培养基粉末(bhi)3.7％(质量分数)；去离子水配制，120℃高温灭菌。
[0068]
(2)优化培养条件
[0069]
采用了一个阳性重组子作为基因工程菌，设置了两个平行进行条件优化，条件包括种子菌接种量、发酵培养基体积、底物加入时间等。
[0070]
参见图4，在发酵培养基为15ml、诱导剂iptg为0.5mm时(底物与诱导剂同时加入)，尽管种子菌都已处于生长对数期，但接入比例1.5％(v/v)的柚皮素产量明显高于采用其他种子菌接入比例的柚皮素产量。
[0071]
挑取单菌落转接到含有壮观霉素(100mg/l)和卡那霉素(25mg/l)的5ml bhi液体培养基中，在30℃、200rpm条件下过夜培养；次日，以1.5％(v/v)的比例将过夜培养物(种子菌)转接到新鲜的含有壮观霉素(100mg/l)和卡那霉素(25mg/l)的10ml amm液体培养基中(质粒携带抗性，不使用抗生素会造成质粒丢失，从而导致外源基因无法表达)，30℃、200rpm条件下培养至od
600
＝0.7-0.8；随后加入终浓度为0.5mm的iptg、500mg/l的酪氨酸和
2g/l的丙二酸钠，在30℃、200rpm条件下培养72h。
[0072]
(3)发酵产物的样品制备
[0073]
在培养(加入iptg诱导后)的第0小时、12小时、24小时、48小时及72小时，分别取200μl发酵液在12000rpm下离心10min，取上清液测柚皮素含量。
[0074]
(4)高效液相色谱(hplc)测定柚皮素
[0075]
仪器：shimadzu sil-16高效液相色谱仪(配紫外可见检测器)
[0076]
色谱柱：unitary c18(4.6mm
×
250mm，5μm)
[0077]
流动相a：乙腈 0.1％甲酸(体积分数)、流动相b：水 0.1％甲酸(体积分数)
[0078]
洗脱条件：按照10％～40％a(0～10min)，40％～60％a(10～15min)，60％～10％a(15～20min)进行梯度洗脱，流速为1ml/min。
[0079]
柱温：30℃；进样量：10μl；紫外检测器波长：280nm。
[0080]
经对样品进行hplc检测(图5)，结果表明重组菌株柚皮素产量为20.5mg/l(在48小时左右产量最高)。
[0081]
总之，本发明以c.glutamicum 13032(de3)为出发菌株，通过在该菌株中引入外源酪氨酸解氨酶基因tal、4-香豆酸:辅酶a连接酶基因4cl、查尔酮合成酶基因chs、查尔酮异构酶基因chi以及丙二酸转运酶基因matc、丙二酰辅酶a合成酶基因matb构建重组菌株。相较于其他常用微生物载体，谷氨酸棒杆菌属于食品安全级微生物，不含有内毒素，且其遗传操作方法已较为成熟，将其作为宿主菌株具有很大的优势。利用重组菌株以酪氨酸和丙二酸钠为底物，结合优化的培养条件，在诱导培养48h后，柚皮素产量即可达到最高。本发明对其他黄酮类化合物的生物合成具有借鉴意义。