用于绘制滚环扩增产物图谱的方法与流程

用于绘制滚环扩增产物图谱的方法
1.背景
2.本技术要求于2019年10月28日提交的美国临时申请序列号62/926,907的权益，该申请以其整体并入本文。
3.发明背景
4.细胞极性，即标志物偏向细胞内或细胞表面上的一个或多个区域，是常见现象，但很难以高通量的方式研究。例如，虽然存在分析单细胞上的细胞表面标志物表达的几种方法(如，涉及流式细胞术或将单个细胞放入隔室然后对单个细胞进行测定的方法)，但那些方法不提供任何有关单个细胞上细胞表面标志物的空间关系的信息。用于分析细胞内或细胞上的生物分子之间空间关系的最新方法，例如邻近连接技术(参见，例如等人nature methods.2006 3:995-1000)，weinstein的基于扩散的方法(参见，例如cell 2019 178:229-241和us20160265046)和基于阵列的方法(参见，例如vickovic等人,nature methods 2019 16:987-990)，要么不容易适应细胞表面标志物的分析，要么不提供有关细胞极性的任何信息。显微术是分析单细胞上的标志物之间空间关系的金标准。然而，显微术固有非常低的通量且很难自动化。
5.鉴于上述情况，仍然需要以高通量方式分析细胞极性的方法。
6.发明概述
7.除其他外，本文描述了用于分析可能在细胞内或细胞上的标志物的分布的基于测序的方法。该方法依赖于将滚环扩增(rca)产物固定于靶标(如，细胞或基底)内或靶标上，绘制相对于彼此的rca产物的图谱，然后经由邻近测定将标志物的位置和量图谱映射(mapping)到rca产物上。
8.在一些实施方案中，所述方法可包括：(a)产生包含网格寡核苷酸分子群体和各自具有独特rca产物标识符序列的rca产物群体的复合物，其中网格寡核苷酸直接或经由夹板间接与rca产物中的互补位点杂交；(b)延伸与两个rca产物杂交的网格寡核苷酸分子，以将来自两个rca产物的独特rca产物标识符序列的互补序列添加到网格寡核苷酸分子中；(c)对延伸的网格寡核苷酸测序；(d)分析序列以鉴定哪些独特rca产物标识符序列的互补序列对已添加到网格寡核苷酸中；以及(e)使用(d)中鉴定的序列对来制作固定的rca产物的一个或多个物理图谱。这种方法在概念上如图2所示，但是有几种可能的变化。
9.该方法可以以多种不同的方式实施。例如，如图13和图14例示，可实施该方法，使得步骤(a)中rca产物中的至少一些独特rca产物标识符序列是双链的，并且步骤(b)包括将网格寡核苷酸分子连接到rca产物的双链区域的链末端，从而将来自两个rca产物的独特rca产物标识符序列的互补序列添加到网格寡核苷酸。
10.在其他示例中，如图6、图7和图9至图12例示的，可实施该方法，使得步骤(a)包括使网格寡核苷酸分子群体与rca产物群体杂交，其中将网格寡核苷酸分子或rca产物固定，其中：(i)rca产物群体的rca产物各自具有独特的rca产物标识符序列和网格寡核苷酸结合序列，和(ii)网格寡核苷酸分子各自包含与网格寡核苷酸结合序列互补的第一末端序列和与网格寡核苷酸结合序列互补的第二末端序列；并且(iii)至少一些网格寡核苷酸分子与
两个邻近rca产物杂交。在这些实施方案中，延伸可包括缺口填充和/或连接反应，其将来自两个邻近rca产物的独特rca产物标识符序列的互补序列添加到网格寡核苷酸中。
11.在一些实施方案中，网格寡核苷酸分子可原位制备(即，通过在夹板(splint)介导的连接反应中连接两个或更多个较短的寡核苷酸产生)。参见，例如图12。在其他实施方案中，完整的网格寡核苷酸分子与样品中的位点杂交。参见，例如图10。在其他实施方案中，预先制备的rca产物与样品中的位点杂交，参见，例如图6和图7。在其他实施方案中，rca产物可在细胞内或细胞上原位制备。rca产物的原位产生已描述于各种出版物中。例如，soderberg等人(nat.methods 2006 3:995-1000)描述了从附接到寡核苷酸的两种抗体的同时结合原位产生rca产物的原位邻近连接测定法(pla)，leuchowius等人(cytometry a.2009 75:833-9)描述了用于流式细胞术的细胞表面的原位pla，larsson等人(nat.methods.20107:395-7)描述了通过锁式(padlock)探针和原位rca检测细胞中的mrna，gusev等人(am.j.pathol.2001 159:63-69)描述了通过免疫rca扩增的组织中和细胞表面上的dingle蛋白检测，以及lizardi等人(nat genet.1998 19:225-32)描述了使用原位rca检测细胞中点突变的方法。
12.在一些实施方案中，该方法可包括：(a)使网格寡核苷酸分子群体与rca产物群体杂交，其中将网格寡核苷酸分子或rca产物固定于细胞内或一个或多个表面(如，载玻片或细胞)上，其中：(i)rca产物群体的rca产物各自具有独特rca产物标识符序列和网格寡核苷酸结合序列，和(ii)网格寡核苷酸分子各自包含与网格寡核苷酸结合序列互补的第一末端序列和与网格寡核苷酸结合序列互补的第二末端序列；和(iii)至少一些网格寡核苷酸分子与两个邻近rca产物杂交；(b)延伸与两个邻近rca产物杂交的网格寡核苷酸分子，以将来自两个邻近rca产物的独特rca产物标识符序列的互补序列添加到网格寡核苷酸中，从而产生延伸的网格寡核苷酸；(c)测序延伸的网格寡核苷酸；以及(d)分析序列以鉴定哪些独特rca产物标识符序列的互补序列对已被添加到延伸的网格寡核苷酸中。
13.在一些实施方案中，该方法可包括：(a)使网格寡核苷酸分子群体与rca产物群体杂交，其中将网格寡核苷酸分子或rca产物固定于细胞内或一个或多个表面(如，载玻片或细胞)上，其中：(i)rca产物群体包括：i.第一组rca产物，其各自包含重复序列，所述重复序列包含独特rca产物标识符序列和第一网格寡核苷酸结合序列，和ii.第二组rca产物，其包含重复序列，所述重复序列包含独特rca产物标识符序列和第二网格寡核苷酸结合序列；(ii)网格寡核苷酸分子各自包含与第一网格寡核苷酸结合序列互补的第一末端序列和与第二网格寡核苷酸结合序列互补的第二末端序列；和(iii)至少一些网格寡核苷酸分子与两个邻近rca产物杂交；(b)延伸与两个邻近rca产物杂交的网格寡核苷酸分子，以将来自两个邻近rca产物的独特rca产物标识符序列的互补序列添加到网格寡核苷酸中，从而产生延伸的网格寡核苷酸；(c)测序延伸的网格寡核苷酸；以及(d)分析序列以鉴定哪些独特rca产物标识符序列的互补序列对已添加到网格寡核苷酸中。
14.在任何实施方案中(并且如图10至图16所例示)，网格寡核苷酸分子可经由探针固定于细胞内或一个或多个表面上。在其他实施方案中(并且如图6、图7和图9所例示)，rca产物可经由探针固定于细胞内或一个或多个表面上。
15.可将(d)中鉴定的序列对的序列用于制作固定的rca产物的一个或多个物理图谱(其可包括重叠和/或非重叠图谱)，其中图谱提供固定的rca产物在细胞内或在一个或多个
表面(如，细胞表面)上的位置。如上所述，取决于该方法如何实现，图谱可以是二维或三维图谱。
16.如下文将更详细描述的，rca产物可经由一种或多种结合剂(如，抗体)固定，其中结合剂各自结合(即，杂交于)rca产物中的序列以及细胞内或细胞上的位点(如，细胞表面标志物)。在这些实施方案中，该方法可进一步包括在一种或多种结合剂和它们所结合的rca产物之间进行邻近测定，从而允许表面的结合剂图谱映射于特定rca产物。
17.一旦已将结合剂图谱映射于特定rca产物，单个结合剂的位置和量就可图谱映射到固定的rca产物的物理图谱上，如上所述。可分析结合剂在图谱上的分布以及它们结合的位点。
18.还提供了探针系统。在一些实施方案中，探针系统可包括：(a)rca产物群体，其中rca产物群体的rca产物各自具有独特rca产物标识符序列和网格寡核苷酸结合序列；和(b)网格寡核苷酸分子群体，其中网格寡核苷酸分子一端的末端序列与一种网格寡核苷酸结合序列互补，并且网格寡核苷酸分子另一端的末端序列与一种网格寡核苷酸结合序列互补，其中(a)和(b)的杂交产生复合物，在该复合物中网格寡核苷酸与邻近rca产物杂交。网格寡核苷酸分子可以是单分子(其中核苷酸彼此共价连接)或断裂成一个或多个序列。在这些实施方案中，如果网格寡核苷酸分子断裂成一个或多个序列，那么该系统可进一步包括将序列保持在一起的一个或多个夹板寡核苷酸。
19.在一些实施方案中，探针系统可包括：(a)rca产物群体，包含：(i)第一组rca产物，其各自包含重复序列，所述重复序列包含独特rca产物标识符序列和第一网格寡核苷酸结合序列；和(ii)第二组rca产物，其包含重复序列，所述重复序列包含独特rca产物标识符序列和第二网格寡核苷酸结合序列；(b)网格寡核苷酸分子群体，其中网格寡核苷酸分子一端的末端序列与第一网格寡核苷酸结合序列互补，并且网格寡核苷酸分子另一端的末端序列与第二网格寡核苷酸结合序列互补。在这些实施方案中，(a)和(b)的杂交产生复合物，在该复合物中网格寡核苷酸与邻近rca产物杂交。
20.附图简述
21.本领域技术人员将理解以下描述的附图仅用于说明目的。附图不旨在以任何方式限制本教导的范围。
22.图1示意说明覆盖在rca产物中的细胞。
23.图2示意说明如何将来自邻近rca产物的独特分子标识符添加到网格寡核苷酸中的实例。在本实例中，使用rca产物作为模板通过延伸网格寡核苷酸的3'端，可将独特分子标识符中的一个(如，uid2)的互补序列添加到网格寡核苷酸的3'端，并且可将独特分子标识符中的另一个(如，uid1)的互补序列添加到网格寡核苷酸的5'端，其通过例如上游寡核苷酸的缺口填充/连接(如图3所例示和下文更详细地描述)或通过将网格寡核苷酸连接到与独特分子标识符互补并与rca产物杂交的寡核苷酸。在后一种实施方案中，rca产物用作连接的夹板。
24.图3示意说明可将umi添加到网格寡核苷酸中的一种方法。
25.图4示意说明已复制到网格寡核苷酸中的独特分子标识符如何以成对方式映射以产生rca产物的物理图谱。
26.图5示意说明umi标记的滚环扩增产物、抗体-寡核苷酸探针和细胞的相对大小。
27.图6示意说明本发明方法的第一种实施。
28.图7示意说明本发明方法的第二种实施。
29.图8示意说明使用图7所示方法产生的pcr扩增子。
30.图9示意说明本发明方法的第三种实施。
31.图10示意说明本发明方法的第四种实施。
32.图11示意说明本发明方法的第五种实施。
33.图12示意说明本发明方法的第六种实施。
34.图13示意说明本发明方法的第七种实施的第一部分。
35.图14示意说明本发明方法的第七种实施的第二部分。
36.图15示意说明本发明方法的第八种实施的第一部分。
37.图16示意说明本发明方法的第八种实施的第二部分。
38.定义
39.在更详细地描述示例性实施方案之前，阐述以下定义以说明和定义说明书中使用的术语的含义和范围。
40.数字范围包括定义范围的数字。除非另有说明，核酸以5'至3'方向从左到右书写；并且，氨基酸序列以氨基至羧基方向从左到右书写。
41.除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。singleton,等人,dictionary of microbiology and molecular biology,2d ed.,john wiley and sons,new york(1994),和hale&markham,the harper collins dictionary of biology,harper perennial,n.y.(1991)向技术人员提供了本文所使用的许多术语的一般含义。尽管如此，为了清楚和便于参考，下面定义了某些术语。
42.必须注意，如本文和所附权利要求中所使用，单数形式“一个”、“一种”和“所述/该”包括复数指示物，除非上下文另有明确说明。例如，术语“引物”是指一个或多个引物，即，单引物和多引物。还应注意，权利要求可撰写为排除任何可选元素。因此，本说明旨在用作使用与权利要求要素陈述相关的“唯一”、“仅”等这类排他性术语或使用“否定”限制的先行基础。
43.术语“核苷酸”旨在包括那些不仅含有已知的嘌呤和嘧啶碱基，而且还含有其他已经修饰的杂环碱基的部分。这类修饰包括甲基化嘌呤或嘧啶、酰化嘌呤或嘧啶、烷基化核糖或其他杂环。此外，术语“核苷酸”包括那些含有半抗原或荧光标记的部分，并且可能不仅含有常规核糖和脱氧核糖，还含有其他糖。经修饰的核苷或核苷酸还包括对糖部分的修饰，例如，其中一个或多个羟基被卤素原子或脂族基团取代，被官能化为醚、胺等。
44.术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用来描述任何长度的聚合物，例如由大于约2个碱基、大于约10个碱基、大于约100个碱基、大于约500个碱基、大于1000个碱基，直至约10,000个或更多个碱基的核苷酸(如，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成，并且可酶促或合成产生(例如，如美国专利号5,948,902和其中引用的参考文献所述的pna)，其可与天然存在的核酸以类似于两个天然存在的核酸的序列特异性方式杂交，例如，可参与沃森-克里克(watson-crick)碱基配对相互作用。天然存在的核苷酸包括鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶(分别为g、c、a、t和u)。dna和rna分别具有脱氧核糖和核糖糖主链，而pna的主链由通过肽键连接的重复n-(2-氨乙基)-甘氨酸单元组成。在pna中，各种嘌呤和
denhardt溶液、0.5％sds和100ug/ml变性载体dna中杂交，然后于室温在2x ssc和0.5％sds中洗涤两次，然后于42℃在0.1xssc和0.5％sds中再洗涤两次。
49.如本文所用，术语“测序”是指获得多核苷酸的至少10个连续核苷酸的身份(如，至少20、至少50、至少100或至少200个或更多个连续核苷酸的身份)的方法。
50.术语“下一代测序”是指由例如illumina、lifetechnologies、bgi genomics(complete genomics technology)和roche等目前采用的所谓的并行合成测序或连接测序平台。下一代测序方法还可包括纳米孔测序方法或基于电子检测的方法，例如由life technologies商业化的ion torrent技术。
51.如本文所用，术语“双链体”或“双链的”描述碱基配对(即，杂交在一起)的两个互补多核苷酸。
52.术语“确定”、“测量”、“评估”、“评价”、“测定”、和“分析”在本文中可互换使用来指测量的形式，并且包括确定要素是否存在。这些术语包括定量和/或定性确定。评价可以是相对的或绝对的。
53.如本文所用，术语“连接”是指第一dna分子5'端的末端核苷酸与第二dna分子3'端的末端核苷酸的酶催化连接。
54.术语“多个”、“组”和“群体”可互换使用来指包含至少2个成员的事物。在某些情况下，多个可具有至少10、至少100、至少100、至少10,000或至少100,000个成员。
[0055]“引物结合位点”是指在靶多核苷酸或片段中寡核苷酸与之杂交的位点。如果寡核苷酸“提供”引物的结合位点，则引物可与该寡核苷酸或其互补序列杂交。
[0056]
如本文所用，术语“链”是指由通过共价键(如，磷酸二酯键)共价连接在一起的核苷酸组成的核酸。
[0057]
如本文所用，术语“延伸”是指通过使用聚合酶添加核苷酸来延伸引物。如果将与核酸退火的引物延伸，则该核酸充当延伸反应的模板。
[0058]
如本文所用，术语“滚环扩增”或简称“rca”是指使用链置换聚合酶产生环化核酸模板的线性多联拷贝的等温扩增。rca在分子生物学领域是众所周知的并且描述于多种出版物中，包括但不限于lizardi等人(nat.genet.1998 19:225-232),schweitzer等人(proc.natl.acad.sci.2000 97:10113-10119),wiltshire等人(clin.chem.2000 46:1990-1993)和schweitzer等人(curr.opin.biotech 2001 12:21-27)，它们通过引用并入本文。
[0059]
如本文所用，术语“滚环扩增产物”是指滚环扩增反应的多联产物。如本文所用，术语“荧光标记的滚环扩增产物”是指已通过例如使荧光标记的寡核苷酸与滚环扩增产物杂交或其他方式(如，在扩增过程中通过将荧光核苷酸掺入产物)荧光标记的滚环扩增产物。
[0060]
如本文所用，术语“表面”是指任何固体材料(如，玻璃、金属、陶瓷、有机聚合物表面或凝胶)，其可包含细胞或源自细胞的生物分子(如，蛋白、核酸、脂质、寡糖/多糖、生物分子复合物)、细胞器、细胞碎片或排泄物(外泌体、微泡)等的任何组合。组织印迹、western印迹和载玻片是具有表面的固体材料的示例。细胞，例如哺乳动物细胞悬液，是表面的另一示例。
[0061]
如本文所用，术语“夹板(splint)”是指与两个其他寡核苷酸的末端杂交并使那些末端一起以产生可连接结点的寡核苷酸。
[0062]
其他术语的定义可能会出现在整个说明书中。
[0063]
示例性实施方案的描述
[0064]
在描述各种实施方案之前，应理解本公开的教导不限于所描述的特定实施方案，并且同样地当然可以变化。还应理解，本文使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的而不旨在限制，因为本教导的范围将仅受所附权利要求的限制。
[0065]
本文使用的章节标题仅用于结构目的，不得解释为以任何方式限制所描述的主题。尽管结合各种实施方案描述了本教导，但本教导并不旨在限于这些实施方案。相反，本教导包括本领域技术人员将理解的各种替代、修改和等同物。
[0066]
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文所述那些相似或等效的任何方法和材料也可用于本教导的实践或测试，但是现在描述的是一些示例性方法和材料。
[0067]
对任何出版物的引用是针对其在申请日之前的公开内容，不应被解释为承认本技术权利要求无权由于在先发明而先于这样的出版物。此外，提供的出版日期可能与需要独立确认的实际出版日期不同。
[0068]
如本领域技术人员在阅读本公开内容后将显而易见的，本文描述和说明的每个单独的实施方案具有离散的组件和特征，它们可以容易地与其他几个实施方案中的任何一个的特征分离或组合而不脱离本教导的范围或精神。任何列举的方法都可按照列举事件的顺序或任何其他逻辑上可能的顺序来实施。
[0069]
本文提及的所有专利和出版物，包括在这类专利和出版物中公开的所有序列，均通过引用明确并入本文。
[0070]
以下公开内容提供了绘制邻近rca产物图谱的方法。由该方法产生的图谱可以是三维图谱或二维图谱，这取决于该方法是如何实现的。例如，如果将rca产物固定于细胞内(如，在细胞内原位产生)，则产生的图谱可能是三维的。在其他实施方案中，例如，如果将rca产物固定于一个或多个表面(如，可为悬浮的或安装于支持物上的一个或多个细胞的表面)上，则通过该方法产生的图谱可能是二维的。虽然该方法可应用于细胞(如下所述)，但该方法可适合于绘制固定于任何表面(如，可能具有组织印迹的载玻片或western印迹等)上的邻近rca产物的图谱。同样地，虽然rca产物或rca产物可能结合的网格寡核苷酸分子可经由抗体(如，与寡核苷酸缀合的抗体，该寡核苷酸具有与rca产物或网格寡核苷酸分子中的序列互补的序列)锚定到细胞内或细胞上或表面上的位点，但是rca产物或网格寡核苷酸分子可经由使用任何类型的相互作用(如，直接或间接地，共价或非共价相互作用)来固定。例如，在一些实施方案中，rca产物或网格寡核苷酸分子可经由结合剂(如，适体、抗体或寡核苷酸等)结合到细胞，其中结合剂结合rca产物或网格寡核苷酸分子中的序列以及细胞内或一个或多个细胞表面上的位点。在一些实施方案中，rca产物或网格寡核苷酸分子可经由与寡核苷酸(该寡核苷酸还与核酸(如，细胞rna)杂交)杂交来固定，或可将rca产物经由静电相互作用、经由链霉亲和素/生物素相互作用非共价地固定于位点，或通过共价键(如，经由点击偶联)固定于位点。
[0071]
为清楚起见，短语“将网格寡核苷酸分子群体与rca产物群体杂交，其中将网格寡核苷酸分子或rca产物固定”旨在涵盖以下实施方式：(a)网格寡核苷酸与固定的rca产物杂交(在这种情况下，网格寡核苷酸杂交之前rca产物首先在原位固定或产生)，如图6、图7和
图9所例示，或(b)rca产物与固定的网格寡核苷酸杂交(在这种情况下，rca产物杂交之前网格寡核苷酸首先在原位固定或产生)，如图10至图12和图14至图16所例示。
[0072]
在任何实施方案中，rca产物或网格寡核苷酸分子可固定于溶液中的细胞内或细胞上、支持物(如，载玻片)上的细胞内或细胞上、组织的三维样品中的细胞内或细胞上、或组织切片中的细胞内或细胞上。例如，溶液中含有细胞的样品可以是已经作为细胞悬液生长的培养细胞的样品。在其他实施方案中，可使用解离的细胞(这些细胞可通过使用胰蛋白酶等解离培养的细胞或实体组织(如肝脏或脾脏等软组织)中的细胞来产生)。在特定实施方案中，rca产物可固定于血液中存在的细胞上，例如全血中的细胞或其细胞亚群。全血中的细胞亚群包括血小板、红血球(红细胞)、血小板和白血球(即，外周血白细胞，由中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和单核细胞组成)。这五种白细胞可进一步分为两组，粒细胞(又被称为多形核白细胞，并且包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)和单核白细胞(包括单核细胞和淋巴细胞)。淋巴细胞可进一步分为t细胞、b细胞和nk细胞。外周血细胞存在于血液循环池中，未隔离在淋巴系统、脾脏、肝脏或骨髓中。如果使用固定于支持物的细胞，则可通过例如以下来制备样品：在平面表面上培养细胞、在平面表面上沉积细胞(如，通过离心)、切割包含细胞的三维物体成切片并将切片嵌放到平面上(即，产生组织切片)。在替代实施方案中，表面可通过将细胞成分吸收到表面上来制备。
[0073]
在任何实施方案中，所述方法可包括将数千、数万、数十万或至少一百万个rca产物(各自具有独特标识符)固定于细胞群体(如，经由抗体)，从而在各个细胞上rca产物覆盖细胞。图1示意说明覆盖在rca产物中的细胞。显然，该图是示意图；细胞不是如图所示完全球形的，并且rca产物也不是完全球形的，大小相同或以规则图案均匀分布。rca产物可经由抗体(例如，如图6、图7、图9和图10所例示)或经由核酸探针(例如，如图11所例示)锚定到细胞，但是其他方法也是可能的。在某些情况下，可将rca产物通过与网格寡核苷酸杂交而固定于细胞，如图10所示。如下文将更详细描述的，各rca产物具有独特标识符序列以及与网格寡核苷酸杂交的序列。网格寡核苷酸和rca产物杂交以产生包含rca产物和网格寡核苷酸的基质，其中网格寡核苷酸与邻近的rca产物杂交。杂交后，邻近rca产物的独特标识符序列从rca产物复制到网格寡核苷酸上。如以下将更详细描述的，可对网格寡核苷酸进行测序。可基于已添加到网格寡核苷酸中的序列构建rca产物的物理图谱。
[0074]
如图2所例示，在该方法的第一步中，网格寡核苷酸2(即，网格寡核苷酸分子群体)可与rca产物群体杂交，其中网格寡核苷酸或rca产物可固定于一个或多个细胞上。该步骤可使用单一网格寡核苷酸(即，具有相同序列的网格寡核苷酸分子的群体，在网格寡核苷酸中间具有可用作分子标识符的可选的简并(如，随机)序列)来实施。如实施例部分所述，该方法可使用除了独特标识符序列外其他方面相同的rca产物群体来实施。然而，在其他实施方案中，该方法可使用至少独特标识符序列以及它们的网格寡核苷酸结合序列不同的两种或更多种类型的rca产物来实施。后一实施方案在图2中例示。在所例示实施方案中，rca产物群体包括：i.第一组rca产物4，其各自包括重复序列，该重复序列包括独特rca产物标识符序列(“uid1”，如图所示)和第一网格寡核苷酸结合序列(“gobs1”，如图所示)，以及ii.第二组rca产物6，其包括重复序列，该重复序列包含独特rca产物标识符序列(“uid2”，如图所示)和第二网格寡核苷酸结合序列(“gobs2”，如图所示)。第一组中可能有至少100、至少1,000或至少10,000个rca产物，并且第二组中可能有相似的数目(即，至少100、至少1,000或
至少10,000个rca产物)，其中每个rca产物都具有独特rca产物标识符序列。第一组和第二组rca产物相互穿插，使得来自第一组的rca产物可能邻近于来自第二组的至少一个，但有时是两个、三个或四个rca产物。
[0075]
图2中，rca产物显示为圆形。rca产物是紧密的近似球形的颗粒，其直径通常在0.1至1um的范围内。如果需要，该方法中使用的rca产物的尺寸可通过添加与每个rca产物内的两个或更多个位点杂交的压缩寡核苷酸来减小，这减小了rca产物的尺寸。较小的rca产物会提高由该方法生成的图谱的分辨率。压缩寡核苷酸描述于，例如clausson,(sci rep.2015；5:12317)。图2中将rca产物显示为圆形并不意味着rca产物的dna本身就是圆形，尽管rca是使用圆形模板完成的。
[0076]
rca产物可通过例如合成具有简并序列的初始寡核苷酸、使用夹板环化初始寡核苷酸以及通过rca扩增环化的寡核苷酸来制备。在一些实施方案中，初始寡核苷酸可包含6至10个核苷酸的简并(如，随机)序列，或者甚至更多随机核苷酸，这取决于所需的独特rca产物的数量。具有简并序列的环化寡核苷酸的扩增应当产生rca产物的群体，每种rca产物都具有独特标识符(即，与群体中其他rca产物不同的序列)。用于生成具有独特标识符的rca产物的方法描述于例如，wu等人(nat.comm.2019 10:3854)和us20160281134中，这些方法易于适用于本文。在一些实施方案中，分别制备用于制备第一组和第二组rca产物的不同寡核苷酸，然后混合在一起。在其他实施方案中，不同的寡核苷酸可在阵列形式的平面支持物上平行制备，然后从阵列上切割下来。这类方法的示例描述于，例如cleary等人(nature methods 2004 1:241-248)和leproust等人(nucleic acids research 2010 38:2522-2540)。
[0077]
如图2所示，该方法中使用的网格寡核苷酸分子可各自包含与第一网格寡核苷酸结合序列(gobs1)互补的第一末端序列和与第二网格寡核苷酸结合序列(gobs2)互补的第二末端序列。至少一些网格寡核苷酸分子经由那些序列与两个邻近rca产物杂交。图2显示与两个邻近rca产物杂交的网格寡核苷酸。假设连续碱基之间的距离约为0.3nm，那么理论上100-mer网格寡核苷酸应当能够拉伸30nm，理论上200-mer网格寡核苷酸应当能够拉伸60nm，以及理论上500-mer网格寡核苷酸应当能够拉伸150nm。因此，与网格寡核苷酸分子杂交的rca产物可相距小于100nm或相距小于50nm。
[0078]
在该方法的下一步中，延伸与两个邻近rca产物杂交的网格寡核苷酸分子，以将来自两个邻近rca产物的独特rca产物标识符序列的互补序列添加到网格寡核苷酸的末端，从而产生延伸的网格寡核苷酸8。在图2所示的示例中，将uid1'(即，uid1的互补序列)添加到网格寡核苷酸的一端，并将uid2'(uid2的互补序列)添加到网格寡核苷酸的另一端。在一些实施方案中，网格寡核苷酸可使用缺口填充/连接反应(参见，例如mignardi等人,nucleic acids res.2015 43:e151)来延伸，其将来自两个邻近rca产物的独特rca产物标识符序列的互补序列添加到网格寡核苷酸中。在其他实施方案中，添加可通过如上所述的连接来完成。
[0079]
用于将来自两个邻近rca产物的独特rca产物标识符序列的互补序列添加到网格寡核苷酸的一种方法示于图3中，但是可使用其他方法。如图3所示，uid序列可使用以下系统添加到网格寡核苷酸中，在该系统中：(a)第一组滚环扩增(rca)产物包含至少第一类型的rca产物，该rca产物包含重复序列，该重复序列以5'至3'的顺序包含：第一邻近探针结合
序列(ppbs1，如所示)、第一独特rca产物标识符序列(umi1，如所示)和第一网格寡核苷酸结合序列(gobs1，如所示)；和(b)第二组rca产物包含至少第二类型的rca产物，该rca产物包含重复序列，该重复序列以5'至3'的顺序包含：第二网格寡核苷酸结合序列(gobs2，如所示)、第二独特rca产物标识符序列(umi2，如所示)和第二邻近探针结合序列(ppbs2，如所示)。如图3所示，在该实施中使用的网格寡核苷酸具有与第二网格寡核苷酸结合序列(gobs2)互补的5'端序列和与第一独特rca产物标识符序列上游的第一网格寡核苷酸结合序列(gobs1)互补的3'端序列。该实施利用具有与第一邻近探针结合序列(ppbs1)互补的5'端序列的第一邻近探针；和具有与第二邻近探针结合序列(ppbs2)互补的3'端序列的第二邻近探针。如图3所示，这些成分杂交在一起产生复合物，在该复合物中第一和第二独特rca产物标识符序列可经由缺口填充/连接反应分别通过延伸网格寡核苷酸和第二邻近探针的3'端来复制。显然，在该实施方案中，第一组rca产物可包括至少1000、至少10,000、至少100,000、至少1m、至少10m、至少100m、至少1b或至少10b个滚环扩增(rca)产物，其中第一组中的每个rca产物都包含重复序列，该重复序列以5'至3'的顺序包含：第一邻近探针结合序列(ppbs1)，验明rca产物的独特序列(umi，如所示)和第一网格寡核苷酸结合序列(gobs1)，和(b)的第二组rca产物可包含至少1000、至少10,000、至少100,000、至少1m、至少10m、至少100m、至少1b、或至少10b个滚环扩增(rca)产物，其中第二组中的每个rca产物都包含重复序列，该重复序列以5'至3'的顺序包含：第二网格寡核苷酸结合序列(gobs2)，验明rca产物的独特序列(umi，如图所示)，以及第二邻近探针结合序列(ppbs2)。
[0080]
如图3所示，在涉及以下的反应中可将umi添加到网格寡核苷酸中：(a)产生复合物，该复合物中：(i)第一邻近探针的5'端与第一rca产物的第一邻近探针结合序列(ppbs1)杂交；和(ii)第二邻近探针的3'端序列与鉴定rca产物的独特序列(分别为umi1和umi2)上游的第二组rca产物的第二邻近探针结合序列(ppbs2)杂交；和(iii)网格寡核苷酸的3'和5'端序列分别与第一和第二rca产物的第一和第二网格寡核苷酸结合序列(gobs1和gobs2)杂交；和(b)用聚合酶和连接酶处理(a)的复合物，从而将第一和第二独特rca产物标识符序列的互补序列分别复制(经由缺口填充/连接反应)到网格寡核苷酸和第二邻近探针的3'端，并产生产物分子(延伸的网格寡核苷酸)，其包含第一和第二独特rca产物标识符序列的互补序列。
[0081]
在这些实施方案中，第一组和第二组rca产物彼此穿插并固定于细胞上，第一邻近探针的5'端序列与第一组rca产物的第一邻近探针结合序列杂交，第二邻近探针的3'端序列与第二组rca产物的第二邻近探针结合序列(鉴定rca产物的独特序列的上游)杂交；并且网格寡核苷酸的3'和5'端序列与彼此邻近的一对rca产物的第一和第二网格寡核苷酸结合序列杂交。同样，用聚合酶、dntp和连接酶处理复合物允许将鉴定邻近rca产物的独特序列对复制到网格寡核苷酸和第二邻近探针的末端并产生产物分子(本文被称为延伸的网格寡核苷酸)，其包括鉴定邻近rca产物的独特序列对的互补序列。
[0082]
如图2所示，在网格寡核苷酸已被延伸以将来自邻近rca产物的uid添加到它们的末端后，对延伸的网格寡核苷酸8进行测序，然后进行分析以确定哪些独特rca产物标识符序列的互补序列对已添加到网格寡核苷酸中。该过程如图4例示。如图4所例示，每个延伸的网格寡核苷酸应当在一端具有第一独特rca产物标识符序列(如，uid1)的互补序列和在另一端具有第一独特rca产物标识符序列(如，uid3)的互补序列。可分析这些序列以汇编成对
的rca产物标识符序列列表(如，uid1-uid3、uid1-uid13等)，其可用于制作各细胞表面上的rca产物的二维图谱。如图4例示，该方法可包括使用成对的rca产物标识符序列的序列列表来制作固定的rca产物的一个或多个物理图谱(关系图谱)。显然，该图谱可以是一个或多个细胞的表面的图谱。在一些情况下，物理图谱可包括重叠和/或非重叠图谱。
[0083]
在任何实施方案中，可在测序之前通过pcr扩增延伸的网格寡核苷酸。在这些实施方案的一些中，可将pcr引物的结合位点分别添加到第一和第二邻近探针的3'尾部和5'尾部，如图3所例示的，或者理论上，pcr引物的结合位点可编码到rca产物中，并在延伸反应期间复制到网格寡核苷酸的末端。
[0084]
除了制作rca产物的图谱外，该方法可包括在结合到细胞内或细胞表面上的位点的一种或多种结合剂(如，结合到细胞上的细胞表面标志物的抗体)之间进行邻近测定。在这些实施方案中，可将独特rca产物标识符序列复制到与捕获剂连接的寡核苷酸中。在一些实施方案中，捕获剂是抗体-寡核苷酸缀合物，如图6、图7、图9和图10所例示的，在其他实施方案中，捕获剂可以是寡核苷酸探针(如图11所例示)。在这些实施方案中，术语“抗体-寡核苷酸缀合物”和“与寡核苷酸连接的捕获剂”是指以捕获剂仍可结合到其结合位点的方式非共价(如，经由链霉亲和素/生物素相互作用)或共价(如，经由点击反应等)连接于单链寡核苷酸的捕获剂，如抗体或适体。寡核苷酸和捕获剂可经由许多不同的方法连接，包括使用含有马来酰亚胺或卤素基团的方法，这些方法是半胱氨酸反应性的。捕获剂和寡核苷酸可连接在寡核苷酸的5'端近侧或5'端处，寡核苷酸的3'端近侧或3'端处，或两者之间的任何地方。在一些实施方案中，寡核苷酸可通过将寡核苷酸与捕获剂分开的接头连接到捕获剂。可使用任何方便的方法将寡核苷酸与捕获剂连接(参见，例如gong等人,bioconjugate chem.2016 27:217
–
225和kazane等人proc natl acad sci 2012 109:3731-3736)。在许多实施方案中，与结合剂缀合的寡核苷酸序列独特地鉴定结合剂所结合的表位或序列。例如，如果该方法使用10种不同的抗体进行，则每种抗体都与鉴定抗体所结合表位的不同序列栓系。这种特征允许该方法是多重的，并且在一些实施方案中，可在该方法中使用至少5、至少10、至少20、或至少50种与细胞内或细胞表面上的不同标志物结合的不同抗体。每种抗体与不同的抗体标识符序列缀合，并且抗体标识符序列允许映射特定抗体的结合事件。这类带标签的抗体描述于，例如wu等人(nat.comm.2019 10:3854)和us20160281134等。
[0085]
如图6、图7和图9至图16例示，邻近测定可以多种不同的方式实施。在任何实施方案中，邻近测定可产生含有结合剂标识符序列的互补序列和独特rca产物标识符序列的互补序列的产物。在一些实施方案中，邻近测定的产物(延伸的邻近探针)可以是与延伸的网格寡核苷酸分开的分子(如图6例示)。在其他实施方案中，邻近测定的产物(延伸的邻近探针)可以是延伸的网格寡核苷酸的一部分(参见，例如图7和图9)。在任何实施方案中，测定中使用的捕获剂的一部分可连接到寡核苷酸的5'端，而捕获剂的其余部分可连接到寡核苷酸的3'端(如图7和图9例示)。例如，在一些实施方案中，该方法可利用包含一种或多种抗体-寡核苷酸缀合物的混合物，其中在一些实施方案中，结合特定细胞表面标志物的抗体的一些(如，抗体分子的30％-70％)与寡核苷酸的5'端缀合，而与该细胞表面标志物结合的抗体的其余部分与寡核苷酸的3'端缀合。在这些实施方案中，寡核苷酸可各自包含pcr引物结合位点(在与抗体连接的寡核苷酸的任何一端)，并且由测定产生的产物可通过pcr扩增，如图8例示的。
[0086]
如图10至图16例示，在一些实施方案中，可在添加rca产物之前将网格寡核苷酸分子固定于细胞表面上。在这些实施方案中，该方法可包括(a)使rca产物群体与固定于一个或多个表面上的网格寡核苷酸分子群体杂交，其中：(i)rca产物群体的rca产物各自具有独特rca产物标识符序列和网格寡核苷酸结合序列，和(ii)网格寡核苷酸分子各自包含与网格寡核苷酸结合序列互补的第一末端序列和与网格寡核苷酸结合序列互补的第二末端序列；并且(iii)至少一些网格寡核苷酸分子与两个邻近rca产物杂交；(b)延伸与两个邻近rca产物杂交的网格寡核苷酸分子，以将来自两个邻近rca产物的独特rca产物标识符序列的互补序列添加到网格寡核苷酸中，从而产生延伸的网格寡核苷酸；(c)测序延伸的网格寡核苷酸；以及(d)分析序列以确定哪些独特rca产物标识符序列的互补序列对已添加到网格寡核苷酸中。如图12所示，在一些实施方案中，网格寡核苷酸本身可以是邻近连接测定的产物。在这些实施方案中，可将网格寡核苷酸断裂，使得每个部分与不同探针杂交。在这些实施方案中，只有当网格寡核苷酸的两个部分彼此邻近并且能够在夹板连接反应中彼此连接时，才产生完整的网格寡核苷酸。因此，在一些实施方案中，该方法可包括使用通过分析序列读段鉴定的独特rca标识符序列对制作固定的rca产物的物理图谱，并且还通过分析测定产物中有哪些独特rca产物标识符序列和哪些结合剂标识符序列来将结合剂图谱映射到固定的rca产物的物理图谱中。如图7和图9所示，可将结合剂标识符序列的互补序列和独特rca产物标识符序列的互补序列掺入延伸的网格寡核苷酸中。在其他实施方案中，将结合剂标识符序列的互补序列和独特rca产物标识符序列的互补序列掺入与延伸的网格寡核苷酸分开的测定产物中。对在邻近测定中复制到测定产物中的独特rca产物标识符序列的分析允许将与细胞结合的各个捕获剂的结合位点图谱映射于特定rca产物。具体地，可将各结合事件都图谱映射于rca产物，因为该rca产物的独特rca标识符序列被添加到与该rca产物邻近的栓系有结合剂的寡核苷酸中。然后可将结合剂置于上述rca产物图谱上，从而提供结合事件的二维图谱，其中二维对应于一个或多个细胞的表面。可将类似的方法用于生成结合事件的二维图谱。
[0087]
显然，各个rca产物都包含相同序列的多个拷贝，因此，可将多个结合事件映射到单个rca产物，从而提供定量rca产物的方法。例如，如果一百个抗体-寡核苷酸缀合物与所有邻近特定rca产物的位点结合，那么可能将所有一百个结合位点映射到单个rca产物中。将结合位点映射到本身已以二维绘制的rca产物图谱中提供了检查结合位点在细胞内或细胞表面上的分布的方法。这继而提供了无需显微术即可检查细胞极性的方法。
[0088]
本文还提供了探针系统。在一些实施方案中，探针系统可包含(a)rca产物群体，其包含：(i)第一组rca产物，每个rca产物包含重复序列，该重复序列包含独特rca产物标识符序列和第一网格寡核苷酸结合序列；和(ii)第二组rca产物，其包含重复序列，该重复序列包含独特rca产物标识符序列和第二网格寡核苷酸结合序列；和(b)网格寡核苷酸分子群体，其中网格寡核苷酸分子一端的末端序列与第一网格寡核苷酸结合序列互补，并且网格寡核苷酸分子另一端的末端序列与第二网格寡核苷酸结合序列互补。如上所述，(a)和(b)的杂交产生了复合物，在该复合物中网格寡核苷酸与邻近的rca产物杂交，如图2所示。第一组和第二组rca产物各自包含至少10个成员(如，至少100、至少1,000、至少1,000、至少10,000、至少100,000、至少1m、至少10m、至少100m、至少1b或至少10b个成员)。在一些实施方案中，rca产物中的网格寡核苷酸结合序列与rca产物中的独特rca产物标识符序列邻近，并且
网格寡核苷酸分子的末端与网格寡核苷酸结合序列杂交，而不与独特rca产物标识符序列杂交。探针系统的更多细节见于上面的方法部分中。
[0089]
还提供了各自具有独特rca产物标识符序列的rca产物群体，其中rca产物中的至少一些独特rca产物标识符序列是双链的且在其间存在单链区域缺口。这种群体的示例如图13所示。该群体可通过以下来制备：如上所述扩增rca模板、使rca产物变性、使两个或更多个寡核苷酸与产物杂交，其中一个寡核苷酸与独特rca产物标识符序列上游的位点杂交，并且另一个寡核苷酸与独特rca产物标识符序列下游的位点杂交，然后经由缺口-填充-连接反应连接寡核苷酸。这封闭了寡核苷酸之间的缺口并使rca产物中的独特rca产物标识符序列成为双链的。如所示，可将产物的双链部分的末端连接于网格寡核苷酸，如图14例示。
[0090]
还提供了rca产物群体，其包含：第一组rca产物，每个rca产物包含重复序列，该重复序列包含独特rca产物标识符序列和第一网格寡核苷酸结合序列(其长度为至少约10、12或15个核苷酸)；和(ii)第二组rca产物，其包含重复序列，该重复序列包含独特rca产物标识符序列和第二网格寡核苷酸结合序列(其长度为至少约10、12或15个核苷酸)。在这些实施方案中，rca产物中的网格寡核苷酸结合序列可与独特rca产物标识符序列邻近。在任何实施方案中，rca产物群体第一组和第二组rca产物各自包含至少10、至少100、至少1,000、至少1,000、至少10,000、至少100,000、至少1m、至少10m、至少100m、至少1b或至少10b个成员。
[0091]
本公开还提供了用于实施如上所述的主题方法的试剂盒。在某些实施方案中，试剂盒可包含探针系统的组分或起始产品以制备产物。试剂盒可另外包含连接酶、核苷酸、用于进行滚环扩增的链置换聚合酶和/或用于缺口-填充连接反应的聚合酶。根据需要，试剂盒的各种组分可存在于分开的容器中，或某些相容的组分可预先组合到单个容器中。除上述组分外，主题试剂盒还可包括使用试剂盒的组分实施主题方法的说明书。
[0092]
实施方案
[0093]
实施方案1.一种用于鉴定邻近的滚环扩增(rca)产物的方法，其包括：
[0094]
(a)使网格寡核苷酸分子群体与固定于一个或多个细胞上的rca产物群体杂交，其中：(i)rca产物群体的rca产物各自具有独特rca产物标识符序列和网格寡核苷酸结合序列，和(ii)网格寡核苷酸分子各自包含与网格寡核苷酸结合序列互补的第一末端序列和与网格寡核苷酸结合序列互补的第二末端序列；并且(iii)至少一些网格寡核苷酸分子与两个邻近的rca产物杂交；
[0095]
(b)延伸与两个邻近rca产物杂交的网格寡核苷酸分子，以将来自两个邻近rca产物的独特rca产物标识符序列的互补序列添加到网格寡核苷酸中，从而产生延伸的网格寡核苷酸；
[0096]
(c)测序延伸的网格寡核苷酸；以及
[0097]
(d)分析序列以鉴定哪些独特rca产物标识符序列的互补序列对已添加至网格寡核苷酸。
[0098]
实施方案2.实施方案1的方法，其还包括：
[0099]
(e)使用(d)中鉴定的序列对制作固定的rca产物的一个或多个物理图谱。
[0100]
实施方案3.任何先前实施方案的方法，其中延伸包括缺口填充和/或连接反应，其将来自两个邻近rca产物的独特rca产物标识符序列的互补序列添加到网格寡核苷酸。
[0101]
实施方案4.实施方案1的方法，其中步骤(a)中：
[0102]
(i)rca产物群体包括：i.第一组rca产物，其各自包含重复序列，该重复序列包含独特rca产物标识符序列和第一网格寡核苷酸结合序列，和ii.第二组rca产物，其包含重复序列，该重复序列包含独特rca产物标识符序列和第二网格寡核苷酸结合序列；
[0103]
(ii)网格寡核苷酸分子各自包含与第一网格寡核苷酸结合序列互补的第一末端序列和与第二网格寡核苷酸结合序列互补的第二末端序列；并且
[0104]
(iii)至少一些网格寡核苷酸分子与两个邻近rca产物杂交。
[0105]
实施方案5.如任何先前实施方案的方法，其中rca产物经由抗体固定于细胞。
[0106]
实施方案6.任何先前实施方案的方法，其中延伸的网格寡核苷酸在测序之前通过pcr进行扩增。
[0107]
实施方案7.任何先前实施方案的方法，其中rca产物经由一种或多种结合剂固定于一个或多个细胞，其中结合剂各自结合至rca产物中的序列和一个或多个细胞表面上的位点。
[0108]
实施方案8.实施方案7的方法，其还包括在一种或多种结合剂和它们所结合的rca产物之间进行邻近测定。
[0109]
实施方案9.实施方案8的方法，其中邻近测定产生包含结合剂标识符序列的互补序列和独特rca产物标识符序列的互补序列的测定产物。
[0110]
实施方案10.实施方案9的方法，其中所述方法包括：
[0111]
(e)使用(d)中鉴定的序列对制作固定的rca产物的物理图谱；以及通过分析测定产物中有哪些独特rca产物标识符序列和哪些结合剂标识符序列，将结合剂映射到固定的rca产物的物理图谱中。
[0112]
实施方案11.实施方案10的方法，其中将结合剂标识符序列的互补序列和独特rca产物标识符序列的互补序列掺入步骤(b)的延伸的网格寡核苷酸中。
[0113]
实施方案12.实施方案10的方法，其中将结合剂标识符序列的互补序列和独特rca产物标识符序列的互补序列掺入与步骤(b)的延伸的网格寡核苷酸分开的测定产物中。
[0114]
实施方案13.探针系统，其包括：
[0115]
(a)rca产物群体，其中rca产物群体的rca产物各自具有独特rca产物标识符序列和网格寡核苷酸结合序列；和
[0116]
(b)网格寡核苷酸分子群体，其中网格寡核苷酸分子一端的末端序列与网格寡核苷酸结合序列互补，并且网格寡核苷酸分子另一端的末端序列与网格寡核苷酸结合序列互补，其中(a)和(b)的杂交产生复合物，在该复合物中网格寡核苷酸核苷酸与邻近rca产物杂交。
[0117]
实施方案14.实施方案13的探针系统，其中：(a)的rca产物群体包括：
[0118]
(i)第一组rca产物，其各自包含重复序列，该重复序列包含独特rca产物标识符序列和第一网格寡核苷酸结合序列；和
[0119]
(ii)第二组rca产物，其包含重复序列，该重复序列包含独特rca产物标识符序列和第二网格寡核苷酸结合序列；并且
[0120]
(b)的网格寡核苷酸分子群体包括，网格寡核苷酸分子一端的末端序列与第一网格寡核苷酸结合序列互补，并且网格寡核苷酸分子另一端的末端序列与第二网格寡核苷酸
结合序列互补。
[0121]
实施方案15.实施方案14的探针系统，其中第一组和第二组rca产物各自包括至少10个成员。
[0122]
实施方案16.实施方案13至15中任一项的探针系统，其中rca产物中的网格寡核苷酸结合序列与rca产物中的独特rca产物标识符序列邻近，并且网格寡核苷酸分子的末端与网格寡核苷酸结合序列杂交，但不与独特rca产物标识符序列杂交。
实施例
[0123]
提出以下实施例是为了向本领域普通技术人员提供关于如何制备和应用本发明的额外公开和描述，并不旨在限制发明人认定其发明的范围，也不旨在表示以下实验是全部或唯一进行的实验。
[0124]
实施例1
[0125]
以下实施例提供了分析单细胞中的蛋白和/或rna的方法，无需区室化单细胞或显微术。该方法可用于分析悬浮的细胞，例如从体液、血液或组织中分离的免疫细胞，或已固定于表面(如，例如载玻片)上的固定的组织或组织切片中分离的细胞。这类方法传统上使用显微术对细胞进行成像。在此，不用显微术，相反，结合模式可通过dna测序进行分析。在本方法中，确定rca产物之间的空间关系以提供图谱(其中每个rca产物可被认为是一个“像素(pixel)”)，并且将捕获剂结合的位点映射到rca产物。该方法利用带有随机条形码(又被称为“独特rca产物标识符序列”或独特分子标识符或“umi”)的rca产物，其自然压缩成紧密的近似球形，具有几百纳米的直径。本方法不依赖于邻近扩散；相反，本方法依赖于与邻近rca产物杂交的网格寡核苷酸。
[0126]
滚环复制产物可通过环化携带dna序列作为标签的多个合成寡核苷酸来预先制备。在本方法中，滚环复制产物(rcp)池由至少数百万个rca产物组成，每个产物都编码有一个或多个鉴定各rca产物的随机条形码。可使用phi-29 dna聚合酶在10分钟内将100个核苷酸的dna环通过rca复制成约200个拷贝的多联体(wu等人nature comm.2019 10:3854)。所得到的rca产物将具有亚微米尺寸。如有必要，可对rcp池进行预先测序，以确定在使用多于一种rca产物的情况下哪些umi配对到一个分子中。在某些情况下，在分析期间生成的数据的最终去卷积中可能需要此信息。根据分子设置，每个rcp也可仅使用一个随机条形码。
[0127]
靶分析物蛋白和/或rna结合有与dna标签连接的蛋白特异性抗体和/或rna结合性核酸探针。每种分析物特异性探针类型都带有用于靶标鉴定的独特固定且已知(非随机)的条形码。这些靶标特异性探针对rcp中的固定区域1具有亲和力。探针通常具有游离3'端，通过杂交与rcp区域1结合介导聚合酶延伸。这种缺口填充延伸反应之后是合并已被umi编码的序列的连接事件，随后pcr扩增用于高通量dna测序。
[0128]
所有rca产物还包含固定区域2，其可与所谓的“网格寡核苷酸”杂交。网格寡核苷酸经由杂交连接两个邻近的rca产物，从而连接它们的随机条形码，使“像素”位置相对于彼此去卷积。由此找出哪些rcp彼此接近。
[0129]
实施例2
[0130]
以下描述提供了分析细胞(如，淋巴细胞)悬液的方法。
[0131]
淋巴细胞平均具有130um3的体积和约124um2的表面积。rcp的平均直径约为200nm
且面积为0.12um2。假设细胞表面有单层rcp，该示例性淋巴细胞可能有约1000个rcp覆盖在其上。
[0132]
v＝4/3 pi r^3
[0133]
a＝pi^1/3x(6v)^2/3
[0134]
因此，估计一个典型的细胞与约1000个rcp结合。
[0135]
在本实施例中，悬浮细胞还使用每个单细胞表面上的靶蛋白的空间分辨率来分析，可能提供有价值的诊断信息。这类信息通常被称为细胞极性并调节许多免疫细胞功能(russel等人journal of cell science 2008 121:131-136和oliaro j.等人pnas december 5,2006 103(49)18685-18690)。使用当前可用的方法，细胞极性分析需要显微术来分析免疫细胞，从而将分析通量限制在仅几个样品中的几个细胞和几个靶标。本方法能够定量数百万免疫细胞上的数百至数千个细胞表面标志物的丰度和相对位置。细胞极性(即，细胞表面蛋白在细胞上的不均匀分布)调控许多重要功能，并且对大量细胞上的大量蛋白进行分析是非常困难的。极化不仅调节细胞迁移，还调节免疫细胞活性，例如抗原呈递和效应器功能。
[0136]
实施例3
[0137]
材料和方法
[0138]
邻近探针的产生。抗体(或其他蛋白结合剂)与特定的核酸序列连接，产生游离3'-端或游离5'-端，或甚至同时具有游离3'-端和5'-端。寡核苷酸与抗体的共价连接可通过多种方式完成，例如nhs-酯/马来酰亚胺化学到抗体中的随机赖氨酸。其他连接也可通过抗体上存在的硫醇或碳水化合物进行。邻近序列可直接连接至抗体或经由杂交连接至与抗体共价连接的另一个寡核苷酸(lundberg等人nucleic acids research 2011 39:e1022011)。还可使用同型双功能(如，bs3)或异型双功能(nhs-酯/马来酰亚胺)或点击化学(fredriksson等人2007 nature methods 2007 4:327-329)。
[0139]
为与抗体偶联而合成的序列应当包含靶蛋白鉴定条形码序列(即，抗体特异性条形码序列)。一些测定设计还可将网格寡核苷酸序列包括到与抗体偶联的序列中(参见图10)。对特定靶蛋白特异的多种抗体将用独特序列进行功能化。然后将这些合并储存。
[0140]
rca产物的产生。该测定中使用的滚环复制产物将预先制成包含随机条形码(独特分子标识符，umi)的独特分子。这些rca产物通过首先合成dna寡核苷酸或从阵列切割的序列的池而制成。接着这些dna分子在与连接dna模板(即，与寡核苷酸末端杂交的“夹板”)杂交之后通过dna连接酶连接环化。然后该环化分子使用dna聚合酶和dntp通过滚环复制进行复制。聚合酶可以是phi29 dna聚合酶，但也可使用其他的聚合酶。聚合反应通过例如加热约60度来停止，并且储存像素-rcp池作为用于测定的检测试剂。
[0141]
rca产物包含环化模板的互补序列的多联拷贝。根据设计，rca产物可能不仅包含umi，还包含用于邻近探针序列和网格寡核苷酸杂交的序列(如一些图中所例示)。
[0142]
缺口填充聚合。在测定过程中，umi序列通过dna聚合复制以掺入pcr扩增子进行随后的dna测序。缺口填充聚合通过向反应中添加dntp、dna聚合酶和dna连接酶来完成。t4 dna聚合酶和klenow片段通常用于此目的，以及t4 dna连接酶通常用于共价封闭缺口。使用的dna聚合酶可具有或不具有3'核酸外切酶活性，但优选不具有链置换活性，因为这会置换要封闭缺口的寡核苷酸。phusion dna聚合酶和ampligase酶的组合也常用于缺口填充反应
(niedzicka等人scientific reports 2016 6:24051)。
[0143]
实施例4
[0144]
该方法的第一种实施如图6所示。在该方法的这种实施(以及可能的其他实施)中，为了使网格寡核苷酸结合到两个邻近滚环扩增产物(其在图中表示为rcp-像素)，而不是结合同一个滚环扩增产物，将滚环扩增产物类型制造为至少两种不同类型，显示为1型和2型，它们的网格寡核苷酸结合序列(gobs)不同。这些序列显示为gobs1和gobs2。这种设计减轻了潜在的竞争性杂交反应，否则会降低检测效率。
[0145]
在本方法中，可预先对所有滚环扩增产物进行测序，以确定各个滚环扩增产物中有哪些umi对。在该方法的这种实施中，将来自邻近滚环扩增产物的umi通过缺口填充/连接反应添加到寡核苷酸中，以产生在末端具有正向和反向pcr引物位点的延伸的网格寡核苷酸。同样，将与抗体缀合的寡核苷酸邻近的umi经由缺口填充/连接反应添加到那些寡核苷酸中，以产生在末端也具有正向和反向pcr引物位点的延伸的抗体寡核苷酸。然后可对延伸的网格寡核苷酸和抗体寡核苷酸进行扩增和测序。
[0146]
对网格-pcr分子进行测序鉴定了邻近rca产物，这些rca产物已与同一网格寡核苷酸分子杂交，并已通过缺口填充dna聚合事件继之以连接由来自相同的两个邻近rcp-像素的umi编码。
[0147]
实施例5
[0148]
该方法的第二种实施如图7所示。在该方法的这种实施(以及可能的其他实施)中：1)靶细胞被邻近探针(偶联到含游离3'端或游离5'端的带靶蛋白身份条形码的寡核苷酸的抗体)或能够结合特定rna序列的核酸探针结合；2)将至少两种类型的预先形成的rca产物添加到样品中，并经由“邻近探针结合序列”(ppbs)与邻近探针的末端杂交；3)将网格寡核苷酸添加到样品中，并使其与任一rca产物类型的gobs1和gobs2杂交。可在步骤1、2、3之间进行任选的洗涤步骤来去除未结合的试剂。5)接着，该方法可包括允许dna聚合酶和dntp延伸杂交的3'-端并允许连接酶合并序列，从而编码具有来自rca产物的umi的pcr扩增子以产生靶扩增子，其经由两个rca产物从一个邻近探针跨越至另一个，其中umi提供了它们的相对位置。由于rca产物具有同一序列的多个拷贝，许多靶蛋白条形码可与相同的umi联合，以提供多个蛋白在由该rca产物覆盖的一个区域中的位置。由于产物跨越至少两个rca产物，可获得邻近rcp网格。6)接着，该方法包括用pcr扩增合并的扩增子，然后对其进行测序，以解码哪些蛋白在哪里的图像。
[0149]
与实施例i一样，为了使网格寡核苷酸与两种邻近rca产物(以及同一rca产物)结合，制造了至少两种rcp-像素类型，它们的网格寡核苷酸结合序列(gobs1和gobs2)不同。将来自rca产物的umi编码到延伸的网格寡核苷酸中。
[0150]
图8示意说明在该方法的这种实施中延伸的网格寡核苷酸的结构。
[0151]
实施例6
[0152]
图9显示该方法的第三种实施。在该方法的这种实施中：1)靶细胞被邻近探针(偶联到含游离3'端或游离5'端的带靶蛋白身份条形码的寡核苷酸的抗体)或能够结合特定rna序列的核酸探针结合。2)将一种类型的预先形成的rca产物添加到样品中，并使其经由网格寡核苷酸和邻近探针结合序列(go&pp bs)与邻近探针末端杂交。由于在多联像素-rcp中有多余的go&pp bs，因此会为下一步添加的网格寡核苷酸留下结合位点；3)将网格寡核
苷酸添加到样品中，并使其与rcp-像素的go&pp bs杂交。可在步骤1、2、3之间进行任选的洗涤步骤来去除未结合的试剂。下一步可包括5)允许dna聚合酶和dntp延伸杂交的3'-端，并允许连接酶合并序列，从而编码具有像素-umi的pcr扩增子。这种连接产生靶扩增子，其经由两个rca产物从一个邻近探针跨越到另一个，这提供了它们的相对位置。由于rca产物具有同一序列的多个拷贝，许多靶蛋白条形码可与相同的umi(来自rca产物)联合，提供多个蛋白在由该rca产物覆盖的一个区域中的位置。由于产物跨越至少两个rca产物，可获得邻近rca产物网格。6)接着，该方法包括通过pcr扩增合并的扩增子，然后对其进行测序以解码哪些蛋白在哪里的图像。同样，将来自rca产物的umi编码到延伸的网格寡核苷酸中。
[0153]
实施例7
[0154]
图10显示该方法的第四种实施。在该方法的这种实施中：1)靶细胞被邻近探针(偶联到含游离3'端或游离5'端的带靶蛋白身份条形码的寡核苷酸的抗体)或能够结合特定rna序列的核酸探针结合；2)将至少两种类型的预先形成的rca产物添加到样品中，并使其经由“邻近探针结合序列”(ppbs)与邻近探针的末端杂交；3)将网格寡核苷酸添加到样品中，并使其与任一rca产物类型的gobs1和gobs2杂交。可在步骤1、2、3之间进行任选的洗涤步骤来去除未结合的试剂；5)接着，该方法包括允许dna聚合酶和dntp延伸杂交的3'-端，并允许连接酶合并序列，从而编码具有来自rca产物的umi的pcr扩增子，由此形成靶扩增子，其经由两个rca产物从一个邻近探针跨越至另一个，以提供它们的相对位置。由于rcp具有同一序列的多个拷贝，许多靶蛋白条形码与同一rca产物umi联合，从而提供多个蛋白在由该rca产物覆盖的一个区域中的位置。由于产物跨越至少两个像素-rcp，获得了邻近rcp网格。6)接着，该方法包括用pcr扩增合并的扩增子，然后对其进行测序以解码哪些蛋白在哪里的图像。与上面的实施例一样，为了使网格寡核苷酸结合两个邻近rca产物而不是同一rca产物，将这些rca产物制造为有不同序列的至少两个区域。在所示实施方案中，它们的gobs序列不同。同样，将来自rca产物的umi编码到延伸的网格寡核苷酸中。
[0155]
实施例8
[0156]
以下实施例描述了图10所示的设计(“设计4”)和上文所述实施例7的实施。
[0157]
抗体结合序列
[0158]
靶特异性探针或抗体将连接到以下序列(经由其游离3'端)：3'aaaaa-atccgcagctacggctagggct 5'(seq id no:1)。可使用寡核苷酸的3'-胺修饰来实现与抗体的化学偶联，但是可使用其他几种化学反应。a-拉伸(a-stretch)是柔性的单链接头区域，而序列的其余部分与靶条形码杂交。
[0159]
网格寡核苷酸
[0160]
网格寡核苷酸(或“桥”寡核苷酸)包含鉴定桥网格寡核苷酸结合的靶标的条形码(即，“tp-bc”)和第一和第二末端序列(“ppbs1”和“ppbs2”)，它们与rca产物中相应的第一和第二网格寡核苷酸结合序列互补。该寡核苷酸以1:1的比例与抗体偶联序列杂交。6xa区域是柔性的单链接头。中间区域tp-bc与连接到抗体的寡核苷酸互补，从而允许网格寡核苷酸与连接到抗体的寡核苷酸杂交。以下序列是网格寡核苷酸的示例：5'(ppbs1)p-tgaaggtagacggaggatttat-aaaaaaa-taggcgtcgatgccgatcccga(tp-bc)-aaaaaaa-caacatcagtattcccaggcta(ppbs2)-3'(seq id no:2)。
[0161]
rca产物制造与应用
[0162]
在本实施例中，该方法使用两种类型的rca产物(其可被称为“1型”和“2型”rca产物)。如图10所示，这些产物具有第一网格寡核苷酸结合序列(ppbs1)和一个扩增引物结合位点(f-pcr)或第二网格寡核苷酸结合序列(ppbs2)。这些rca产物还具有独特rca产物标识符序列nx22。
[0163]
1型rca产物
[0164]
使以下寡核苷酸环化：5
′
p-tggttcgcaggatgag-gccgggagtctaactcaaatac-nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-tgaaggtagacggaggatttat-cgcttcggtgagatag-3'(seq id no:3)，其通过与用作环化夹板的序列ctcatcctgcgaacca-ctatctcaccgaagcg-3'(seq id no:4)的连接模板寡核苷酸杂交。环化寡核苷酸还包含随机生成的umi条形码“nx22”以及ppbs1和正向pcr引物位点(f-pcr”)。还可将1型rca产物的连接模板寡核苷酸用于引发rca反应。
[0165]
扩增后，1型rca产物是以下序列的多联体：5'ctatctcaccgaagcg ataaatcctccgtctaccttca nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn gtatttgagttagactcccggc ctcatcctgcgaacca-3'(seq id no:5)。
[0166]
在本实施例中，延伸与1型rca产物中的f-pcr(序列为gccgggagtctaactcaaatac；seq id no:6)结合的引物，从而在缺口填充聚合/连接反应中复制umi。该反应将第一rca产物中的umi的互补序列添加到网格寡核苷酸的5'端。
[0167]
2型rca产物
[0168]
使以下寡核苷酸环化：5'-p-tagtgagtgtacggac caacatcagtattcccaggcta nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn gtgctgaccaatcgaccaagat cgcctagtctctacta-3'(seq id no:7)，其通过与用作环化夹板的序列5-gtccgtacactcactatagtagagactaggcg-3(seq id no:8)的连接模板寡核苷酸杂交。环化寡核苷酸还包含随机生成的umi条形码“nx22”以及ppbs2和反向pcr引物位点(“r-pcr”)。还可将2型rca产物的连接模板寡核苷酸用于引发rca反应。
[0169]
扩增后，2型rca产物是以下序列的多联体：5'-tagtagagactaggcg-atcttggtcgattggtcagcac-nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-tagcctgggaatactgatgttg-gtccgtacactcacta-3'(seq id no:9)。
[0170]
在本实施例中，网格寡核苷酸的3'端与其在2型产物中的结合位点(ppbs2)杂交并被延伸，从而在缺口填充聚合/连接反应中复制umi。延伸网格寡核苷酸的3'端，直到它遇到序列5'-p-gtgctgaccaatcgaccaagat(seq id no:10)的寡核苷酸的5'端。该延伸产物的3'端连接到寡核苷酸的5'-p端。
[0171]
pcr扩增
[0172]
缺口填充聚合/连接反应将网格寡核苷酸(因此tp-bc序列)与两个umi的互补序列(一个来自1型rca产物，另一个来自1型rca产物)合并。该产物使用以下引物通过pcr进行扩增：f-pcr引物5'gtatttgagttagactcccggc-3'(seq id no:11)和r-pcr引物5'atcttggtcgattggtcagcac-3'(seq id no:12)。
[0173]
在本反应中产生的pcr产物将具有包含这些元件的以下序列：f-引物、像素-1umi、ppbs1、pa-接头、tp-bc、pa-接头、ppbs2、像素-2umi、r-引物。在本实施例中，产物将具有序列gccgggagtctaactcaaatac-nx22-tgaaggtagacggaggatttat-aaaaaaa-taggcgtcgatgccgatcccga-aaaaaaa-caacatcagtattcccaggcta-nx22-gtgctgaccaatcgaccaagat(seq id no:13)。pcr扩增可包含额外的引物序列，这些引物序列
可用于独特地标记各个样品以在测序前使多个样品能够下游合并，即所谓的样品加条形码。
[0174]
数据分析
[0175]
一旦对所得到的pcr产物进行克隆测序，来自1型rca产物和像素rca产物的umi(其互补序列连接到网格寡核苷酸)的组合提供了各个rca产物的相对位置，并可用于产生表面区域的图谱。umi和靶标条形码(tp-bc)的组合提供了在给定像素的非常邻近区域(约100nm)中存在哪些靶蛋白(或mrna)的信息。
[0176]
测定程序
[0177]
可将载玻片上或溶液中的细胞在结合探针(mrna结合探针和/或与核酸连接的抗体)之前固定或不固定。然后细胞可通过添加大量非特异性抗体和dna(如，鲑鱼精子dna)来封闭以减少非特异性结合。接着通常将探针添加到样品中在低温过夜，然后洗涤细胞以去除未结合的探针。接着添加rcp产物，它们与探针序列中其各自的结合位点杂交。根据序列设计使用酶(连接酶和聚合酶)和dntp、atp和nad以及适当的缓冲条件和温度，允许在包括靶蛋白条形码的像素中联合umi。然后可对样品进行洗涤以去除酶和辅因子以及缓冲液，从而为pcr扩增组分(如，热稳定性dna聚合酶和dntp和引物)留出空间。如上所述，在标准扩增之后，对pcr产物进行处理以实现高通量克隆扩增子测序。
[0178]
实施例9
[0179]
该方法的第五种实施如图11所示。在该方法的这种实施中，检测rna。如所示，将网格寡核苷酸设计为结合探针中的位点，该探针与细胞rna杂交。在本实施中，测序结果应当显示在细胞中mrna 1邻近mrna 2，因为与那些mrna结合(经由探针间接地)的网格寡核苷酸在缺口填充/连接反应中延伸时都针对左侧rca产物添加了umi。
[0180]
实施例10
[0181]
该方法的第六种实施如图12所示。在该方法的这种实施中，将网格寡核苷酸断裂成两部分，它们仅在存在夹板的情况下彼此邻近时才结合在一起。图12所示的实施与上述实施例7中所述的实施(以及图10所示)类似，不同之处在于夹板介导的邻近连接测定(pla)步骤，其确保如果对同一靶分子发生两个结合事件，则网格寡核苷酸将是单分子。这增加了测定的特异性。在本实施例中，将网格寡核苷酸断裂成两部分并由pla夹板夹在一起。可将pla夹板设计为仅作为靶向同一蛋白的邻近探针对的夹板，这进一步提高了特异性和多重能力(multiplexability)。
[0182]
实施例11
[0183]
该方法的第七种实施如图13和图14所示。在该方法的这种实施中，图13显示如何制备rca产物。在该实施中，两种类型的rca产物中的每一种都与两个寡核苷酸预先杂交，一个在umi上游，一个在umi下游。在通过缺口填充/连接测定填充缺口后，rca产物具有多个游离3'和/或5'端，其可添加到样品中并允许与靶结合探针相互作用。如图14所示，这些rca产物(具有能够连接的游离3'和/或5'端)与样品杂交，该样品预先与靶特异性探针杂交。在该实施方案中，连接反应经由靶特异性探针将一个rca产物的缺口填充/连接产物连接到另一个rca产物的缺口填充/连接产物。所得到的产物包含两个像素来源的umi以及指示特定靶标的条形码。实施例11的一个好处是，在样品分析期间只进行酶促连接反应，从而简化了反应，但批量预先制备rca产物，使得稍微更复杂。
atcttggtcgattggtcagcac-nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-tagcctgggaatactgatgttg-gtccgtacactcacta-3'(seq id no:9)。
[0199]
在本实施例中，在rca产物的批量生产期间，ppbs2-寡核苷酸(p-ctagacgctgtagttctgtagc-aaaaaaa-caacatcagtattcccaggcta-3'(seq id no:16)的3'端与其在2型rca产物中的结合位点杂交，并且被延伸，从而在缺口填充聚合/连接反应中复制umi。延伸ppbs2-寡核苷酸的3'端，直到它遇到序列5'-p-gtgctgaccaatcgaccaagat(seq id no:10)的寡核苷酸的5'端。该延伸产物的3'端连接到寡核苷酸的5'-p端。
[0200]
这些步骤导致两种类型的rca产物的批量生产，两者都具有多个能够反应并准备好用于样品测定的3'-游离或5'-游离寡核苷酸，如图13所示。
[0201]
形成完整网格寡核苷酸的样品上的连接反应
[0202]
如图14所示，网格寡核苷酸由通过夹板连接反应合并三个寡核苷酸形成。允许靶标结合探针结合样品。将连接夹板寡核苷酸(ppbs1 探针夹板5'gctattcaattgtctcctatgt-cgtttcaatacgttgcatgatc(seq id no:17)和ppbs2 探针夹板gctacagaactacagcgtctag-tgtctgagcgcgcgtaattcat(seq id no:18)添加到靶标结合探针中，以使其能够连接到ppbs1和ppbs2寡核苷酸。这些夹板可优选包含尿嘧啶取代胸苷，以实现连接后的酶促尿嘧啶-n-糖基化酶降解，从而减少错误pcr跳跃的可能性。
[0203]
在含有夹板的靶标探针与样品结合后，添加1型和2型rca产物，如上所述进行功能化的。ppbs1和ppbs2的游离端将分别经由夹板与网格寡核苷酸中间部分(部分1)的每一端结合。添加dna连接酶以将来自1型rca产物的p-umi与tp-bc和2型rca产物的p-umi共价合并。
[0204]
pcr扩增
[0205]
连接反应将网格寡核苷酸组分(因此tp-bc序列)与两个umi(一个来自1型rca产物，另一个来自1型rca产物)的互补序列合并。该产物使用以下引物通过pcr扩增：f-pcr引物5'gtatttgagttagactcccggc-3'(seq id no:11)和r-pcr引物5'atcttggtcgattggtcagcac-3'(seq id no:12)。
[0206]
在本反应中产生的pcr产物将具有包含这些元件的以下序列：f-引物、像素-1umi、ppbs1、pa-接头、连接序列、pa-接头、tp-bc、pa-接头、连接序列、pa-接头、ppbs2、像素-2umi、r-引物。在本实施例中，该产物将具有序列gccgggagtctaactcaaatac-nx22-tgaaggtagacggaggatttat-aaaaaaa-gatcatgcaacgtattgaaacg-acataggagacaattgaatagc-aaaaaaa-tggcaccggaccgtctgaaatg-aaaaaaa-atgaattacgcgcgctcagaca-ctagacgctgtagttctgtagc-aaaaaaa-caacatcagtattcccaggcta-nx22-gtgctgaccaatcgaccaagat(seq id no:19)。pcr扩增可包含额外的引物序列，这些引物序列可用于独特地标记各个样品以在测序前使多个样品能够下游合并，即所谓的样品加条形码。
[0207]
实施例13
[0208]
该方法的第八种实施示于图15和图16。图15显示如何设计rca产物，其类似于图10所示的方法。该版本使用了两种类型的rcp-像素的预先准备步骤，以实现基于dna连接的样品传感。像素首先通过跨umi的缺口填充聚合部分地形成双链。在图16所示的测定步骤中，制备具有能够与网格寡核苷酸杂交的gobs-1或gobs-2位点的两种类型的像素。图16显示样
品被靶分析物传感探针结合，该探针携带网格寡核苷酸。然后将rca产物添加到样品中，使gobs1和gobs2与网格寡核苷酸末端杂交，形成可通过形成pcr扩增子的dna连接反应封闭的切口。可对产物进行测序以确定rca产物的umi。