食管癌基因甲基化检测引物探针组合及其试剂盒与应用的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，具体地涉及一种食管癌基因甲基化检测引物探针组合及其试剂盒与应用。


背景技术：

2.食管癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，影响着全球超过45万人，其发病率也逐年增加，我国是食管癌的高发地区，每年平均病死约15万人。研究发现，食管癌早期患者的五年生存率可达到95％以上，但多数食管癌患者的早期症状不典型，若出现进行性吞咽困难一般已属中晚期，临床上食管癌的最佳治疗方案是手术切除，但患者预后差，五年生存率较低，总生存率不超过15％，因此建立食管癌预警和早期筛查的方法，对食管癌的防治非常重要，早发现、早诊断、早治疗、早手术是防控食管癌的有效手段。
3.目前用于食道癌的检测和筛查方法有影像学检测技术、组织活检、肿瘤血清标识物检测等。这此方法要么设备成本高，操作技术要求强，检测成本高；要么侵入性强，不适于早癌的筛查；要么灵敏度很低，无法满足临床检测需要。因此有必要开发灵敏、特异的新型食道癌标识物和检测技术，提高食道癌早癌检出率、改善食道癌治疗效果、降低食道癌死亡率。
4.表观遗传学是近年来肿瘤研究的热点领域，dna的甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑以及非编码rna调控等表观遗传学改变都被认为与肿瘤的发生有着密切关系，其中dna的甲基化是最为常见的表观遗传学改变，其可调控细胞增殖、凋亡与分化，且水平与肿瘤的生物学特性密切相关。多种研究证明食管癌病变过程是一个多基因变异累积的复杂过程，涉及多种癌基因和抑癌基因的异常甲基化，其中大多数异常甲基化为抑癌基因的高甲基化，高甲基化往往导致抑癌基因的转录沉默。dna甲基化异常通常发生在癌症早期，并贯穿癌症的发生和发展过程，其甲基化状态一旦形成需要受到外界环境较长时间的持续刺激才会发生改变，因此dna甲基化指标的检测可以作为癌症诊断、早期筛查以及预后的重要生物指标。
5.数字pcr技术是继pcr和荧光定量pcr之后的第三代pcr技术，是灵敏度与特异性极高的核酸检测与定量手段，其基本原理是遵循泊松分布规律，通过将核酸样本稀释，将其均匀分配至数万个独立的微反应单元中，在微反应单元内高效灵敏地完成目标核酸片段的pcr扩增，获取荧光信号进行统计学分析，彻底摆脱对标准曲线的依赖而直接给出靶序列的拷贝数，提高了实验结果在批内和批间的稳定性，实现对起始样品的绝对定量，同时提高核酸检测方法的灵敏度，有效减少假阴性的出现。
6.有鉴于此，本发明通过筛选食管癌相关甲基化基因，建立基于数字pcr的食管癌基因甲基化检测方法，期望获取具有更高灵敏度、特异性和准确性的检测试剂，实现食管癌的早期筛查与诊断。


技术实现要素：

7.为达到上述目的，本发明提供食管癌基因甲基化检测引物探针组合及其试剂盒与应用，本发明通过tcga数据库筛选出hoxd10、znf331、ecrg4等3个基因甲基化检测位点，并通过建立基于数字pcr的食管癌基因甲基化检测，得到灵敏度更高的食管癌检测试剂盒，实现食管癌的早期筛查与诊断，利于食管癌的早诊早治。
8.本发明第一方面提供食道癌基因甲基化检测位点，所述的基因甲基化检测位点包括hoxd10、znf331、ecrg4中的一种或多种。
9.本发明第二方面提供食道癌基因甲基化检测的pcr引物探针组合，包括以下1)-3)所示的核酸序列组合中的一种或多种：
10.1)hoxd10甲基化检测的pcr引物及探针，包括引物探针组合2或引物探针组合3，其中所述引物探针组合2包括如seq id no.4所示的上游引物、如seq id no.5所示的下游引物、如seq id no.6所示的荧光探针，所述引物探针组合3包括如seq id no.7所示的上游引物、如seq id no.8所示的下游引物、如seq id no.9所示的荧光探针；
11.2)znf331甲基化检测的pcr引物及探针，包括引物探针组合4或引物探针组合5，其中所述引物探针组合4包括如seq id no.10所示的上游引物、如seq id no.11所示的下游引物、如seq id no.12所示的荧光探针，所述引物探针组合5包括如seq id no.13所示的上游引物、如seq id no.14所示的下游引物、如seq id no.15所示的荧光探针；
12.3)ecrg4甲基化检测的pcr引物及探针，包括引物探针组合7或引物探针组合8，其中所述引物探针组合7包括如seq id no.19所示的上游引物、如seq id no.20所示的下游引物、如seq id no.21所示的荧光探针，所述引物探针组合8包括如seq id no.22所示的上游引物、如seq id no.23所示的下游引物、如seq id no.24所示的荧光探针。
13.在本发明一实施例中，所述的食管癌基因甲基化检测的pcr引物探针组合，还包括检测内参基因gapdh的pcr引物及探针，所述引物包括如seq id no.28所示的上游引物、如seq id no.29所示的下游引物，所述探针包括如seq id no.30所示的荧光探针。
14.在本发明一实施例中，所述荧光探针的5’端包含有荧光报告基团，所述荧光报告基团包括fam、hex、ned、rox、tet、joe、tamra、cy3、cy5中的任意一种。
15.在本发明一实施例中，所述荧光探针的3’端包含有荧光淬灭基团，所述荧光淬灭基团包括mgb、bhq-1、bhq-2、bhq-3中的任意一种。
16.在本发明一优选实施例中，所述荧光淬灭基团为mgb。
17.本发明第三方面提供食管癌基因甲基化检测试剂盒，所述试剂盒包括如本发明第二方面所述的pcr引物探针组合，还包括阳性质控品以及阴性质控品。
18.在本发明一实施例中，所述阳性质控品为人食管癌细胞系dna。
19.在本发明一实施例中，所述阴性质控品为人外周血白细胞dna。
20.在本发明一实施例中，所述食管癌基因甲基化检测试剂盒反应体系的终浓度组成包括：0.1-1μm pcr引物、0.1-1μm探针。
21.在本发明一优选实施例中，所述食管癌基因甲基化检测试剂盒反应体系的终浓度组成包括：0.1-0.5μm pcr引物、0.1-0.5μm探针。
22.在本发明一实施例中，所述食管癌基因甲基化检测试剂盒的数字pcr反应条件如下：
23.在本发明一优选实施例中，所述食管癌基因甲基化检测试剂盒的数字pcr反应条件如下：
24.本发明第四方面提供食管癌基因甲基化检测方法，包括以下步骤：
25.1)分离待测生物样品中目标基因的核酸；
26.2)将步骤1)所得核酸经亚硫酸氢盐转化处理，得到亚硫酸氢盐转化的dna(bis-dna)；
27.3)采用数字pcr技术检测步骤2)所得bis-dna的甲基化状态。
28.在本发明一实施例中，步骤1)所述生物样品包括外周血、新鲜病理组织、石蜡包埋组织、食管脱落细胞。
29.在本发明一优先实施例中，步骤1)所述生物样品为食管脱落细胞。
30.本发明第五方面提供如本发明第一方面所述的食管癌基因甲基化检测位点、如本发明第二方面所述的食管癌基因甲基化检测的pcr引物探针组合、如本发明第三方面所述的食管癌基因甲基化检测试剂盒或如本发明第四方面所述的食管癌基因甲基化检测的检测方法在制备检测食管癌试剂盒中的应用。
31.本发明有益效果如下：
32.1)可作为食管癌的早期筛查、进程监测、预后评估的重要指标：本发明提供的食管癌基因甲基化检测试剂盒以dna甲基化异常作为检测对象，dna甲基化异常通常发生在癌症早期，并贯穿癌症的发生和发展过程，其甲基化状态一旦形成需要受到外界环境较长时间的持续刺激才会发生改变，因此dna甲基化指标的检测可以作为食管癌的早期筛查、进程监测、预后评估的重要生物指标；
33.2)可无创检测：本发明提供的食管癌基因甲基化检测试剂盒可检测多种样品，可通过检测食管脱落细胞、外周血的基因甲基化状态，实现无创检测；
34.3)准确性高：本发明提供的食管癌基因甲基化检测试剂盒基于数字pcr技术，可在微反应单元内高效灵敏地完成目标核酸片段的pcr扩增，获取荧光信号进行统计学分析，彻底摆脱对标准曲线的依赖而直接给出靶序列的拷贝数，提高实验结果在批内和批间的稳定性，实现对起始样品的绝对定量，同时提高核酸检测方法的灵敏度，有效减少假阴性的出
现。
附图说明
35.图1为本发明实施例提供的食管癌基因甲基化检测的单重荧光pcr引物探针组合筛选结果图；
36.图2为本发明实施例提供的食管癌基因甲基化检测的多重荧光pcr引物探针组合筛选结果图；
37.图3为本发明实施例提供的食管癌基因甲基化检测方法的典型检测结果阳性图，其中图3a为目标基因检测结果图，图3b为内参基因检测结果图，图3c为目标基因与内参基因检测的二维结果图；
38.图4为本发明实施例提供的肝癌基因甲基化检测方法的典型检测结果阴性图，其中图4a为目标基因检测结果图，图4b为内参基因检测结果图，图4c为目标基因与内参基因检测的二维结果图。
具体实施方式
39.以下通过具体实施例对本发明进行详细描述，以使本领域技术人员能够容易地根据本说明书的公开内容实施本发明。以下所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或制造厂商所建议条件实施。
40.本发明通过采用亚硫酸氢盐修饰法对待测食管癌核酸样品进行亚硫酸氢盐转化，结合数字pcr技术，通过tcga数据库筛选食管癌高甲基化候选基因，并设计特异性的食管癌基因甲基化检测引物和探针，扩增经亚硫酸氢盐修饰并经微滴化制备的待测dna样本，根据pcr扩增的阳性微滴数来确定待测样本中目标基因的甲基化情况，对食管癌提供辅助诊断。
41.本发明提供的食管癌基因甲基化检测试剂盒的基因甲基化检测位点包括hoxd1、znf331、ecrg4中的一种或多种。
42.本发明提供的食管癌基因甲基化检测试剂盒的pcr引物探针组合，包括以下1)-3)所示的核酸序列组合中的一种或多种：
43.1)hoxd10甲基化检测的pcr引物及探针，包括引物探针组合2或引物探针组合3，其中所述引物探针组合2包括如seq id no.4所示的上游引物、如seq id no.5所示的下游引物、如seq id no.6所示的荧光探针，所述引物探针组合3包括如seq id no.7所示的上游引物、如seq id no.8所示的下游引物、如seq id no.9所示的荧光探针；
44.2)znf331甲基化检测的pcr引物及探针，包括引物探针组合4或引物探针组合5，其中所述引物探针组合4包括如seq id no.10所示的上游引物、如seq id no.11所示的下游引物、如seq id no.12所示的荧光探针，所述引物探针组合5包括如seq id no.13所示的上游引物、如seq id no.14所示的下游引物、如seq id no.15所示的荧光探针；
45.3)ecrg4甲基化检测的pcr引物及探针，包括引物探针组合7或引物探针组合8，其中所述引物探针组合7包括如seq id no.19所示的上游引物、如seq id no.20所示的下游
引物、如seq id no.21所示的荧光探针，所述引物探针组合8包括如seq id no.22所示的上游引物、如seq id no.23所示的下游引物、如seq id no.24所示的荧光探针。
46.本发明提供的食管癌基因甲基化检测试剂盒的pcr引物探针组合，还包括检测内参基因gapdh的pcr引物及探针，所述引物包括如seq id no.28所示的上游引物、如seq id no.29所示的下游引物，所述探针包括如seq id no.30所示的荧光探针。
47.优选地，所述荧光探针的5’端包含有荧光报告基团，包括fam、hex、ned、rox、tet、joe、tamra、cy3、cy5中的任意一种。
48.优选地，所述荧光探针的3’端包含有荧光淬灭基团，包括mgb、bhq-1、bhq-2、bhq-3中的任意一种。
49.进一步优选地，所述荧光淬灭基团为mgb。
50.在本发明的示例性实施例中，数字pcr采用微滴pcr技术(dropletdigital，pcr)，通过将数字pcr混合液加入微滴发生器，生成10000-20000个微反应液滴后进行pcr扩增。pcr扩增反应后，根据荧光信号的类型判断则待测样品中是否含有发生甲基化的dna目标分子，为确定发生甲基化的目标dna分子的数量和含量，同时设置内参基因，依据公式：甲基化比例＝[甲基化拷贝数/甲基化拷贝数 内参基因拷贝数]
×
100％，经试验研究结果确定：目的基因甲基化比例≥4％，判读结果阳性；目的基因甲基化比例＜4％，判读为结果阴性。
[0051]
本发明中，待测dna样本包括：外周血、新鲜病理组织、石蜡包埋组织、食管脱落细胞。
[0052]
实施例1：样本dna提取及亚硫酸氢盐转化
[0053]
1、样本的处理及dna的提取
[0054]
dna提取：通过使用安徽达健医学科技有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(通用型)提取食管脱落细胞dna，具体步骤如下：
[0055]
a)取适量的细胞样本或组织样本，加入500μl裂解液，30μl蛋白酶k，充分混匀后70℃裂解40min。
[0056]
b)短暂离心，加入200μl异丙醇，充分混匀，转移至吸附柱，12000rpm离心1min，弃废液。
[0057]
d)加入600μl漂洗液i漂洗，12000rpm离心30s，弃废液。
[0058]
e)加入600μl漂洗液ii漂洗，12000rpm离心30s，弃废液。
[0059]
f)再次加入600μl漂洗液ii漂洗，12000rpm离心30s，弃废液，12000rpm离心3min。
[0060]
g)开盖，通风橱内晾干2min。
[0061]
h)向吸附柱中加入洗脱液50-100μl，室温静置3min，12000rpm离心2min。
[0062]
i)重复步骤h)，收集dna到离心管中，-20℃保存。
[0063]
2、亚硫酸氢盐转化：通过使用安徽达健医学科技有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(离心柱型)对步骤所得基因组dna进行亚硫酸氢盐转化，具步骤如下：
[0064]
(a)取45μl待测dna样本于新的1.5ml离心管中并加入5μl转化缓冲液，置于金属浴37℃恒温孵育15min；
[0065]
(b)孵育完成后，向每个样本中加入100μl预先制备的转化液，混匀并短暂离心，金属浴50℃避光孵育12-16小时；
[0066]
(c)样本置于冰上(0-4℃)孵育10min；
[0067]
(d)将吸附柱置于收集管中，向吸附柱中加入400μl结合液；
[0068]
(e)将步骤c中的样本加入吸附柱中(含有结合液)，盖紧管盖上下颠倒混匀数次，全速(14000rpm)离心30s，弃废液；
[0069]
(f)向吸附柱中加入100μl漂洗液，全速离心30s，弃废液；
[0070]
(g)向吸附柱中加入200μl脱磺液，室温(20℃-30℃)孵育20min，之后全速离心30s，弃废液；
[0071]
(h)向吸附柱中加入200μl漂洗液，全速离心30s，重复加入200μl漂洗液，全速离心30s，弃废液及收集管；
[0072]
(i)将吸附柱放入1.5ml无菌离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30μl洗脱液，洗脱转化dna，全速离心1min，收集bis-dna，-20℃保存。
[0073]
实施例2：食管癌组织高甲基化候选基因及特异性引物、探针筛选
[0074]
1、食管癌组织高甲基化候选基因的筛选
[0075]
通过tcga数据库(http://cancergenome.nih.gov/)获取与食管癌相关的甲基化芯片数据及其对应的转录组测序数据进行分析，筛选具有显著差异的甲基化位点，最终筛选出hoxd10、znf331、ecrg4作为食管癌组织高甲基化候选基因。
[0076]
2、食管癌甲基化检测的特异性引物、探针筛选
[0077]
1)特异性引物、探针筛选：
[0078]
根据上述hoxd10、znf331、ecrg4的核酸序列，在methyl primer express v1.0软件上进行甲基化引物和探针的设计，经申请人反复设计和推敲，筛选得到相关基因甲基化的数字pcr探针和引物，并将设计好的引物和探针送北京睿博兴科生物技术有限公司合成，具体序列见下表：
[0079]
同时设置针对内参基因gapdh的特异性引物及探针，具体序列如下：名称序列(5’—3’)methy-gapdh-faagttaggttagtttggtagggaagtt(seq id no.28)methy-gapdh-raaccctaaaccacctcccc(seq id no.29)methy-gapdh-ptttgggtttttttgggggtaaggagatgt(seq id no.30)
[0080]
其中上述探针序列的5’端修饰有荧光基团，选自fam、hex、ned、rox、tet、joe、tamra、cy3、cy5中的任一种，3’端标记有荧光淬灭基团，选自mgb、bhq-1、bhq-2、bhq-3中的任一种。
[0081]
2)基于荧光pcr扩增进一步筛选引物探针组合：
[0082]
反应体系：2
×
pcr反应预混液10μl，10μm的gapdh引物及探针各0.1μl，10μm上述引物探针组合中引物各0.5μl，探针各0.2μl，6μl bis-dna，补水至20μl。
[0083]
反应条件：
[0084]
以食管癌确诊患者以及非食管癌的食管脱落细胞dna样本为模板，通过pcr扩增对步骤1)筛选出来的引物探针组合进行筛选，结果如图1所示，hoxd10-1、znf331-3、ecrg4-3的ct值明显大于其余引物探针组合，因此，hoxd10-2、hoxd10-3、znf331-1、znf331-2、ecrg4-1、ecrg4-2筛选为食管癌的pcr鉴定引物。
[0085]
3)多重荧光pcr引物组合优化
[0086]
根据上述步骤2)筛选出来的引物探针组合进行组合配对，并通过pcr扩增进行进一步筛选，组合配见下表：编号多重pcr引物组合p1hoxd10-2、znf331-1、ecrg4-1p2hoxd10-2、znf331-1、ecrg4-2p3hoxd10-2、znf331-2、ecrg4-1p4hoxd10-2、znf331-2、ecrg4-2p5hoxd10-3、znf331-1、ecrg4-1p6hoxd10-3、znf331-1、ecrg4-2p7hoxd10-3、znf331-2、ecrg4-1p8hoxd10-3、znf331-2、ecrg4-2
[0087]
结果如图2所示，组合p3、p5的多重pcr扩增效果较差，因此筛选p1、p2、p3、p4、p6、p8组合作为多重pcr引物组合。
[0088]
4)数字pcr扩增
[0089]
反应体系：2
×
数字pcr反应预混液10μl，10μm的gapdh引物及探针各0.1μl，10μm上述引物探针组合中引物各0.5μl，探针各0.2μl，6μl bis-dna，补水至20μl。
[0090]
微滴制备(以伯乐qx200微滴式数字pcr为例)：将上述每个20μl的反应体系中加入已含有70μl微滴发生油的微滴发生卡上并置于微滴发生器上生成微滴，一般2分钟之内完成，将生成的微滴转移至96孔板中，之后用预热好的px1热封仪对其进行封膜，封好膜后应该在30分钟之内进行pcr反应。
[0091]
反应条件：
[0092]
退火温度依据各引物组合的tm值在54-60℃选择。
[0093]
微滴读取及信号分析：将反应完成的pcr96孔板放入微滴读取仪中，打开quantasoft
tm
软件，按照样本量及样本布局，建立样本模块信息，设置完成后运行。数据读取完成后，自动调节阈值用以对每个检测通道进行阳性和阴性微滴指定。样本调整划分阈值，甲基化数据收集和分析显示在quantasoft
tm
软件界面中。
[0094]
检测结果判读如下：检测样本的总微滴数大于15,000判断该次反应有效。受检样本甲基化拷贝数和内参基因拷贝数之和≥100，则该样本检测结果有效，可以继续结果分析；如果小于100，则该样本检测无效，需要重新检测。样本的甲基化比例由下列公式计算：甲基化比例＝[甲基化拷贝数/甲基化拷贝数 内参基因拷贝数]
×
100％，经试验研究结果确定：目的基因甲基化比例≥5％，判读结果阳性；目的基因甲基化比例＜5％，判读为结果阴性。典型的数字pcr基因甲基化检测结果扩增图如图3、图4所示
[0095]
实施例3：临床样品检测验证试剂盒效果
[0096]
以临床样品检测本发明提供的食管癌基因甲基化检测试剂盒效果：
[0097]
1)食管脱落细胞基因甲基化检测结果：
[0098]
为了评价本发明提供的引物探针组合可用于数字化pcr检测样本中食管癌hoxd10、znf331、ecrg4基因甲基化，将来源于同一样本的dna模板分成12份，在t1-t12不同的引物探针组合下完成其数字pcr的检测，数字pcr检测体系如下：
[0099]
分别在t1-t12数字pcr检测体系中完成了64例食管癌确诊患者和11例正常人食管脱落细胞基因甲基化检测，结果显示在64例食管癌确诊患者中，t1-t12可检出食管癌基因甲基化阳性样本例，检出率为78.13％-96.88％，所有检测条件下总体检出率大于78.13％。在11例非食管癌对照样本中，在t6、t10检测体系中各有1例高于设定的阈值(但其结果值显著低于阳性食管癌的结果)，检测方法的特异性为90.91％；其它检测体系中，没有1例高于设定的阈值，检测方法的特异性为100％，详见下表：
[0100]
2)食管癌外周血基因甲基化检测结果：
[0101]
采用食管脱落细胞基因甲基化检测中的检测体系t1-t12对食管癌外周血基因甲基化进行检测，检测28例确诊为食管癌的患者外周血样本以及5例非食管癌外周血对照样本，结果如下表所示：
[0102]
结果表明在28例食管癌确诊患者中，共检出食管癌基因甲基化阳性样本21-26例，检出率为75.00-92.86％，所有检测条件下总体检出率大于75.00％；在5例非食管癌对照样本中，检测方法的特异性为80.00-100％。上述结果表明，本发明提供的食管癌基因甲基化检测试剂盒在检测食管癌外周血基因甲基化时具备较高的检测灵敏度和检测特异性，可以用于食管癌的早期筛查。
[0103]
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。