一种糖化血红蛋白质控品的制备及其应用的制作方法

1.本发明属于医学检验测定技术领域，具体涉及一种糖化血红蛋白质控品的制备及其应用。


背景技术：

2.糖化血红蛋白(hba1c)是红细胞中的血红蛋白与血清中的糖类(主要指葡萄糖)通过非酶反应相结合的产物。通常认为，糖化血红蛋白浓度可有效地反映过去8～12周平均血糖水平。糖化血红蛋白由hba1a、hba1b、hba1c组成，其中hba1c占约70％，且结构较为稳定，临床上常用作糖尿病控制的监测指标。
3.目前临床上测定糖化血红蛋白(hba1c)含量的方法有多种，如有离子交换色谱法(hplc)、亲和色谱法、电泳法、免疫法、酶法等。在进行临床测定前，每一种测定方法都需要使用校准品进行校准，同时需要用质控品对测量系统进行质量控制。现有的全血校准品和质控品存在保质期短、稳定性差的问题，不利于全血校准品和质控品的临床使用。一般而言，正常人糖化血红蛋白浓度＜6.5％，不同浓度值的获得具有随机性，且不可控，不利于生产。
4.现有技术公开了制备不同浓度的糖化血红蛋白质控品的方法：利用正常人全血提取红细胞并利用离子亲和层析法进一步制备高浓度糖化血红蛋白，但是离子亲和层析法所涉及的仪器昂贵且样本的处理速度较慢，不利于实际放大生产，无法满足实际应用。现有技术虽然提供了一种通过糖基化快速处理血红蛋白制备糖化血红蛋白质控品的制备方法，但其血红蛋白进行糖基化反应时反应液成分中含有还原剂，在后续的提纯工艺中并无去除还原剂步骤，即最终产品(糖化血红蛋白质控品)残留有大量的还原剂；该产品作为胶乳增强免疫比浊法糖化血红测定试剂盒无影响；但是，作为过氧化物酶法糖化血红测定试剂盒质控品时，最终因残留大量还原剂缘故而无法进行测试。过氧化物酶法和胶乳增强免疫比浊法均是常用的糖化血红测定试剂盒使用方法，因此十分有必要提供一种新的制备方法更简单，制备更快速、适用于过氧化物酶法和胶乳增强免疫比浊法的糖化血红蛋白质控品的不同浓度糖化血红蛋白的制备方法。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是克服现有糖化血红蛋白质控品制备的缺陷和不足，提供一种糖化血红蛋白质控品的制备及其应用。
6.本发明的目的在于提供一种糖化血红蛋白质控品的制备方法。
7.本发明的目的还在于提供所述制备方法制备的糖化血红蛋白质控品。
8.本发明的目的还在于提供所述糖化血红蛋白质控品在糖化血红蛋白的质量控制中的应用。
9.本发明的上述目的通过以下技术手段实现：
10.本发明首先制备得到两种浓度糖化血红蛋白浓缩液，然后将两种浓度的糖化血红
蛋白浓缩液稀释后按照特定比例混合制备得到高值糖化血红蛋白质控品溶液和低值糖化血红蛋白质控品溶液；最后通过添加特定比例的甘露醇和聚乙二醇6000制备得到高值糖化血红蛋白质控品冻干粉和低值糖化血红蛋白质控品冻干粉。本发明制备的冻干粉稳定性好，2～8℃保存24个月内糖化血红蛋白值在均值
±
10％范围内，保存时间长。
11.一种糖化血红蛋白质控品的制备方法，包括以下步骤：
12.s1.获取健康人全血红细胞，溶解红细胞，得到血红蛋白溶液，过滤，得糖化血红蛋白溶液1；超滤充分浓缩，得糖化血红蛋白溶液1浓缩液；
13.s2.将步骤s1制备的糖化血红蛋白溶液1与葡萄糖混合，混合液中葡萄糖的终浓度为16～36mmol/l，将混合液于36～38℃孵育30～60天；然后去除未反应的葡萄糖，超滤充分浓缩，得糖化血红蛋白溶液2浓缩液；
14.s3.将步骤s1制备的糖化血红蛋白溶液1浓缩液与步骤s2制备的糖化血红蛋白溶液2浓缩液分别稀释至血红蛋白浓度为110～130g/l，得到糖化血红蛋白溶液1浓缩液的稀释液和糖化血红蛋白溶液2浓缩液的稀释液；将糖化血红蛋白溶液1浓缩液的稀释液与糖化血红蛋白溶液2浓缩液的稀释液以体积比为1:1～1:5混合，得到高值糖化血红蛋白溶液；将糖化血红蛋白溶液1浓缩液的稀释液与糖化血红蛋白溶液2浓缩液的稀释液以体积比为10:1～15:1混合，得到低值糖化血红蛋白溶液；
15.s4.将步骤s3制备的高值糖化血红蛋白溶液与甘露醇和聚乙二醇6000混合，冻干即得高值糖化血红蛋白质控品；将步骤s3制备的低值糖化血红蛋白溶液与甘露醇和聚乙二醇6000混合，冻干即得低值糖化血红蛋白质控品；所述混合的混合液中甘露醇的终浓度为70～100g/l，聚乙二醇6000的终浓度为5～20g/l。
16.所述健康人指血样中无hiv、b型肝炎、c型肝炎等病毒的人。
17.优选地，步骤s1所述过滤是利用0.2～0.3μm的过滤器过滤。
18.进一步优选地，步骤s1所述过滤是利用0.22μm的过滤器过滤。
19.优选地，步骤s1所述超滤充分浓缩是利用25～35kd的超滤离心管进行浓缩。
20.进一步优选地，步骤s1所述超滤充分浓缩是利用30kd的超滤离心管进行浓缩。
21.优选地，步骤s1中，所述糖化血红蛋白溶液1浓缩液与血红蛋白溶液的体积比为1:3～5。
22.进一步优选地，步骤s1中，所述糖化血红蛋白溶液1浓缩液与血红蛋白溶液的体积比为1:4。
23.优选地，步骤s2中，所述糖化血红蛋白溶液2浓缩液与糖化血红蛋白溶液1的体积比为1:3～5。
24.进一步优选地，步骤s2中，所述糖化血红蛋白溶液2浓缩液与糖化血红蛋白溶液1的体积比为1:4。
25.优选地，步骤s2中，混合液中葡萄糖的终浓度为36mmol/l，将混合液于37℃孵育30天。
26.优选地，步骤s2中，混合液中葡萄糖的终浓度为18mmol/l，将混合液于37℃孵育60天。
27.优选地，步骤s2中，利用葡萄糖氧化酶去除未反应的葡萄糖，并去除过氧化氢。
28.进一步优选地，所述葡萄糖氧化酶的使用浓度为8～12ku/l。
29.更进一步优选地，所述葡萄糖氧化酶的使用浓度为10ku/l。
30.优选地，步骤s2所述超滤充分浓缩是利用25～35kd的超滤离心管进行浓缩。
31.进一步优选地，步骤s2所述超滤充分浓缩是利用30kd的超滤离心管进行浓缩。
32.优选地，步骤s3中，将步骤s1制备的糖化血红蛋白溶液1浓缩液与步骤s2制备的糖化血红蛋白溶液2浓缩液分别稀释至血红蛋白浓度为120g/l。
33.优选地，步骤s3中，将糖化血红蛋白溶液1浓缩液的稀释液与糖化血红蛋白溶液2浓缩液的稀释液以体积比为1:1混合，得到高值糖化血红蛋白溶液；将糖化血红蛋白溶液1浓缩液的稀释液与糖化血红蛋白溶液2浓缩液的稀释液以体积比为10:1混合，得到低值糖化血红蛋白溶液。
34.优选地，步骤s4中，所述混合的混合液中甘露醇的终浓度为70～80g/l，聚乙二醇6000的终浓度为5～10g/l。
35.进一步优选地，步骤s4中，所述混合的混合液中甘露醇的终浓度为70g/l，聚乙二醇6000的终浓度为5g/l。
36.利用所述制备方法制备的糖化血红蛋白质控品也在本发明的保护范围之内。
37.所述糖化血红蛋白质控品在糖化血红蛋白的质量控制中的应用也在本发明的保护范围之内。
38.相比现有技术，本发明具有以下有益效果：
39.本发明糖化血红蛋白质控品制备方法简单，不需要复杂的操作和昂贵的仪器可快速制备出糖化血红蛋白质控品；制备的糖化血红蛋白质控品稳定性好，2～8℃保存24个月内糖化血红蛋白值在均值
±
10％范围内，保存时间长；且可以同时用于过氧化物酶法和胶乳增强免疫比浊法的糖化血红测定试剂盒，应用更广泛。
附图说明
40.图1为本发明质控品1糖化血红蛋白质控品冻干粉的稳定性监控图，其中a为低值，b为高值。
41.图2为本发明质控品2糖化血红蛋白质控品冻干粉的稳定性监控图，其中a为低值，b为高值。
42.图3为本发明质控品3糖化血红蛋白质控品冻干粉的稳定性监控图，其中a为低值，b为高值。
43.图4为本发明对比质控品1糖化血红蛋白质控品冻干粉的稳定性监控图，其中a为低值，b为高值。
44.图5为本发明对比质控品2糖化血红蛋白质控品冻干粉的稳定性监控图，其中a为低值，b为高值。
具体实施方式
45.以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
46.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
47.实施例1糖化血红蛋白溶液1浓缩液的制备
48.1.红细胞处理
49.收集健康人的edta抗凝的全血样本200ml，每个样本均进行hiv(hiv1、hiv2)抗体、肝炎b表面抗原(hbsag)和肝炎c病毒(hcv)抗体检测，结果均为阴性的收集使用，若有一项为阳性，则按照相关医疗废弃物的处理规定处理样本。将收集到的全血样本以约1900g进行离心，弃上层血浆，并加入生理盐水，用移液枪反复吹打红细胞清洗，清洗后离心，弃上层生理盐水，重复清洗3次，制备已清洗的红细胞。
50.2.糖化血红蛋白溶液1浓缩液的制备
51.(1)处理液制备
52.取0.2g 3-磺丙基十四烷基二甲甜菜碱和0.028g亚硝酸钠充分溶解于100ml纯水中。
53.(2)糖化血红蛋白溶液1浓缩液的制备
54.将已清洗的红细胞与处理液以体积比1:1充分混合，溶解红细胞，得到血红蛋白溶液，并将得到的血红蛋白溶液(100ml)经0.22μm的过滤器过滤即得糖化血红蛋白溶液1；糖化血红蛋白溶液1使用截留率为30kd超滤离心管进行浓缩处理14000g离心力，离心10min得到糖化血红蛋白溶液1浓缩液(25ml)，2～8℃存储备用。
55.实施例2糖化血红蛋白溶液2浓缩液的制备
56.取实施例1制备的糖化血红蛋白溶液1(100ml)，加入葡萄糖并溶解，葡萄糖的终浓度为18mmol/l，然后将混合溶液放置于37℃孵育60天。孵育结束后添加葡萄糖氧化酶去除未反应的葡萄糖，终止糖基化反应，葡萄糖氧化酶的最终浓度为10ku/l，去除葡萄糖后的溶液置于37℃放置7天消除过氧化氢；最后使用截留率为30kd的超滤离心管进行浓缩处理，14000g离心力，离心10min得到糖化血红蛋白溶液2浓缩液(25ml)；2～8℃存储备用。
57.实施例3糖化血红蛋白溶液2浓缩液的制备
58.取实施例1制备的糖化血红蛋白溶液1(100ml)，加入葡萄糖并溶解，葡萄糖的终浓度为36mmol/l，然后将混合溶液放置于37℃孵育30天。孵育结束后添加葡萄糖氧化酶去除未反应的葡萄糖，终止糖基化反应，葡萄糖氧化酶的最终浓度为10ku/l，去除葡萄糖后的溶液置于37℃放置7天消除过氧化氢；最后使用截留率为30kd的超滤离心管进行浓缩处理，14000g离心力，离心10min得到糖化血红蛋白溶液2浓缩液(25ml)；2～8℃存储备用。
59.实施例4糖化血红蛋白质控液的制备
60.将实施例1制备的糖化血红蛋白溶液1浓缩液和实施例2制备的糖化血红蛋白溶液2浓缩液分别用纯水稀释，制备得到血红蛋白浓度均为120g/l的糖化血红蛋白溶液1浓缩液的稀释液(母液b)和糖化血红蛋白溶液2浓缩液的稀释液(母液a)。使用全自动血液分析仪进行定值，将母液a和b分别使用糖化血红蛋白试剂盒(积水医疗科技(中国)有限公司，838rhq)进行定值，母液a的糖化血红蛋白值为15.9％，母液b的糖化血红蛋白值为4.5％。
61.将母液a与母液b混合，母液b与母液a以体积比为10:1混合得到低值质控液1，经过测定，低值质控液的糖化血红蛋白值为5.5％；
62.母液b与母液a以体积比为1:1混合得到高值质控液，经过测定，高值质控液1的糖化血红蛋白值为11.7％。
63.将母液a与母液b混合，母液b与母液a以体积比为15:1混合得到低值质控液2，经过测定，低值质控液的糖化血红蛋白值为5.1％；
64.母液b与母液a以体积比为1:5混合得到高值质控液，经过测定，高值质控液2的糖化血红蛋白值为16.8％。
65.实施例5糖化血红蛋白质控品冻干粉的制备
66.1.方法
67.(1)冻干粉的制备
68.分别将赋形剂甘露醇和稳定剂聚乙二醇6000加入实施例4制备的高值质控液1和低值质控液1中并充分溶解，将混合液以0.5ml每瓶分装，-55℃～-50℃，真空度小于3帕，冻干24h，然后封盖备用。
69.以混合液中甘露醇终浓度为70g/l，聚乙二醇6000终浓度为5g/l制备的冻干粉为质控品1；
70.以混合液中甘露醇终浓度为80g/l，聚乙二醇6000终浓度为10g/l制备的冻干粉为质控品2；
71.以混合液中甘露醇终浓度为100g/l，聚乙二醇6000终浓度为20g/l制备的冻干粉为质控品3；
72.以混合液中甘露醇终浓度为40g/l，聚乙二醇6000终浓度为2g/l制备的冻干粉为对比质控品1；
73.以混合液中甘露醇终浓度为70g/l，聚乙二醇6000终浓度为30g/l制备的冻干粉为对比质控品2。
74.(2)质控定值
75.各取10瓶冻干粉，分别加纯水0.5ml溶解，用糖化血红蛋白试剂盒测试每瓶质控并定值，靶值为10瓶的均值，质控范围为靶值的
±
10％。
76.(3)冻干粉稳定性的测定
77.将高低值糖化血红蛋白质控品冻干粉置于2～8℃保存，每月随机抽取一瓶，用糖化血红蛋白测定试剂盒进行测试，监控其稳定性。
78.2.结果
79.各糖化血红蛋白质控品冻干粉的定值与范围如表1所示；各糖化血红蛋白质控品冻干粉的稳定性如表2所示；质控品1糖化血红蛋白质控品冻干粉的稳定性监控图如图1，其中a为低值，b为高值；质控品2糖化血红蛋白质控品冻干粉的稳定性监控图如图2，其中a为低值，b为高值；质控品3糖化血红蛋白质控品冻干粉的稳定性监控图如图3，其中a为低值，b为高值；对比质控品1糖化血红蛋白质控品冻干粉的稳定性监控图如图4，其中a为低值，b为高值；对比质控品2糖化血红蛋白质控品冻干粉的稳定性监控图如图5，其中a为低值，b为高值。
80.表1各糖化血红蛋白质控品冻干粉的定值与范围
[0081][0082][0083]
表1显示，冻干后的糖化血红蛋白成品中，质控品1的低值定值均值为5.6、高值定值均值为11.5；质控品2的低值定值均值为6.3、高值定值均值为12.2；质控品3的低值定值均值为6.2、高值定值均值为12；对比质控品1的低值定值均值为6.6、高值定值均值为12.7；对比质控品2的低值定值均值为6.3、高值定值均值为12.2。
[0084]
表2各糖化血红蛋白质控品冻干粉的稳定性
[0085][0086][0087]
从表2数据和图1～5可知，质控品1、质控品2和质控品3保存24个月的定值维持在
为靶值的
±
10％，说明质控品1、质控品2和质控品3保存24个月依旧稳定；而对比质控品1和2在保存14个月后的定值即出现超出靶值的
±
10％的情况，说明对比质控品1和2并不能在24个月内稳定保存，质控品1、质控品2和质控品3的稳定性优于对比质控品1和2。对比质控品1和2与质控品1、2和3相比，仅仅在甘露醇和聚乙二醇6000的浓度上发生改变，说明甘露醇和聚乙二醇6000的浓度对于糖化血红蛋白质控品冻干粉的稳定性有显著影响。
[0088]
综上可知，只有以本发明的甘露醇和聚乙二醇6000的浓度范围添加甘露醇和聚乙二醇6000才能制备出本发明稳定好的糖化血红蛋白质控品冻干粉。所述混合液中甘露醇的最终浓度范围为70～100g/l；聚乙二醇6000的最终浓度范围为5～20g/l。
[0089]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。