复配型内源查尔酮类化合物抗氧化剂、制备方法及用途与流程

1.本发明属于保健食品加工技术领域，具体是指复配型内源查尔酮类化合物抗氧化剂、制备方法及用途。


背景技术：

2.连续自然发生的氧化还原反应对于生物体内代谢系统的控制是至关重要的，目前，大量资料表明，分子可以获得或失去一个电子而被转换成自由基，由于自由基含有未成对电子，所以非常活泼，生物体正常代谢产生的自由基会导致细胞死亡及组织损伤，连续产生过量的自由基会导致上百种疾病，包括癌症，糖尿病，心血管疾病和早衰等，研究发现抗氧化剂可以终止或防止形成自由基，并且通过为自由基供给氢或电子来保卫细胞免受氧化应激影响，然而化学合成的抗氧化剂，如丁基羟基茴香醚和二丁基羟基甲苯，对人体肝、脾、肺等器官均有较大的毒、副作用，因此寻找安全可靠的天然抗氧化剂是目前研究的热点。
3.天然的查尔酮属于黄酮类化合物，广泛存在于水果蔬菜和天然药物中，并且具有抗炎、抗肿瘤、抗血管增生活性、抗溃疡、抗菌、抗疟疾等多种生物学活性，且毒性非常低，但是，结构上与查尔酮相似的其他查尔酮类化合物的功能活性差异非常大，无法从结构上预测诸如抗氧化的药理活性。
4.查尔酮类化合物是查尔酮类化合物中的一种，已经有研究证实查尔酮类化合物具有清除自由基的功能，但是清除效率普遍低下，此外，由于查尔酮类化合物分子的基本化学结构包含两个独立的共轭体系a环和b环，这两个共轭体系之间的连接是灵活的，共轭体系上功能基团的改变将产生明显的功能差异，这种功能差异使得一些查尔酮类化合物对自由基的清理存在选择性，因而无法实现对自由基的彻底清理，适应范围狭窄。
5.为此，本发明提供了复配型内源查尔酮类化合物抗氧化剂、制备方法及用途，为其在食品、药品、保健品等领域开发新的高效性能的天然抗氧化剂提供参考依据。


技术实现要素：

6.发明要解决的问题
7.在如上所述的背景下，本技术的发明人对将查尔酮类化合物的抗氧化功效增强到现有技术的水准以上的方法反复进行了研究探讨，结果发现通过将多种抗氧化活性成分的查尔酮类化合物进行组合并配合枸橼酸及反应维稳增强剂一同使用，会显著增强抗氧化功效并且扩大对自由基的清理种类范围。
8.本发明提供了一种抗氧化性能高、适用范围广的复配型内源查尔酮类化合物抗氧化剂、制备方法及用途。
9.解决问题的技术方案
10.本发明提供了复配型内源查尔酮类化合物抗氧化剂，包括以下重量配比的组分：主抗氧化活性成分5-10份，反应维稳增强剂1-4份，枸橼酸0.5-2份，缓冲溶剂10-15份，所述主抗氧化活性成分与枸橼酸配合，具有直接降解自由基的作用，反应维稳增强剂为降解反
应的进行提供稳定的环境。
11.优选地，所述主抗氧化活性成分为查尔酮类化合物，查尔酮类化合物进行复合重组后实现了更加良好的降解效果。
12.进一步地，所述查尔酮类化合物包括具有如下化学结构式的化合物：
[0013][0014]
进一步地，所述查尔酮类化合物的添加配比为：dc1 1-5份，dc2 2-10份，dc3 1-9份，dc4 1-6份。
[0015]
作为本发明优选地，所述查尔酮类化合物的添加配比为：dc1 1-3份，dc2 3-8份，dc32-7份，dc4 1-4份。
[0016]
优选地，所述查尔酮类化合物的添加配比为：dc1 1-2份，dc2 3-6份，dc3 2-5份，dc41-3份。
[0017]
进一步地，所述反应维稳增强剂为膦酸盐、氯化锌的一种或者多种组合。
[0018]
本发明还提供了复配型内源查尔酮类化合物抗氧化剂的制备方法，包括如下步骤：
[0019]
(1)取柑橘、苹果或者甘草进行水洗、粉碎、烘干获得粉末，将所述粉末使用80％乙醇进行提取后经过滤和离心操作获得上清液，使用旋转蒸发仪蒸发所述上清液中水分后得到粘性物质，在所述粘性物质中加入去离子水并进行混合操作；
[0020]
(2)使用石油醚及乙酸乙酯先后提取步骤一中所述粘性物质三次，然后进行蒸发干燥获得粗酚馏分和粗酚组分；
[0021]
(3)将步骤二中所述的粗酚馏分和粗酚组分使用层析柱进行层析操作，在层析操作中使用甲醇溶液进行洗涤并洗脱，获得查尔酮类化合物；
[0022]
(4)通过高效液相色谱法联合frc-10a自动分数收集器和光电二极管阵列检测器纯化步骤三中获得的查尔酮类化合物；
[0023]
(5)将步骤四中所述查尔酮类化合物与反应维稳增强剂、枸橼酸加入缓冲溶剂中，混合后调整ph为5。
[0024]
优选地，所述层析柱为开放式聚酰胺sephadex lh-20层析柱和siliasphere pc18层析柱的至少一种，所述层析柱的直径为2-3.5cm，所述层析柱的高度为30-120cm，使用柱层析的方法提取查尔酮类化合物，提高了提取的效率和增加了精准度。
[0025]
本发明还提供了复配型内源查尔酮类化合物抗氧化剂的用途，其特征在于，包括
如下任一一条：
[0026]
(1)在制备保健食品中的应用；
[0027]
(2)在制备药品中的应用。
[0028]
与现有技术相比，本发明取得的有益效果：
[0029]
(1)为了解决查尔酮类化合物降解效率低下的问题，本发明通过引入反应维稳增强剂，增加了抗氧化剂的工作环境的稳定性，实现了提高查尔酮类化合物对多种自由基的降解能力的技术效果；
[0030]
(2)同时，本发明基于多组合方式，在没有结构-功能定向启示的情况下，将特定的查尔酮类化合物进行组合配比，打破了查尔酮类化合物共轭体系的单个功能基团对功能的限制，实现了同时提高复配型查尔酮类化合物制备的抗氧化剂降解atbs自由基与dpph自由基的能力；
[0031]
(3)枸橼酸本身可以作为一种抗氧化物质使用，然而与查尔酮类化合物共同使用时，在降解自由基的过程中提供的酸性环境更加有利于查尔酮类化合物协同作用；
[0032]
(4)本发明制备的抗氧化剂可应用于药品、食品等，实现高效清除自由基抗氧化的作用。
附图说明
[0033]
图1为查尔酮类化合物的hplc色谱鉴定结果图；
[0034]
图2为查尔酮类化合物的esi-ms光谱鉴定结果图；
[0035]
图3为dpph法分析复合型内源查尔酮类化合物抗氧化剂的抗氧化能力对比图；
[0036]
图4为abts法分析复合型内源查尔酮类化合物抗氧化剂的抗氧化能力对比图。
[0037]
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
具体实施方式
[0038]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0039]
在本发明实施例中，如无特别说明的原料或处理技术，则表明其均为本领域的常规市售原料或常规处理技术。
[0040]
实施例1
[0041]
从柑橘中提取查尔酮类化合物
[0042]
(1)柑橘果实处理
[0043]
取10-15公斤直径为12-15cm的柑橘果实在液氮中冷冻15-20s，冷冻过程中不断翻转果实，使用破碎机将冷冻后的柑橘果实迅速破碎，加入液氮继续使用研磨棒研磨，然后在室温下使用真空冷冻干燥机进行一周的冷冻干燥；在室温下用80％乙醇(15l)提取三次，持续24h；用玻璃棒搅拌提取液并使用带有三层纱布的漏斗进行过滤后去除粗沉淀物，将过滤后的溶液在8000
×
g下离心10min，吸取上清液；
[0044]
使用旋转蒸发器蒸发上清液以获得粘性物质；向八分之一的粘性物质中加入1l去离子水，不断搅拌使粘性物质分散到浑浊液体中。
[0045]
(3)粗提取
[0046]
用0.4l石油醚提取1l混浊液体三次，然后用0.6l乙酸乙酯提取三次；合并乙酸乙酯馏分并通过蒸发干燥，以获得粗酚馏分fea；将水相冷冻干燥以获得粗酚组分fw。
[0047]
(4)层析洗脱
[0048]
将步骤(3)中所述的fea和fw使用开放式聚酰胺sephadex lh-20层析柱(3.5
×
120cm)进行层析处理，使用不同浓度的甲醇溶液按10％(体积为1l)、30％(体积为2l)、50％(体积为2l)和80％(体积为2l)的顺序进行洗涤，最后使用80％和50％甲醇分别洗脱fea和fw并收集，得到四个部分(fea1
–
fea4)或三个部分(fw1
–
fw3)，其中fea1结晶得到dc1。
[0049]
(5)查尔酮类化合物亚组分获取
[0050]
将fea3干燥并重新溶解在30％甲醇溶液中，然后装入开放式siliasphere pc18层析柱(2.6
×
30cm)；经100ml 30％甲醇洗涤后，使用甲醇浓度为40％(体积为150ml)、50％(体积为150ml)及60％(体积为150ml)洗脱fea3，流速约为3ml/min，得到三个亚组分fea3-1、fea3-2、fea3-3。
[0051]
如图1所示通过高效液相色谱法(hplc)及frc-10a自动分数收集器和光电二极管阵列检测器进一步纯化fea3-1、fea3-2、fea3-3，分别得到dc2、dc3和dc4。
[0052]
使用esi-ms检测获得的成分，如图2所示，通过上述步骤获得dc1、dc2和dc3、dc4。
[0053]
实施例2
[0054]
抗氧化剂的制备及抗氧化能力体外评估测定
[0055]
(1)抗氧化剂的制备
[0056]
将经过实施例1提取获得的查尔酮类化合物与反应维稳增强剂、枸橼酸加入缓冲溶剂中，调整ph为5，查尔酮类化合物5份，反应维稳增强剂1份，枸橼酸1份，缓冲溶剂15份，混合均匀获得抗氧化剂，其中查尔酮类化合物及其添加配比为dc1 1份，dc2 4份，dc3 4份，dc4 1份，查尔酮类化合物总浓度为5μm，反应维稳增强剂为膦酸盐。
[0057]
(2)dpph法体外测定抗氧化能力
[0058]
使用40％甲醇水配制87mm的dpph自由基溶液，调整ph值为5.0，所述dpph自由基溶液作为工作液用于测定查尔酮类化合物的抗氧化能力，将20μl实施例2的步骤(1)中制备的抗氧化剂加入至189μl dpph自由基溶液中，空白对照组不加入抗氧化剂，置于黑暗中反应30min，然后在517nm波长下用多功能酶标仪测定吸光度，设置5个重复。
[0059]
(3)abts法体外测定抗氧化能力
[0060]
abts(2，2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonicacid)，2，2'-联氮-双β-乙基苯并噻唑琳-6-磺酸)是一种化学性自由基引发剂，同时在反应中也是显色剂，abts经活性氧氧化后，可生成稳定的蓝绿色阳离子abts自由基，加入具有抗氧化活性的物质后，可与abts自由基发生反应而使反应体系退色，在734nm处测量吸光度即可反应此变化。
[0061]
将7mm的abts溶液和2.5mm的过硫酸钾溶液混合，置于黑暗中14h，获得abts自由基母液，稀释abts自由基母液到734nm下吸光度为0.90
±
0.05制备得到atbs自由基工作液，调整ph为5.0，取100ul实施例1的步骤(1)中制备的抗氧化剂加入0.9ml abts工作液中，空白
对照组不加入抗氧化剂，置于黑暗中1h，然后723nm下用分光光度计测定吸光度。
[0062]
查尔酮类化合物清除abts自由基和dpph自由基的效率按照下述公式计算：
[0063][0064]
上式中a为加入二氢查尔酮的dpph自由基工作液和abts自由基工作液所测得的吸光度，a0为空白对照组的吸光度。
[0065]
实施例3
[0066]
抗氧化剂的制备及抗氧化能力体外评估测定
[0067]
将经过实施例1提取获得的查尔酮类化合物与反应维稳增强剂、枸橼酸加入缓冲溶剂中，调整ph为5，查尔酮类化合物5份，反应维稳增强剂1份，枸橼酸1份，缓冲溶剂15份，混合均匀获得抗氧化剂，其中查尔酮类化合物及其添加配比为dc1 1份，dc2 2份，dc3 5份，dc4 2份，查尔酮类化合物总浓度为5μm，反应维稳增强剂为膦酸盐，使用dpph法和abts法体外测定抗氧化能力，测定方法参照实施例2。
[0068]
实施例4
[0069]
抗氧化剂的制备及抗氧化能力体外评估测定
[0070]
将经过实施例1提取获得的查尔酮类化合物与反应维稳增强剂、枸橼酸加入缓冲溶剂中，调整ph为5，查尔酮类化合物5份，反应维稳增强剂1份，枸橼酸1份，缓冲溶剂15份，混合均匀获得抗氧化剂，其中查尔酮类化合物及其添加配比为dc1 1份，dc2 3份，dc3 4份，dc4 2份，查尔酮类化合物总浓度为5μm，反应维稳增强剂为膦酸盐，使用dpph法和abts法体外测定抗氧化能力，测定方法参照实施例2。
[0071]
实施例5
[0072]
抗氧化剂的制备及抗氧化能力体外评估测定
[0073]
将经过实施例1提取获得的查尔酮类化合物与反应维稳增强剂、枸橼酸加入缓冲溶剂中，调整ph为5，查尔酮类化合物5份，反应维稳增强剂1份，枸橼酸1份，缓冲溶剂15份，混合均匀获得抗氧化剂，其中查尔酮类化合物及其添加配比为dc1 1份，dc2 5份，dc3 3份，dc4 1份，查尔酮类化合物总浓度为5μm，反应维稳增强剂为膦酸盐，使用dpph法和abts法体外测定抗氧化能力，测定方法参照实施例2。
[0074]
对比例1
[0075]
抗氧化剂的制备及抗氧化能力体外评估测定
[0076]
将经过实施例1提取获得的查尔酮类化合物与反应维稳增强剂、枸橼酸加入缓冲溶剂中，调整ph为5，查尔酮类化合物5份，反应维稳增强剂1份，枸橼酸1份，缓冲溶剂15份，混合均匀获得抗氧化剂，其中查尔酮类化合物为dc1，浓度为5μm，反应维稳增强剂为膦酸盐，使用dpph法和abts法体外测定抗氧化能力，测定方法参照实施例2。
[0077]
对比例2
[0078]
抗氧化剂的制备及抗氧化能力体外评估测定
[0079]
将经过实施例1提取获得的查尔酮类化合物与反应维稳增强剂、枸橼酸加入缓冲溶剂中，调整ph为5，查尔酮类化合物5份，反应维稳增强剂1份，枸橼酸1份，缓冲溶剂15份，混合均匀获得抗氧化剂，其中查尔酮类化合物为dc2，浓度为5μm，反应维稳增强剂为膦酸盐，使用dpph法和abts法体外测定抗氧化能力，测定方法参照实施例2。
[0080]
对比例3
[0081]
抗氧化剂的制备及抗氧化能力体外评估测定
[0082]
将经过实施例1提取获得的查尔酮类化合物与反应维稳增强剂、枸橼酸加入缓冲溶剂中，调整ph为5，查尔酮类化合物5份，反应维稳增强剂1份，枸橼酸1份，缓冲溶剂15份，混合均匀获得抗氧化剂，其中查尔酮类化合物为dc3，浓度为5μm，反应维稳增强剂为膦酸盐，使用dpph法和abts法体外测定抗氧化能力，测定方法参照实施例2。
[0083]
对比例4
[0084]
抗氧化剂的制备及抗氧化能力体外评估测定
[0085]
将经过实施例1提取获得的查尔酮类化合物与反应维稳增强剂、枸橼酸加入缓冲溶剂中，调整ph为5，查尔酮类化合物5份，反应维稳增强剂1份，枸橼酸1份，缓冲溶剂15份，混合均匀获得抗氧化剂，其中查尔酮类化合物为dc4，浓度为5μm，反应维稳增强剂为膦酸盐，使用dpph法和abts法体外测定抗氧化能力，测定方法参照实施例2。
[0086]
对比例5
[0087]
抗氧化剂的制备及抗氧化能力体外评估测定
[0088]
将查尔酮类化合物等浓度更改为抗坏血酸，其他成分保持不变，使用dpph法和abts法体外测定抗氧化能力，测定方法参照实施例2。
[0089]
如图3和图4所示，与单独使用一个组分的查尔酮类化合物相比，复配型的查尔酮类化合物制备的抗氧化剂降解atbs自由基与dpph自由基的能力均得到提高，表明各组分之间存在协同增效功能，不仅互补了单独成分对自由基降解的选择性，而且同时增加了对自由基的降解力，特别是实施例3和实施例4使用的抗氧化剂对atbs自由基和dpph自由基的降解率均表现良好，此外，枸橼酸的使用维持了一个稳定的适用于查尔酮类化合物进行反应的酸性环境，从而更加有利于查尔酮类化合物对自由基的降解。
[0090]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
[0091]
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的应用并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的方法及实施例，均应属于本发明的保护范围。