用于选择性调控蛋白质表达的方法和组合物与流程

sirna靶元件的重组dna分子。在一个实施方案中，mts-sirna靶元件包含在可操作地连接至异源可转录多核苷酸分子的3’非翻译区内。在另一个实施方案中，mts-sirna靶元件位于异源可转录多核苷酸分子与为3’非翻译区的一部分的可操作连接的多腺苷酸化序列之间。在一个实施方案中，mts-sirna靶元件包含选自由seq id no:1-16、23-92及其补体组成的组的序列。在另一个实施方案中，异源可转录多核苷酸分子向植物赋予除草剂耐受性，例如营养性除草剂耐受性。在另一个实施方案中，异源可转录多核苷酸分子向植物不赋予雄性生殖性除草剂耐受性。在另一个实施方案中，异源可转录多核苷酸分子是草甘膦耐受性5-烯醇丙酮酰莽草酸3-磷酸合酶(epsps)。
12.在另一方面，本发明提供包含可操作地连接至异源可转录多核苷酸分子的本发明mts-sirna靶元件的重组dna构建体。
13.在另外的方面，本发明提供产生重组dna分子的方法，所述方法包括将至少一个mts-sirna靶元件可操作地连接至异源可转录多核苷酸分子。在一个实施方案中，mts-sirna靶元件包含选自由seq id no:1-16、23-92及其补体组成的组的序列。
14.在另一方面，本发明提供转基因植物，其包含本发明的mts-sirna靶元件。在一个实施方案中，转基因植物包含可操作地连接至异源可转录多核苷酸分子的mts-sirna靶元件。在另外的实施方案中，mts-sirna靶元件包含选自由seq id no:1-16、23-92及其补体组成的组的序列。在又另一个实施方案中，转基因植物通过用包含可操作地连接至异源可转录多核苷酸分子的至少一个mts-sirna靶元件的重组dna分子或dna构建体转化植物而产生。在另外的方面，本发明提供这种转基因植物的种子、细胞或部分。在一个实施方案中，植物是单子叶植物。在另一个实施方案中，植物是玉蜀黍(maize)(玉米(zea mays))植物。
15.在其他的方面，本发明还提供通过在转基因植物中表达重组dna分子来选择性调控转基因植物的雄性生殖组织中蛋白质的表达的方法，所述重组dna分子包含可操作地连接至异源可转录多核苷酸分子的mts-sirna靶元件。在一个实施方案中，mts-sirna靶元件包含选自由seq id no:1-16、23-92及其补体组成的组的序列。在另一个实施方案中，异源可转录多核苷酸分子向植物赋予除草剂耐受性，例如营养性除草剂耐受性。在另一个实施方案中，异源可转录多核苷酸分子向植物不赋予雄性生殖性除草剂耐受性。在另一个实施方案中，异源可转录多核苷酸分子是草甘膦耐受性epsps。
16.在又另一方面,本发明提供在转基因植物中诱导雄性不育性的方法，所述方法包括将除草剂施加至转基因植物的步骤，所述转基因植物在其基因组中具有重组dna分子，所述重组dna分子包含可操作地连接至异源可转录多核苷酸分子的mts-sirna靶元件，所述异源可转录多核苷酸分子向转基因植物赋予至少第一除草剂耐受性，其中在转基因植物的雄性生殖组织发育之前或与此同时施加除草剂，从而在转基因植物中诱导雄性不育性。在一个实施方案中，异源可转录多核苷酸分子向转基因植物赋予营养性除草剂耐受性，但不赋予雄性生殖性除草剂耐受性。在另一个实施方案中，转基因植物是玉蜀黍植物。在另外的实施方案中，除草剂施加至少防止了经处理转基因植物中的花粉发育、花粉散落或花药挤出。在另一个实施方案中，施加除草剂期间的雄性生殖组织的发育阶段是选自由以下各项组成的组的阶段：玉蜀黍植物发育的v4、v5、v6、v7、v8、v9、v10、v11、v12、v13以及v14阶段。在另一个实施方案中，除草剂选自由以下各项组成的组：乙酰辅酶a羧化酶(acc酶)抑制剂、乙酰乳酸合成酶(als)抑制剂、光系统ii(psii)抑制剂、原卟啉原氧化酶(ppo)抑制剂、4-羟苯基
丙酮酸双加氧酶(hppd)抑制剂、5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(epsps)抑制剂、谷氨酰胺合成酶(gs)抑制剂以及合成生长素。在另一个实施方案中，除草剂是草甘膦，并且异源可转录多核苷酸编码草甘膦耐受性epsps。
17.在一方面，本发明还提供产生杂交种子的方法，所述方法包括将有效量的除草剂施加至转基因植物，所述转基因植物在其基因组中包含重组dna分子，所述重组dna分子包含可操作地连接至异源可转录多核苷酸分子的mts-sirna靶元件，其中在转基因植物的雄性生殖组织发育之前或与此同时施加除草剂，从而在转基因植物中诱导雄性不育性；用来自第二植物的花粉使转基因植物受精；以及允许从转基因植物形成杂交种子。在一个实施方案中，转基因植物是玉蜀黍。在另一个实施方案中，除草剂是草甘膦，并且异源可转录多核苷酸分子是草甘膦耐受性epsps。在另一个实施方案中，在发育的同时以约0.125磅酸当量/英亩至约8磅酸当量/英亩的有效量施加草甘膦。在另一方面，本发明提供通过这种方法产生的杂交种子。在一个实施方案中，杂交种子包含重组dna分子。
18.在以下详细描述中公开了本发明的其他具体实施方案。贯穿本说明书和权利要求，除非上下文另有要求，词语“包含(comprise)”及其变体如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”将被理解成暗示包括所陈述的整数、元件或步骤或整数组、元件组或步骤组，但不排除任何其他整数、元件或步骤或整数组、元件组或步骤组。
19.附图简述
20.图1.雄穗发育阶段t2处的v7、t4处的v8/v9、t5处的v10/v11、t6处的v12和t7处的vt的图解，其示出雄穗大小和形态，其中下组花药横截面的照片显示出花粉发育阶段。先前本领域中用于分离用于鉴定mts-sirna分子的小rna分子的阶段(v10/v11和v12)由具有实线的框指示；本文描述的用于分离小rna分子的阶段(v7、v8/v9、v10/v11和v12)由具有虚线的框指示。
21.图2.mts-sirna序列在以seq id no:17提供的cdna序列上的比对的图形表示。cdna序列指示为核苷酸1至1826，并且短线表示单独mts-sirna序列或相邻mts-sirna序列的伸长区或重叠的mts-sirna序列(相对较长的线)的互补链与cdna序列的比对。没有显示出链与cdna相同的mts-sirna序列。mts-sirna的归一化相对表达水平在左侧指示出。框区表示富含mts-sirna靶标的cdna序列的区域。
22.图3.示出了mrna内的双链mts-sirna、单链mts-sirna、mts-sirna靶序列和mrna的具有可用作mts-sirna靶元件的大量mts-sirna靶序列的区域。
23.图4.来自含有重组dna分子的双拷贝转基因植物的r0玉蜀黍雄穗和用亚历山大染色液染色的花粉的照片，所述重组dna分子包含编码草甘膦耐受性epsps蛋白、可操作地连接至mts-sirna靶元件(seq id no:2)的转基因。事件1至4在v5然后在v8阶段处喷洒0.75lb ae/ac(磅酸当量/英亩)草甘膦除草剂，并且显示出具有完全雄性不育性的雄穗(如通过无花开期所定义的)并且花药中检测到无活力花粉粒或无花粉粒。对照植物没有接受草甘膦施加，并且展现出正常的开花期和花粉散落以及检测到正常的花粉粒的显微镜观察结果。
24.序列简述
25.seq id no:1-与本文中提供为seq id no:17的cdna序列的核苷酸位置1429至1628具有95％序列同一性的mts-sirna靶元件序列。
26.seq id no:2-与本文中提供为seq id no:17的cdna序列的核苷酸位置1429至
1628具有95％序列同一性并且相对于seq id no:1具有单一核苷酸变化(t69a)的mts-sirna靶元件序列。
27.seq id no:3-对应于本文中提供为seq id no:18的cdna序列的核苷酸位置239至433的mts-sirna靶元件序列。
28.seq id no:4-对应于本文中提供为seq id no:18的cdna序列的核苷酸位置477至697的mts-sirna靶元件序列。
29.seq id no:5-对应于本文中提供为seq id no:19的cdna序列的核苷酸位置239至433的mts-sirna靶元件序列。
30.seq id no:6-对应于本文中提供为seq id no:19的cdna序列的核苷酸位置370至477的mts-sirna靶元件序列。
31.seq id no:7-对应于本文中提供为seq id no:20的cdna序列的核苷酸位置1357至1562的mts-sirna靶元件序列。
32.seq id no:8-对应于本文中提供为seq id no:21的cdna序列的核苷酸位置247至441的mts-sirna靶元件序列。
33.seq id no:9-与本文中提供为seq id no:22的cdna序列的核苷酸位置191至490具有99％序列同一性的mts-sirna靶元件序列的反向补体，其中具有三个核苷酸错配(c314a、a350g和g408a)。
34.seq id no:10-16-重组mts-sirna靶元件序列。
35.seq id no:17-含有至少一个富含mts-sirna靶序列的区域的cdna序列。含有由seq id no:1和seq id no:2表示的mts-sirna靶元件序列并且比对到mts-sirna序列seq id no:23-31。
36.seq id no:18-含有至少一个富含mts-sirna靶序列的区域的cdna序列。含有由seq id no:3和seq id no:4表示的mts-sirna靶元件序列并且比对到mts-sirna序列seq id no:32-42。
37.seq id no:19-含有至少一个富含mts-sirna靶序列的区域的cdna序列。含有由seq id no:5和seq id no:6表示的mts-sirna靶元件序列并且比对到mts-sirna序列seq id no:43-52。
38.seq id no:20-含有至少一个富含mts-sirna靶序列的区域的cdna序列。含有由seq id no:7表示的mts-sirna靶元件序列并且比对到mts-sirna序列seq id no:53-60。
39.seq id no:21-含有至少一个富含mts-sirna靶序列的区域的cdna序列。含有由seq id no:8表示的mts-sirna靶元件序列并且比对到mts-sirna序列seq id no:61-69。
40.seq id no:22-含有至少一个富含mts-sirna靶序列的区域的cdna序列。含有由seq id no:9表示的mts-sirna靶元件序列并且比对到mts-sirna序列seq id no:70-87。
41.seq id no:23-92-对应于本发明的mts-sirna序列的dna序列，其比对到本文中提供为seq id no:17-22的cdna序列。
具体实施方案
42.本发明提供用于选择性调控转基因植物的雄性生殖组织中的蛋白质表达，例如异源可转录多核苷酸分子的表达的重组dna分子、组合物和方法及其用途。在一方面，本发明
提供重组dna分子，其包含可操作地连接至异源可转录多核苷酸的雄性组织特异性小干扰rna(mts-sirna)靶元件。此类重组dna分子可用于选择性调控转基因植物的雄性生殖组织中异源可转录多核苷酸的表达。按照规定，核酸序列可以作为dna或作为rna来提供；如本领域普通技术人员所已知，公开一种核酸序列必然定义了另一种核酸序列。此外，如本领域普通技术人员所已知，公开给定的核酸序列必然定义和包括了这个序列的补体。
43.小干扰rna(sirna)是一类长度为约18-26个核苷酸(nt)的rna分子(例如，18、19、20、21、22、23、24、25或26个nt)。sirna序列可以使用由鸟嘌呤(g)、胞嘧啶(c)、腺嘌呤(a)和尿嘧啶(u)组成的rna核苷酸序列或使用鸟嘌呤(g)、胞嘧啶(c)、腺嘌呤(a)和胸腺嘧啶(t)的等同dna核苷酸序列表示。sirna在rna诱导的沉默复合物(risc)中起作用以触发信使rna(mrna)的序列特异性降解，这导致基因表达的破坏和由所述基因编码的蛋白质的下调。
[0044]“雄性组织特异性sirna”或“mts-sirna”是由此具有雄性组织特异性表达图谱植物的雄性生殖组织(例如雄花序)中富含或特异性表达的sirna。雄性组织特异性sirna在植物中已鉴定出并且可以使用本领域中已知的技术诸如低分子量rna印迹分析来检测。“mts-sirna序列”是mts-sirna的核酸序列。呈双链mts-sirna分子的对应dna序列的形式的示例性mts-sirna序列在本文中提供为seq id no:23-92。
[0045]
与mts-sirna序列互补的dna序列在本文中称为“mts-sirna靶标”。mts-sirna靶标包含在基因的dna序列中，并转录成对应mrna分子的rna序列。然后，双链mts-sirna分子的单链可以在典型的生理条件下与mrna分子中的mts-sirna靶标结合或杂交。参见图3。如果核酸序列与mts-sirna序列的比对在mts-sirna序列的长度上产生完全匹配(没有错配，即完全互补)、一个错配、两个错配或三个错配，则所述两个核酸序列是互补的。互补序列可以根据标准watson-crick互补性规则(即鸟嘌呤与胞嘧啶(g:c)和腺嘌呤与胸腺嘧啶(a:t)或尿嘧啶(a:u)配对)来彼此碱基配对。“mts-sirna靶序列”是mts-sirna靶标的核酸序列。示例性mts-sirna靶标序列在本文中提供为seq id no:23-92。
[0046]
在单一dna分子中多于一个的mts-sirna靶标可以群集在一起在或甚至重叠。包含多于一个的mts-sirna靶标的dna分子在本文中称为“mts-sirna靶元件”。mts-sirna靶元件在500个核苷酸序列窗内包含至少两个或更多个mts-sirna靶标。mts-sirna靶元件可以为任何长度，诸如约30个核苷酸(nt)、约40个nt、约50个nt、约60个nt、约70个nt、约80个nt、约90个nt、约100个nt、约150个nt、约200个nt、约250个nt、约300个nt、约350个nt、约400个nt、约450个nt或约500个nt。“mts-sirna靶元件序列”是mts-sirna靶元件的核酸序列。示例性mts-sirna靶元件序列在本文中提供为seq id no:1-16。
[0047]
如本文所用，“重组”dna分子、多肽、蛋白质、细胞或生物体可以是使用基因工程工具的非天然存在或人造的产生物，因此是人类活动的产物并且原本通常不存在于自然界中。“重组dna分子”是指包含在没有人为干预的情况下将不天然一起存在的dna序列或分子组合的dna分子。例如，重组dna分子可为包含相对于彼此异源的至少两个dna分子的dna分子，包含与在自然界中存在的dna序列有偏差的dna序列的dna分子，或通过遗传转化并入宿主细胞的dna中的dna分子。在一个实施方案中，本发明的重组dna分子是包含可操作地连接至至少一个可转录多核苷酸分子的mts-sirna靶元件的dna分子，例如，其中可转录多核苷酸分子对于mts-sirna靶元件是异源的。如本文所用，“重组”分子或细胞或生物体可以是指人造的。
[0048]
如本文所用，术语“异源的”是指两个或更多个dna分子或蛋白质的组合，此时这种组合通常不存在于自然界中时或此时这种组合以不同于自然界中存在的取向或顺序的取向或顺序提供。例如，两个dna分子可来源于不同物种和以合成方式产生，并且/或者两个dna分子可来源于不同基因，例如，来自相同物种的不同基因或来自不同物种的相同基因。在一个实例中，如果调控元件或mts-sirna靶元件与可操作地连接的可转录多核苷酸分子的组合通常不存在于自然界中，即，可转录多核苷酸分子并非天然可操作地连接至调控元件或mts-sirna靶元件而存在，则所述调控元件或mts-sirna靶元件相对于所述可转录多核苷酸分子可以为异源的。在一个实施方案中，这种异源组合可以包含mts-sirna靶元件，其可以是植物来源的或化学合成的，并且可以可操作地连接至可转录多核苷酸分子，诸如编码针对除草剂耐受性的蛋白质的细菌转基因，诸如cp4-epsps(例如，如在本文提供为seq id no 93)。此外，特定序列相对于引入其的细胞或有机体可以是“异源的”(例如，序列在所述特定细胞或有机体中不天然存在)。
[0049]
如本文所用，术语“分离的”是指与通常与其天然状态相关的其他分子分离。例如，分离的dna分子是单独存在的或与其他组合物组合存在的分子，但不处于其天然基因组位置或状态。在一个实施方案中，术语“分离的”是指将dna分子与在天然状态下通常侧接所述dna分子的核酸分开。例如，分离的dna分子可以是由至少两个彼此异源的dna分子组成的dna分子。在另一个实例中，分离的dna分子可以是已经通过遗传转化掺入到宿主细胞中的新颖基因组位置中的dna分子。因此，融合至或可操作连接至在自然界中将不缔合的一个或多个其他dna分子(例如作为重组dna或植物转化技术的结果)的dna分子在本文中被认为是分离的。甚至当整合到宿主细胞的染色体中或与其他dna分子一起存在于核酸溶液中时，此类分子也被认为是分离的。
[0050]
术语“可操作地连接的”是指至少两个核苷酸分子以使得一个核苷酸分子可以影响另一个核苷酸分子的作用的方式布置或连接。所述两个核苷酸分子可以是单一连续核苷酸分子的一部分并且可以是邻近的或分开的。例如，mts-sirna靶元件可以与可转录多核苷酸分子可操作地连接。在一个实施方案中，可操作地连接的mts-sirna分子可影响可转录多核苷酸分子的转录、翻译或表达。例如，如果在雄性生殖组织细胞中转录后，mrna分子中mts-sirna靶元件的存在导致由内源性mts-sirna和risc途径诱导的对细胞中可转录多核苷酸分子表达的调控，则mts-sirna靶元件可操作地连接至可转录的多核苷酸分子。mts-sirna靶元件和可转录多核苷酸分子的可操作连接可以例如通过以下方式实现：将mts-sirna靶元件掺入成与可转录多核苷酸分子相邻(诸如位于可转录多核苷酸分子的5'或3处'，但不一定处于连续连接)、在多核苷酸分子的非翻译区(utr)中或与所述非翻译区相邻(诸如位于5'utr或3'utr中或紧靠5'utr或3'utr)、和/或在可转录多核苷酸分子的3’处和聚腺苷酸化信号的5’处。在一个实施方案中，mts-sirna靶元件位于可转录多核苷酸分子与聚腺苷酸化序列之间，所述聚腺苷酸化序列在可转录多核苷酸分子的3’处并与其相邻。在另一个实施方案中，mts-sirna靶元件位于可转录多核苷酸分子的终止密码子与聚腺苷酸化序列之间。在另一个实施方案中，mts-sirna靶元件位于与可转录多核苷酸分子相邻的3’utr序列内。
[0051]
鉴定mts-sirna、mts-sirna靶标和mts-sirna靶元件的实例在本文中提供并且可以通过本领域技术人员已知的方法例如通过植物srna和cdna库的生物信息学分析来鉴定。
具体地，可以从srna文库鉴定出mts-sirna并对其进行测序。可以将鉴定的mts-sirna序列与cdna和/或基因组序列集合进行比较，以鉴定可用于开发如本文所述的重组dna分子和构建体的mts-sirna靶标和mts-sirna靶元件。
[0052]
在一些实施方案中，产生、合成或体外修饰mts-sirna靶元件。例如，可以对mts-sirna靶元件进行修饰以包含更多、更少或不同的mts-sirna靶序列或重排一个或多个mts-sirna靶序列的相对位置。在一些实施方案中，这种修饰可能有益于增加或减少mts-sirna靶元件的作用。用于产生、合成或体外修饰mts-sirna靶元件和确定用于所需调控水平的最佳变异性的方法是本领域技术人员已知的。示例性重组mts-sirna靶元件可以通过以下方式产生：将两个或更多个mts-sirna靶标、两个或更多个mts-sirna靶元件、两个或更多个富含mts-sirna靶标的cdna区域、或一个或多个mts-sirna靶标和两个或更多个富含mts-sirna靶标的cdna区域的片段的dna序列或其片段相组合，诸如通过将在本文中提供为seq id no:1-9的mts-sirna靶元件中的两个或更多个的全部或片段相组合、通过将在本文中提供为seq id no:23-92的mts-sirna序列中的两个或更多个相组合，或者通过将在本文中提供为seq id no:1-9的mts-sirna靶元件中的两个或更多个的全部或片段与在本文中提供为seq id no:23-92的mts-sirna序列中的一个或多个相组合。这种示例性重组mts-sirna靶元件在本文中提供为seq id no:10-16。
[0053]
mts-sirna靶元件的dna序列也可以通过在mts-sirna靶序列(相对于给定的mts-sirna序列)中掺入1-3个核苷酸错配而变化。在另一个实施方案中，本发明包括重组dna分子或mts-sirna靶元件，其与本发明的dna分子、mts-sirna靶元件(诸如seq id no:1-9)、重组mts-sirna靶元件(诸如seq id no:10-16)或cdna序列(诸如seq id no:17-22)中的任一种具有至少约80％(百分比)序列同一性、约85％序列同一性、约90％序列同一性、约91％序列同一性、约92％序列同一性、约93％序列同一性、约94％序列同一性、约95％序列同一性、约96％序列同一性、约97％序列同一性、约98％序列同一性和约99％序列同一性。
[0054]
在另一个实施方案中，本发明提供本文所公开的dna分子的片段。如上所述，此类片段可以用作mts-sirna靶元件，或者可以与其他mts-sirna靶元件、mt-sirna序列或其片段组合用于构建重组mts-sirna靶元件。在具体实施方案中，此类片段可以包含本文所公开的dna分子诸如本文所公开的mts-sirna靶元件或cdna序列的至少约20、至少约30、至少约40、至少约50、至少约60、至少约70、至少约80、至少约90、至少约100、至少约110、至少约120、至少约130、至少约140、至少约150、至少约160、至少约170、至少约180、至少约190、至少约200、至少约210、至少约220、至少约230、至少约240、至少约250、至少约260、至少约270、至少约280、至少约290、至少约300、至少约350、至少约400、至少约450、至少约500个连续核苷酸或更长的连续核苷酸。从起始dna分子产生此类片段的方法在本领域中是熟知的。
[0055]
本文描述的修饰、复制、缺失或重排对于具体可转录多核苷酸分子的所需表达方面的功效可以经验为主地在稳定和瞬时植物测定中测试，诸如本文中的工作实施例中所描述的那些，以便验证结果，所述结果可取决于产生的变化和起始dna分子中的变化的目标而不同。
[0056]
mts-sirna靶标和mts-sirna靶元件可以在任一方向上发挥作用，这意指其是不定向的，并且因此可以在重组dna分子或dna构建体中按5’至3’取向或3’至5’取向来使用。
[0057]
如本文所用，“可转录多核苷酸分子的表达”或“蛋白质的表达”是指蛋白质由细胞
中的可转录多核苷酸分子和所得转录物(mrna)的产生。如本文所用，术语“蛋白质表达”因此是指转录rna分子翻译至蛋白质分子中的任何模式。蛋白质表达可通过其时间、空间、发育或形态性质，以及通过定量或定性指示来表征。在一个实施方案中，本发明的重组dna分子可用于选择性调控转基因植物的雄性生殖组织中蛋白质或可转录多核苷酸分子的表达。在这种实施方案中，重组dna分子在转基因植物中的表达可导致至少营养组织中可操作地连接的可转录多核苷酸分子的表达，但不能在雄性生殖组织中表达。在某些实施方案中，蛋白质表达的这种调控是指抑制或降低；例如通过例如rnai介导的转录后基因调控来抑制或降低细胞中产生的蛋白质的水平。
[0058]
如本文所用，蛋白质表达的选择性调控是指与参考细胞或组织相比较，使细胞或组织中蛋白质的产生减少，减少至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％(即，完全减少)。参考细胞或组织可以为(例如)来自表达蛋白质的相同或相似转基因植物的营养细胞或组织，或者来自具有编码蛋白质的相似转基因、但缺少可操作地连接的mts-sirna靶元件的转基因植物的细胞或组织。蛋白质表达的调控可以使用本领域技术人员已知的任何技术诸如通过使用诸如elisa或蛋白质印迹分析的技术直接测量细胞或组织样品中的蛋白质累积、通过测量蛋白质的酶活性，或通过表型地确定蛋白质表达来确定。在一个实施方案中，蛋白质表达的选择性调控是指在转基因植物的雄性组织中的、能够赋予除草剂耐受性的蛋白质的表达的充分减少，以在转基因植物中产生雄性能育性改变的可检测的表型，除草剂作为诱导不育性喷雾剂施加至所述转基因植物。对这种转基因植物中雄性能育性改变的检测将因此指示蛋白质表达的选择性调控。
[0059]
如本文所用，术语“编码蛋白质的转基因”或“可转录多核苷酸分子”是指能够被转录成rna分子的任何核苷酸分子，包括但不限于具有编码多肽序列的核苷酸序列的那些。根据条件，在细胞中核苷酸序列实际上可能或可能不翻译成多肽分子。转基因或可转录多核苷酸分子的边界常常由5'末端处的翻译起始密码子和3'末端处的翻译终止密码子划定。
[0060]
术语“转基因”是指由于人工干预，例如通过植物转化方法人工整合到生物体或宿主细胞(当代或任何前代生物体或细胞)的基因组中的dna分子。如本文所用，术语“转基因”是指包含转基因，例如“转基因植物”是指在其基因组中包含转基因的植物，并且“转基因性状”是指通过存在整合到植物基因组中的转基因而传递或赋予的特征或表型。作为这种基因组改变的结果，转基因植物与相关的野生型植物明显不同，并且转基因性状是在野生型植物中非天然存在的性状。本发明的转基因植物包含本发明提供的重组dna分子。
[0061]
本发明的转基因或可转录多核苷酸分子包括但不限于提供与植物形态学、生理学、生长与发育、产量、营养特性、抗病性、抗虫性、除草剂耐受性、胁迫耐受性、环境胁迫耐受性或化学耐受性相关联的所需特征的转基因或可转录多核苷酸分子。在一个实施方案中，本发明的可转录多核苷酸分子编码蛋白质，当在转基因植物中表达时，所述蛋白质至少在存在表达的蛋白质的细胞和/或组织中赋予除草剂耐受性；选择性调控转基因植物的雄性生殖组织中的除草剂耐受性蛋白，结合适时施加除草剂导致至少诱导减少的雄性能育性或诱导雄性不育性。
[0062]
所述可诱导的雄性不育性与营养性除草剂耐受性相组合可以用于提高产生杂交种子的效率，例如通过消除或减少杂交种子产生过程中将给定杂交种中用作雌性的玉蜀黍植物物理地去雄的需要。例如美国专利号6,762,344；美国专利号8,618,358；和美国专利公
开2013/0007908中已经描述了除草剂可诱导的雄性不育性系统。用于实践本发明的除草剂的实例包括但不限于：乙酰辅酶a羧化酶(acc酶)抑制剂(例如fop和dim)、乙酰乳酸合成酶(als)抑制剂(例如磺酰脲(su)和咪唑啉酮(imi))、光系统ii(psii)抑制剂(例如三嗪和苯基醚)、原卟啉原氧化酶(ppo)抑制剂(例如丙炔氟草胺(flumioxazsin)和氟黄胺草醚)、4-羟苯基丙酮酸双加氧酶(hppd)抑制剂(例如异噁唑草酮和三酮诸如甲基磺草酮(mesotrione))、5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(epsps)抑制剂(例如草甘膦)、谷氨酰胺合成酶(gs)抑制剂(例如草铵膦(glufosinate)和草丁膦(phosphinothricin))、合成生长素(例如2,4-d和麦草畏)。用于实践本发明的转基因或可转录多核苷酸分子的实例包括但不限于编码赋予hppd抑制剂耐受性的蛋白质(诸如对除草剂不敏感的hppd)的基因、编码赋予草铵膦耐受性的蛋白质的基因(诸如pat和bar)、编码赋予草甘膦耐受性的蛋白质的基因(诸如草甘膦耐受性epsps，诸如cp4-epsps，在本文中提供为seq id no:93)，以及编码赋予合成生长素耐受性的基因，所述合成生长素诸如麦草畏(诸如麦草畏单加氧酶(dmo))和2,4-d的蛋白质(诸如(r)-2,4-滴丙酸双氧化酶基因(rdpa))。
[0063]
本发明的重组dna构建体可以包含本发明的重组dna分子并且通过本领域中已知的技术来制备并且在各种实施方案中包含在植物转化载体、质粒或质体dna中。此类重组dna构建体可用于产生转基因植物和/或细胞，并且因此也可以含在转基因植物、种子、细胞或植物部分的基因组dna中。因此，本发明包括其中重组dna构建体位于植物转化载体内，或用于转化植物细胞的生物弹道颗粒上，或转基因植物细胞的染色体或质体内，或转基因细胞、转基因植物组织、转基因植物种子、转基因花粉粒或转基因或部分转基因的(例如接枝的)植物内的实施方案。载体是可以用于植物转化(即将dna引入到细胞)目的的任何dna分子。本发明的重组dna构建体可以(例如)插入到植物转化载体中并且用于植物转化以产生转基因植物、种子以及细胞。用于构建植物转化载体的方法在本领域中是熟知的。本发明的植物转化载体总体上包括但不限于用于表达操作地连接的dna的合适的启动子、操作地连接的重组dna构建体以及多聚腺苷酸化信号(可能包含在3’utr序列内)。可用于实践本发明的启动子包括在植物中起作用来表达可操作地连接的多核苷酸的那些启动子。此类启动子是不同的并且在本领域中是熟知的，并且包括为诱导型、病毒型、合成型、组成型、时序调控型、空间调控型和/或时空调控型的那些启动子。另外任选的组分包括但不限于以下靶标中的一种或多种：5’utr、增强子、顺式作用靶标、内含子、信号序列、转运肽序列以及一个或多个选择性标记基因。在一个实施方案中，植物转化载体包含重组dna构建体。
[0064]
本发明的重组dna构建体和植物转化载体通过适于预期应用的任何方法来制备，其中将(例如)所需表达的类型、所需转基因或可转录多核苷酸分子以及在有待表达重组dna构建体的植物中的使用便利性考虑在内。可用于操纵用于制造和使用重组dna构建体和植物转化载体的dna分子的一般方法在本领域中是熟知的并且(例如)在手册和实验指南，包括michael r.green和joseph sambrook,“molecular cloning:a laboratory manual”(第四版)isbn:978-1-936113-42-2,cold spring harbor laboratory press,ny(2012)中进行了详细描述。
[0065]
例如，为了增加dna操纵(诸如限制性酶识别位点或基于重组的克隆位点)的便利性，或为了包括植物优选的序列(诸如植物密码子使用或kozak共有序列)或包括对重组dna分子和构建体设计有用的序列(诸如间隔子或连接子序列)，可以通过本领域中已知的方法
来完全或部分地修饰本发明的重组dna分子和构建体。在某些实施方案中，重组dna分子和构建体的dna序列包括已针对有待表达重组dna分子和构建体的植物进行密码子优化的dna序列。例如，植物中有待表达的重组dna分子和构建体可以通过本领域中已知的方法来使其序列的全部或部分进行密码子优化以用于在植物中进行表达。例如可以通过表达或调控其他基因来使本发明的重组dna分子或构建体堆叠有其他重组dna分子或转基因事件以用于赋予另外的性状(例如，在转化植物的情况下，包括除草剂抗性、抗虫性、冷发芽耐受性、缺水耐受性的性状)。
[0066]
本发明的一方面包括有包括本发明的重组dna分子转基因植物细胞、转基因植物组织以及转基因植物或种子。本发明的另一面包括有包括本发明的重组dna分子的人工或重组植物染色体。用于转化宿主植物细胞以用于本发明的适合的方法实际上包括可以将dna引入到细胞中(例如，其中将重组dna分子稳定整合到植物染色体中)的任何方法并且在本领域中是熟知的。用于将重组dna分子引入到植物的示例性且广泛使用的方法是本领域技术人员熟知的土壤杆菌转化(agrobacterium transformation)系统。用于将重组dna分子引入到植物中的另一个示例性方法是通过定点整合方法将重组dna分子在预定位点插入植物基因组中。定点整合可以通过本领域已知的任何方法来完成，例如，通过使用锌指核酸酶、工程化或天然大范围核酸酶、tale-内切核酸酶或rna引导的内切核酸酶(例如crispr/cas9系统)。转基因植物可以通过植物细胞培养方法从转化的植物细胞再生。相对于转基因来说是纯合的转基因植物可以通过使含有单一外源性基因序列的独立分离的转基因植物与其本身例如f0植物或f0植物有性交配(自花授粉)以产生r1或f1种子来获得。所产生的r1或f1种子的四分之一相对于转基因来说将是纯合的。通常，可以使用允许杂合子与纯合子之间的差异的snp测定或热扩增测定(即接合性测定)来测试由发芽的r1或f1种子生长成的植物的杂合性。
[0067]
本发明提供在其基因组中具有本发明的重组dna分子的转基因植物，所述转基因植物尤其包括但不限于紫花苜蓿、棉花、玉蜀黍、芸苔、水稻、大豆、小麦。本发明还提供了所述转基因植物的转基因植物细胞、植物部分以及子代。如本文所使用，“子代”包括包含本发明的重组dna分子的任何植物、种子、植物细胞和/或从植物、种子、植物细胞和/或植物部分产生或再生的植物部分。由此类植物产生的转基因植物、细胞、部分以及种子针对本发明的重组dna分子可以为纯合或杂合的。本发明的植物部分包括但不限于叶、茎、根、种子、胚乳、胚珠和花粉。本发明的植物部分可为有活力的、无活力的、可再生的和/或不可再生的。本发明还包括并且提供包含本发明的dna分子的转化植物细胞。本发明的转化或转基因植物细胞包含可再生和/或不可再生植物细胞。
[0068]
本发明还包括其中重组dna分子处于由本发明的转基因植物、种子或植物部分生产的商品产品中的实施方案；此类商品产品包括但不限于植物的收获部分、植物的压碎或完整的粒或种子或包含本发明的重组dna分子的任何食物或非食物产品。
[0069]
本发明提供在转基因植物中诱导雄性不育性的方法，其包括(a)使包含重组dna分子的转基因植物生长，所述重组dna分子包含与mts-sirna靶元件可操作地连接的赋予除草剂耐受性的异源可转录多核苷酸分子，和(b)向转基因植物施用有效量的除草剂以诱导雄性不育性。有效量的除草剂是足以使包含本发明的重组dna分子的转基因植物雄性不育性的量。在一个实施方案中，草甘膦的有效量为约0.125磅酸当量/英亩至约8磅酸当量/英亩。
除草剂施加可以在雄性生殖组织发育之前或期间施用，诸如在选自由玉蜀黍植物发育的v4、v5、v6、v7、v8、v9、v10、v11、v12、v13和v14阶段组成的组的阶段处施用，并且可以防止至少花粉发育、花粉散落或花药挤出。
[0070]
在一个实施方案中，防止花粉发育、花粉散落或花药挤出可以是雄性不育性所引起，因此不存在花粉发育、花粉散落或花药挤出可以是雄性不育性的指示。然而，在一些情况下，雄性不育性植物仍可能产生少量花粉。因此，在某些实施方案中，少量花粉的存在不一定指示雄性能育植物或缺乏雄性不育性。
[0071]
植物发育通常由基于植物发育的阶段的标度(scale)来确定。对于玉蜀黍而言，本领域中使用的常见的植物发育标度被称为v-阶段。v阶段根据其中叶枕可见的最上面的叶来定义。ve对应出现，v1对应第一叶，v2对应第二叶，v3对应第三叶，v(n)对应第n叶。vt在雄穗的最后一个分支可见时但在穗丝出现之前发生。当对玉米田进行分阶段时，每个特定的v级只有当田间中有50％或更多的植物处于或超过这个阶段时才被定义。其他发育标度是本领域技术人员已知的并且可以与本发明的方法一起使用。
[0072]
用于预测和估计玉蜀黍生长和发育阶段的另一常用工具为生长度单位(gdu)。玉蜀黍生长发育的一个因素是热量。热量通常在单个时间点测量并以温度表示，但也可以在一段时间内测量并以热量单位表示。这些热量单位通常被称为gdu。gdu可以被定义为平均日温度与受到某些限制的选定基准温度之间的差异。gdu使用以下公式计算：生长度单位＝{(h l)/2}
–
b，其中h是日高(但不高于86℉)，l是日低(但不低于50℉)，并且b是50℉的基准。因为当温度大于86℉或小于50℉时玉米生长较小，因此对式中使用的日高温和日低温设定限值。日温度的下截止值也防止了负值的计算。因此，如果日高温度超过86℉，则gdu式中使用的日高温度将设定在86℉。相反地，如果日低温度降至低于50℉，则gdu式中使用的日低温度将被设定在50℉。如果日高温度不超过50℉，则不记录这天的gdu。玉蜀黍植株一天中可以累积的最大gdu为36，最小为零。玉蜀黍植物的成熟度等级是通过规定量的时间内的日gdu值之和确定的。大多数玉蜀黍种子生产者使用的时间段是从种植到生理成熟的时间，或者是籽粒灌浆几乎完成的时间。例如，在美国大多数州，对于大多数地理区域都保留了累积的gdu，并且其可以从usda作物报告服务部或国家推广服务部获得。另外，在美国专利号6,967,656中也描述了用于在特定位置获得gdu信息的仪器，所述专利据此以引用的方式整体并入本文。
[0073]
用于预测雄穗发育以确定对雄性不育性诱导除草剂施加的定时的另一种方法在美国专利号8,618,358中有所描述，所述专利据此以引用的方式整体并入本文。
[0074]
用于本发明的除草剂包括任何除草剂，包括具有抗乙酰辅酶a羧化酶(acc酶)的活性的那些、乙酰乳酸合成酶(als)抑制剂、光系统ii(psii)抑制剂、原卟啉原氧化酶(ppo)抑制剂、4-羟苯基丙酮酸双加氧酶(hppd)抑制剂、5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(epsps)抑制剂、谷氨酰胺合成酶(gs)抑制剂以及合成生长素。除草剂在本领域中是熟知的，并且在例如由wolfgang ulrich schirmer,peter jeschke,matthias witschel,isbn:9783527329656,wiley-vch verlag gmbh&co.kgaa,德国(2012)编辑的“modern crop protection compounds,第1卷(第二版)中有所描述。在一个实施方案中，除草剂是草甘膦。
[0075]
杂交种子可以通过使用包括以下各项的方法产生：(a)将除草剂施加至包含重组
dna分子的转基因植物，所述重组dna分子包含可操作地连接至mts-sirna靶元件、赋予除草剂耐受性的异源可转录多核苷酸分子，其中在转基因植物的雄性生殖组织的发育期间进行除草剂施加，从而在转基因植物中诱导雄性不育性；(b)用来自第二植物的花粉使转基因植物受精；以及(c)从转基因植物收获杂交种子。在一个实施方案中，转基因植物是玉蜀黍。在一个实施方案中，除草剂是草甘膦，并且由异源可转录多核苷酸分子编码的蛋白质是草甘膦耐受性epsps。在一个实施方案中，在发育期间以约0.125磅酸当量/英亩至约8磅酸当量/英亩的有效量施加草甘膦。在另一个实施方案中，受精步骤可以通过允许自然受精，例如通过风力授粉来完成，或者可以包括机械授粉或人工授粉。
[0076]
杂交种子可以从已经用来自第二植物的花粉受精的雄性不育性转基因植物收获，其中雄性不育性转基因植物包含重组dna分子，所述重组dna分子包含可操作地连接至mts-sirna靶元件、赋予除草剂耐受性的异源可转录多核苷酸，并且其中通过在雄性生殖组织的发育期间施加有效量的除草剂转基因植物已被诱导成雄性不育性。在一个实例中，除草剂是草甘膦，并且其在发育期间以约0.125磅酸当量/英亩至约8磅酸当量/英亩的有效量施加。
[0077]
实施例
[0078]
以下实施例描述对杂交种子生产进行的优于本领域提供的那些的改进。此类改进包括用于重组dna分子和转基因植物的新颖mts-sirna靶标和mts-sirna靶元件，其用于提供早期花粉发育停滞，从而导致在广泛的种质中不存在有活力的花粉粒，以及相关的使用方法。提供以下实施例来展示本发明的实施方案。
[0079]
实施例1：mts-sirna靶标的鉴定
[0080]
从玉蜀黍雄穗的四个单独的生长阶段和玉蜀黍雌穗的三个单独的生长阶段分离小rna。参见表1。雄穗富含的小rna在非常早的雄穗发育阶段(v7、v8/v9、v10/v11和v12)分离(参见图1)。这产生了来自比本领域先前用于获得雄穗富含的小rna序列的雄性组织更幼的雄性组织的小rna。
[0081]
使用分离的小rna制备小rna文库，并对文库进行高通量小rna测序。使用生物信息学分析将这些雄穗和雌穗文库中的序列与从其他玉蜀黍组织制备的小rna文库中的序列进行比较，所述其他玉蜀黍组织包括在各个生长阶段收集的叶、整棵幼苗、在各个生长阶段收集的根、胚乳和子粒。这种差异性生物信息学分析鉴定了数千个雄穗富含的小rna序列，其归一化表达范围为10至665个转录物/四分之一百万序列(tpq)。鉴定的雄穗富含的小rna序列很可能是sirna，这是因为其长度(18-26个核苷酸)以及其来自dsrna前体的预期来源。由于雄性组织特异性，这些雄穗富含的小rna在本文中称为雄性组织特异性sirna(mts-sirna)。
[0082]
表1.雄穗和雌穗小rna文库的描述
[0083][0084]
使用实时pcr方法鉴定并确认mts-sirna序列在雄穗中特异性表达。从表1所示出的组织中提取总rna(包括富含的小rna)，并且将其用于用逆转录引物合成cdna，所述逆转录引物由在3'端的与mts-sirna序列互补的8个nt和在5’端的35个nt的通用序列组成。在cdna合成后，进行实时pcr，其中一个正向引物的序列(14至18个nt)与mts-sirna序列的5’端相同，并且反向引物是通用引物。作为内部对照，扩增18s rna，并切将其用于使mts-sirna水平归一化。来自实时pcr的数据被用来缩小雄穗中富含的mts-sirna序列的数目。
[0085]
使用由lc sciences llc(houston,texas,美国)提供的微流体芯片和选自由差异性生物信息学分析鉴定的数千个mts-sirna序列的1,200个序列进行sirna表达谱微阵列分析。微阵列芯片含有1,200个mts-sirna序列中的每一个的互补序列的一式三份探针。从来自lh244(atcc保藏号pta-1173)或01dkd2(i294213)(atcc保藏号pta-7859)近交植物的26个玉蜀黍组织库(一式两份或三份组织库)中纯化总rna。参见表2。将26个rna样品中的每一个与包含针对1,200个mts-sirna的探针的微阵列芯片杂交。使用4000b激光扫描仪(molecular devices,sunnyvale,ca)收集杂交图像，并且使用array-分析仪图像分析软件(media cybernetics,rockville,md)进行数字化。相对信号值通过背景减除和归一化来导出。差异表达信号通过t检验确定，其中p《0.05。根据微阵列分析，1,200个中约500个mts-sirna被鉴定为高度雄穗特异性的。
[0086]
表2.微阵列测定中使用的组织样品的描述。
[0087]
no:1和seq id no:2表示的mts-sirna靶元件。对于两种种质lh244和01dkd2，在v8-v9雄穗和v10-v12雄穗中针对这些mts-sirna序列的信号比其他组织样品的针对这些mts-sirna序列的信号更高。表3中显示的微阵列结果表明，本文中提供为seq id no:17的cdna序列可以用作来源以设计用于重组dna分子的mts-sirna靶元件。
[0092]
表3.针对seq id no:17的cdna的微阵列结果
[0093][0094][0095]
表4显示比对到本文中提供为seq id no:18的cdna序列的代表性mts-sirna序列(本文中提供为seq id no:32-38)的相对微阵列信号结果，所述cdna序列包含由seq id no:3表示的mts-sirna靶元件。对于种质lh244，在v8-v9雄穗和v10-v12雄穗中针对这些mts-sirna序列的信号比其他组织样品的针对这些mts-sirna序列的信号更高。对于种质01dkd2，在v10-v12雄穗中针对这些mts-sirna序列的信号比v8-v9雄穗或其他组织样品的针对这些mts-sirna序列的信号更高。
[0096]
表4.针对seq id no:18的cdna的微阵列结果
[0097]
[0098]
表5显示比对到本文中提供为seq id no:18的cdna序列的代表性mts-sirna序列(本文中提供为seq id no:39-42)的相对微阵列信号结果，所述cdna序列包含由seq id no:4表示的mts-sirna靶元件。对于种质lh244，在v8-v9雄穗和v10-v12雄穗中针对mts-sirna序列的信号比其他组织样品的针对这些mts-sirna序列的信号更高。对于种质01dkd2，在v10-v12雄穗中针对mts-sirna序列的信号比v8-v9雄穗或其他组织样品的针对这些mts-sirna序列的信号更高。表4和表5中显示的微阵列结果表明，本文中提供为seq id no:18的cdna序列可以用作来源以设计用于重组dna分子的mts-sirna靶元件。
[0099]
表5.针对seq id no:18的cdna的微阵列结果
[0100][0101]
表6显示比对到本文中提供为seq id no:19的cdna序列的代表性mts-sirna序列(本文中提供为seq id no:43-46)的相对微阵列信号结果，所述cdna序列包含由seq id no:5表示的mts-sirna靶元件。对于种质lh244，在v8-v9雄穗和v10-v12雄穗中针对mts-sirna序列的信号比其他组织样品的针对这些mts-sirna序列的信号更高。对于种质01dkd2，在v10-v12雄穗中针对mts-sirna序列(seq id no:43-44)的信号比v8-v9雄穗或其他组织样品的针对这些mts-sirna序列的信号更高；并且与其他组织相比，在v8-v9雄穗和v10-v12雄穗中针对mts-sirna序列seq id no:45-46)的信号均比针对这些mts-sirna序列的信号更高。
[0102]
表6.针对seq id no:19的cdna的微阵列结果
[0103][0104]
表7显示比对到本文中提供为seq id no:19的cdna序列的代表性mts-sirna序列(本文中提供为seq id no:47-52)的相对微阵列信号结果，所述cdna序列包含由seq id no:6表示的mts-sirna靶元件。对于种质lh244，在v8-v9雄穗和v10-v12雄穗中针对mts-sirna序列的信号比其他组织样品的针对这些mts-sirna序列的信号更高。对于种质01dkd2，在v10-v12雄穗中针对mts-sirna序列的信号比在v8-v9雄穗或其他组织样品中针对这些mts-sirna序列的信号更高；与其他组织样品的针对mts-sirna序列(seq id no:47和seq id no:48)的信号相比，在v8-v9雄穗中针对这些mts-sirna序列的信号适度地更高；与其他组织样品的针对mts-sirna序列(seq id no:52)的信号相比，在v8-v9雄穗中针对这
个mts-sirna序列的信号显著更高；并且针对mts-sirna序列(seq id no:49、seq id no:50和seq id no:51)的信号未明显不同于其他组织样品的针对这些mts-sirna序列的信号。表6和表7中显示的微阵列结果表明，本文中提供为seq id no:19的cdna序列可以用作来源以设计用于重组dna分子的mts-sirna靶元件。
[0105]
表7.针对seq id no:19的cdna的微阵列结果
[0106][0107]
表8显示比对到本文中提供为seq id no:20的cdna序列的代表性mts-sirna序列(本文中提供为seq id no:53-60)的相对微阵列信号结果，所述cdna序列包含由seq id no:7表示的mts-sirna靶元件。对于两种种质lh244和01dkd2，在v8-v9雄穗和v10-v12雄穗中针对这些mts-sirna序列的信号比其他组织样品的针对这些mts-sirna序列的信号更高。表8中显示的微阵列结果表明，本文中提供为seq id no:20的cdna序列可以用作来源以设计用于重组dna分子的mts-sirna靶元件。
[0108]
表8.针对seq id no:20的cdna的微阵列结果
[0109][0110]
表9显示比对到本文中提供为seq id no:21的cdna序列的代表性mts-sirna序列(本文中提供为seq id no:61-69)的相对微阵列信号结果，所述cdna序列包含由seq id no:8表示的mts-sirna靶元件。对于两种种质lh244和01dkd2，在v8-v9雄穗和v10-v12雄穗中针对mts-sirna序列的信号比其他组织样品的针对这些mts-sirna序列的信号更高。表9中显示的微阵列结果表明，本文中提供为seq id no:21的cdna序列可以用作来源以设计用于重组dna分子的mts-sirna靶元件。
[0111]
表9.针对seq id no:21的cdna的微阵列结果
[0112][0113][0114]
表10显示比对到本文中提供为seq id no:22的cdna序列的代表性mts-sirna序列(本文中提供为seq id no:70-87)的相对微阵列信号结果，所述cdna序列包含由seq id no:9表示的mts-sirna靶元件。对于种质lh244，在v8-v9雄穗和v10-v12雄穗中针对mts-sirna序列(seq id no:70、71、73、75-81、83-87)的信号比其他组织样品的针对这些mts-sirna序列的信号更高；在其他组织中针对mts-sirna序列(seq id no:72、74、82)的信号比在v8-v9雄穗和v10-v12中针对这些mts-sirna序列的信号更高。对于种质01dkd2，在v10-v12雄穗中针对mts-sirna序列(seq id no:70-87)的信号比在v8-v9雄穗或其他组织样品中针对这些mts-sirna序列的信号更高。表10中显示的微阵列结果表明，本文中提供为seq id no:22的cdna序列可以用作来源以设计用于重组dna分子的mts-sirna靶元件。
[0115]
表10.针对seq id no:22的cdna的微阵列结果
[0116]
[0117][0118]
这些分析确认了六个cdna序列(seq id no:17-22)富含mts-sirna靶序列并且对应的mts-sirna显示高的雄穗特异性。因此，这些cdna序列含有可使用分子生物学方法用于产生重组dna分子的序列，所述重组dna分子含有可赋予mts-sirna介导的转基因沉默的mts-sirna靶元件。
[0119]
对通常在混合杂交中用作雌性的三十二种不同的玉蜀黍种质(相对成熟度(rm)在80至120天范围内)进行含有mts-sirna靶元件的对应基因组序列的分析，以确认mts-sirna靶元件的存在和任何序列变异。对于提供为seq id no:1和seq id no:2的mts-sirna靶元件，设计了三组热扩增引物对，以扩增在本文中提供为seq id no:17的cdna序列内的对应序列。这些引物被用于产生从每种种质的组织中提取的基因组dna的pcr扩增子。从所有测试的种质产生扩增子。三十二种种质中的扩增子的序列与mts-sirna靶元件序列100％相同或含有最少数量的单核苷酸多态性(高达95％相同)。这些数据表明，用包含可操作地连接至提供为seq id no:1或seq id no:2的mts-sirna靶元件、编码重组蛋白的转基因的重组dna构建体产生的转基因植物将具有对大多数玉蜀黍种质中的重组蛋白的表达的雄性组织特异性调控。如果转基因编码赋予草甘膦耐受性的重组蛋白，则大多数玉蜀黍种质中的雄穗将具有草甘膦诱导的雄性不育性。
[0120]
实施例2：重组dna构建体和植物转化载体
[0121]
使用对应于六个cdna序列的鉴定为富含mts-sirna靶序列的区域的dna序列来产生重组dna构建体和植物转化载体。重组dna构建体和植物转化载体被设计为可用于产生转基因植物，其中可操作地连接至mts-sirna靶元件的转基因的雄穗特异性沉默将通过mts-sirna介导的沉默发生。
[0122]
利用六个cdna序列的分析结果设计了九个mts-sirna靶元件。每个mts-sirna靶元件被设计为具有包含可以结合不同mts-sirna的许多重叠的mts-sirna靶序列的dna序列。本文中提供为seq id no:1的mts-sirna靶元件序列与本文中提供为seq id no:17的cdna序列的核苷酸位置1429至1628具有95％序列同一性。本文中提供为seq id no:2的mts-sirna靶元件序列相对于seq id no:1具有单个nt变化(t69a)。本文中提供为seq id no:3的mts-sirna靶元件序列对应于本文中提供为seq id no:18的cdna序列的核苷酸位置239至433。本文中提供为seq id no:4的mts-sirna靶元件序列对应于本文中提供为seq id no:18的cdna序列的核苷酸位置477至697。本文中提供为seq id no:5的mts-sirna靶元件
序列对应于本文中提供为seq id no:19的cdna序列的核苷酸位置239至433。本文中提供为seq id no:6的mts-sirna靶元件序列对应于本文中提供为seq id no:19的cdna序列的核苷酸位置370至477。本文中提供为seq id no:7的mts-sirna靶元件序列对应于本文中提供为seq id no:20的cdna序列的核苷酸位置1357至1562。本文中提供为seq id no:8的mts-sirna靶元件序列对应于本文中提供为seq id no:21的cdna序列的核苷酸位置247至441。由seq id no:9表示的mts-sirna靶元件的反向补体与本文中提供为seq id no:22的cdna序列的核苷酸位置191至490具有99％序列同一性，其中seq id no:22相对于seq id no:9的反向补体的序列具有三个nt错配(c314a、a350g和g408a)。另外的mts-sirna靶元件可以通过以下方式产生：将不同mts-sirna靶元件或两个或更多个富含mts-sirna靶标的cdna区域的片段的dna序列相组合，例如通过将本文中提供为seq id no:1-9的mts-sirna靶元件中的两个或更多个的全部或片段和/或本文中提供为seq id no:23-92的mts-sirna序列中的一个或多个相组合。将这些mts-sirna靶标元件的长度范围为21至170个核苷酸的不同片段相组合，并且新的mts-sirna靶元件使用本领域已知的dna合成方法产生并且提供为seq id no:10-16。
[0123]
将mts-sirna靶元件亚克隆到重组dna构建体中，其中mts-sirna靶元件可操作地连接至编码针对草甘膦耐受性的cp4-epsps蛋白的cp4-epsps基因(seq id no:93)的开放阅读框的3'端，并且可操作地连接至可操作连接的3'-非翻译区(3'-utr)的5’。重组dna构建体还包含三种不同启动子/内含子/增强子组合之一和叶绿体转运肽序列的可操作连接的组合。表达盒配置包含在用于测试mts-sirna靶标有效性的转化载体中。
[0124]
实施例3：植物转化和效力测试
[0125]
将含有重组dna构建体的转化载体与基于土壤杆菌的转化方法和玉蜀黍未成熟胚以及本领域已知的技术一起使用。收集r0植物的叶样品并进行分子分析以选择含有重组dna构建体的单拷贝(一个插入序列)或双拷贝(两个独立的插入序列)且不存在载体骨架的转基因植物。单拷贝事件没有喷洒草甘膦并进行自交和生长以进行r1种子收集，而双拷贝事件用于r0草甘膦喷洒以评估营养性耐受性和诱导的雄性不育性。如通过亚历山大染色和显微镜观察确定的，没有喷洒草甘膦的转基因植物具有正常的开花期、正常的花粉散落和正常的花粉发育。
[0126]
在测试中使用双拷贝r0事件来模拟单拷贝纯合子事件。在两个不同生长阶段用草甘膦喷洒植物，以确定重组dna构建体中mts-sirna靶元件的存在是否提供了营养性草甘膦耐受性和草甘膦诱导的雄穗不育性。将植物喷洒在温室中，在v5阶段处施加1x草甘膦(0.75lb ae/英亩)，然后在v8阶段处施加1x草甘膦(0.75lb ae/英亩)。在v5阶段草甘膦施加后7天，对植物进行营养损伤评分，其中认为伤害损伤评分≤10％显示出了营养性草甘膦耐受性(营养性耐受性％)。用两种方法测量雄性不育性。在v8阶段草甘膦施加后对显示出营养性草甘膦耐受性的植物针对如无花药挤出至s90 12阶段所测量的完全的草甘膦诱导型雄性不育性(完全雄性不育性％)进行评分。然后收集花药并将其切开，以显微观察花粉发育。针对无有活力花粉粒产生(如通过亚历山大染色在显微镜观察下检测的)对每个事件的花药都进行了测试，并且记为不产生任何有活力花粉(无花粉％)。在没有喷洒草甘膦的植物中，雄穗发育、花药挤出和花粉发育是正常的。
[0127]
mts-sirna靶元件在多种转化载体配置中进行测试。每个转化载体用于产生多个
r0植物，每个r0植物代表使用相同转化载体制备的独特转基因事件。以表11和12的形式提供了三种不同的转换载体配置的数据。
[0128]
在第一载体配置(a)中测试十二个mts-sirna靶元件，结果示出在表11中。令人惊讶的是，显示营养性草甘膦耐受性的植物的百分比的范围为80％-100％，但显示完全的草甘膦诱导型雄性不育性的百分比(诱导的雄性不育性包括无活力花粉和无花粉生产)的范围为0％-100％。参见表11。例如，使用含有由seq id no:13、seq id no:14或seq id no:15编码的mts-sirna靶元件的转化载体产生的植物中高数量显示营养性草甘膦耐受性(范围为测试植物的90％-100％)，但是没有转基因事件显示出完全的草甘膦诱导型雄性不育性；使用含有由seq id no:5或seq id no:9编码的mts-sirna靶元件的转化载体产生的植物中高数量显示营养性草甘膦耐受性(范围为测试植物的90％-100％)，并且中等数量显示出草甘膦诱导型雄性不育性(范围为测试植物的50％-40％)；并且使用含有由seq id no:2、seq id no:7或seq id no:8编码的mts-sirna靶元件的转化载体产生的植物中高数量显示营养性草甘膦耐受性(范围为测试植物的88％-100％)，并且高数量显示出草甘膦诱导型雄性不育性(范围为测试植物的82％-100％)。通过亚历山大染色评估花粉发育。用含有提供为seq id no:2的mts-sirna靶元件的转化载体产生并且喷洒草甘膦以诱导雄性不育性的含有四个事件的植物显示出非常少的发育不全的花粉粒或未检测到花粉粒。没有接受草甘膦施加的植物具有正常的花粉。参见图4。
[0129]
表11.对r0植物的评价。
[0130][0131]
在第二载体配置和第三载体配置(分别为b和c)中测试四个其他的mts-sirna靶元件，结果示出在表12中。在两个载体配置之间观察到在显示出营养性草甘膦耐受性的植物百分比和显示出完全的草甘膦诱导型雄性不育性的百分比上的差异。载体配置b提供了针对所有测试的mts-sirna靶元件显示出营养性草甘膦耐受性的植物的增加百分比。对于显示出完全的草甘膦诱导型雄性不育性而言，两个测试的mts-sirna靶元件(seq id no:10和seq id no:11)在载体配置c中表现较佳，一个mts-sirna靶元件(seq id no:12)在载体配置b中执行较佳，并且一个mts-sirna靶元件(seq id no:1)在配置b和c中均提供100％的完全的草甘膦诱导型雄性不育性。
[0132]
表12.对r0植物的评价
[0133][0134][0135]
在显示出营养性草甘膦耐受性的植物中，具有无活力花粉的草甘膦诱导型雄性不育性植物的百分比的范围为0％-100％。对于使用使得具有大于60％的测试植物显示出营养性草甘膦耐受性和完全的草甘膦诱导型雄性不育性的转化载体产生的植物，具有无活力花粉的植物百分比的范围为0％-100％。两个mts-sirna靶元件(载体配置b中的seq id no:1和载体配置a中的seq id no:2)分别具有100％和82％的无活性花粉。这两个mts-sirna靶标元件(seq id no:1和seq id no:2)相差一个核苷酸并且来源于相同的cdna序列(seq id no:17)。
[0136]
实施例4.cp4-epsps蛋白在雄穗中的免疫定位
[0137]
cp4-epsps蛋白在转基因植物的雄穗中的免疫定位用于分析细胞和组织水平下的蛋白质表达，以确认由于可操作地连接的mts-sirna靶元件的存在导致的花粉中cp4-epsps蛋白表达的丧失。使含有可操作地连接至seq id no:1的cp4-epsps转基因或作为对照无可操作连接的mts-sirna靶元件的cp4-epsps转基因的r3代转基因植物在温室中生长。在v2阶段用1x草甘膦(0.75lb ae/ac)喷洒植物以确认营养性耐受性。当花药组织处于小孢子母细胞和游离小孢子阶段时，在v8至v12阶段处收获1cm至17cm的雄穗。使用解剖镊子从雄穗小穗中去除花药并且立即在柔和真空下固定在含3.7％的甲醛的磷酸缓冲盐水溶液(pbs)中。在pbs中洗涤过后，将组织放置在包埋介质中并且立即冷冻。将冷冻的组织块储存在-80℃下，直至在-20℃切片机中切片，并收集在电化载玻片上。
[0138]
用封闭剂(10％正常山羊血清、5％牛血清白蛋白、0.1％triton x-100的pbs溶液)封闭组织切片2小时。用抗cp4-epsps抗体(在pbs中1/500)孵育切片。在pbs中将切片洗涤三次之后，用二级抗体，缀合有alexa488的山羊抗小鼠igg(invitrogen,eugene,oregon)孵育组织切片。通过省去cp4-epsps抗体孵育来制备阴性对照。一级抗体与二级抗体都在室温下孵育2至4小时，然后在4℃下进一步孵育过夜。洗涤之后，用zeiss激光扫描显微镜(lsm)510meta共聚焦显微镜，使用488nm激光用于激发和500-550nm(绿色通道)用于发射滤光片组使组织成像。在包括对照的样品中应用了相同的成像参数。从每个切片都扫描到了发荧光且亮视野的图像，并且随后使用lsm软件将所述图像合并以示出结构信息。阴性对照的数据示出了预期的信号缺失。对于含有可操作地连接至seq id no:1的cp4-epsps转基因的转基因植物的数据显示出低荧光信号，这表明在花药的花药壁、绒毡层和发育的花粉小孢子中的低cp4-epsps蛋白质表达。对于对照转基因植物(含有无可操作地连接的cp4-epsps转基因的那些)的数据显示出高荧光信号，这表明在花药的花药壁、绒毡层和发育的
花粉小孢子中的高cp4-epsps蛋白质表达。
[0139]
在含有可操作地连接至提供为seq id no:1的mts-sirna靶元件的cp4-epsps转基因的植物的花粉中cp4-epsps蛋白质表达的丧失与在这些植物中观察到的完全的草甘膦诱导型雄性不育性相关。这个数据确认了观察到的完全的草甘膦诱导型雄性不育性是花粉中cp4-epsps蛋白质表达丧失的结果，所述丧失是由于提供为seq id no:1的可操作连接的mts-sirna靶元件的存在。
[0140]
实施例5.田间试验
[0141]
为了在杂交生产中最佳使用，希望在除草剂施加与营养性除草剂耐受性(如通过低作物损伤测量的)的组合之后，在田间条件下具有非常低的花药挤出。杂交玉米生产的其他方面，诸如植物高度和产量也是所希望的。为了评估这一点，在田间条件下在后生世代测试了包含可操作地连接至mts-sirna靶元件的cp4-epsps转基因的转基因植物，并且测量了多个参数。
[0142]
在多个位置处进行含有可操作地连接至提供为seq id no:1的mts-sirna靶元件的cp4-epsps转基因的r3代植物的田间试验以评估营养性草甘膦耐受性和雄穗特异性草甘膦敏感性。田间试验测试了在不同基因组位置处含有相同转基因插入序列的r3代植物。所测试的植物含有使用相同植物转化载体产生的四个独特转基因事件中的一个的单拷贝，所述植物转化载体含有可操作地连接至提供为seq id no:1的mts-sirna靶元件的cp4-epsps转基因。使用随机化完整的模块设计进行试验。在整个田间试验季节对多个性状效力和农艺学参数进行评分，并且在所述季节结束时测定产量。通过以下方式进行性状效力田间试验：在v7处施加0.75lb ae/ac草甘膦除草剂，然后在v9处施加0.75lb ae/ac，并且评定vt阶段处的作物损伤百分比(cipvt)、s90 8阶段处的平均花药挤出百分比(aes9e)和季节结束时的产量(作为蒲式耳/英亩(bu/acre)测量的)。田间试验包括草甘膦耐受性转基因事件nk603(atcc保藏号pta-24780)以作为草甘膦诱导型雄性不育性的阴性对照并作为营养性草甘膦耐受性的阳性对照。含有nk603事件的植物表现出商业水平的营养性草甘膦耐受性，并且产生完全的草甘膦耐受性雄穗。所有数据均进行在p《0.05下分割的方差和平均值的分析(lsd)。
[0143]
表13.用含有seq id no:1的植物的田间试验的性状效力结果
[0144]
事件cipvtaes9enk603对照1.2595.00事件11.250事件23.753.25事件304.00事件401.75
[0145]
对于含有nk603事件的vt阶段处平均作物损伤为1.25。对于含有事件1、事件2、事件3和事件4的植物的平均作物损伤分别为1.25、3.75、0和0。对于所有测试事件，在0.05下的作物损伤最小显著差异(lsd)为10.25。这些结果表明，当在v7处然后在v9处施加0.75lb ae/ac草甘膦时，包含含有mts-sirna靶元件seq id no:1的四个转基因事件的植物具有零至非常低的营养损伤，这与含有nk603事件的对照植物类似。
[0146]
对于含有nk603事件的s90 8阶段处平均花药挤出为95。对于含有事件1、事件2、事
件3和事件4的植物的s90 8处平均花药挤出分别为0、3.25、4和1.75。对于所有测试事件，在0.05下的s90 8处平均花药挤出lsd为42.71。这些结果表明，当在v7处然后在v9处施加0.75lb ae/ac草甘膦时，包含含有mts-sirna靶元件seq id no:1的四个转基因事件的植物具有零至非常低的花药挤出，这与含有nk603的对照植物大不相同，所述对照植物在草甘膦施加之后完全雄性能育。
[0147]
在季节结束时从这些田间试验收获玉蜀黍并且测定产量。对于含有nk603事件的对照植物的平均产量为96.74bu/ac。对于含有事件1、事件2、事件3和事件4的植物的平均产率分别为102.17bu/ac、96.48bu/ac、97.59bu/ac和95.8bu/ac。对于所有测试事件，在0.05下产率lsd为26.25bu/ac。参见表14。这些结果表明包含含有mts-sirna靶元件seq id no:1的四个转基因事件的植物具有与nk603同等的产量。
[0148]
表14.用含有seq id no:1的植物的田间试验的产量结果
[0149]
事件平均产量(bu/ac)nk603对照96.74事件1102.17事件296.48事件397.59事件495.8
[0150]
在多个位置处进行含有可操作地连接至各种mts-sirna靶元件的cp4-epsps转基因的r2代或更高代近交植物的田间试验以评估营养性草甘膦耐受性和雄穗特异性草甘膦敏感性。田间试验测试了包含可操作地连接至mts-sirna靶元件seq id no:1、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7或seq id no:8的cp4-epsps转基因的单拷贝的r2代或更高代近交植物，每个mts-sirna靶元件在转化载体配置a中。使用组块设计进行试验，其中分组因子是转化载体或转化载体组(如果对于特定转化载体事件数是低的)。在整个田间试验季节对多个性状效力和农艺学参数进行评分，并且在所述季节结束时测定产量。性状效力田间试验通过以下方式进行：向v2玉米以1.5lb ae/ac施加草甘膦，然后向v8玉米(875生长度天数)以0.75lb ae/ac施加草甘膦，然后然后向v10玉米(1025生长度天数)以0.75lb ae/ac施加草甘膦。评定vt阶段处的作物损伤百分比(cipvt)、s90 8阶段处的平均花药挤出百分比(aes90 8)、平均植物高度(英寸)和季节结束时的产量(作为蒲式耳/英亩(bu/acre)测量的)。田间试验包括草甘膦耐受性转基因事件nk603以作为草甘膦诱导型雄性不育性的阴性对照并作为营养性草甘膦耐受性的阳性对照。在每三分之一小区和在整个试验周围放置由三个杂交种质背景组成的雄性授粉者的草甘膦耐受性混合物以充当测试条目的花粉来源。除草剂处理使用co2背负式或拖拉机悬挂式喷雾器施加，对所述喷雾器进行校准以使用吸入空气式的tti喷嘴(teejet technologies,springfield,il)以水作为除草剂载体递送15加仑/英亩(gpa)。所有数据均进行在p《0.05下分割的方差和平均值的分析(lsd)。结果在表15中提供。
[0151]
对于含有mts-sirna靶元件seq id no:1、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7或seq id no:8的测试植物，与对照nk603相比未看到vt处作物损伤百分比(cipvt)或平均植物高度方面的显著差异。与对照nk603相比，含有mts-sirna靶元件seq id no:1、seq id no:5、seq id no:6或seq id no:7的植物在种子产量方面也没有显著减少。
含有mts-sirna靶元件seq id no:1或seq id no:7的植物具有非常低或没有花药挤出，其中aes90 8值分别为0％-2.75％和0％-1.5％。与对照植物相比，含有mts-sirna靶元件seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6或seq id no:8的植物具有显著减少的花粉挤出，其中aes90 8值的范围为10％至25％。
[0152]
表15.相同转化载体配置a中的不同mts-sirna
[0153][0154]
实施例6.杂交种子产生
[0155]
本发明的转基因植物和种子可以用于育种目的，包括用于杂交种子产生中。将包含含有可操作地连接至mts-sirna靶元件、编码草甘膦耐受性epsps蛋白的转基因的重组dna构建体的转基因玉蜀黍植物种植在诸如开阔田地的区域中。其他亲本玉蜀黍植物可以或可以不存在于同一区域中。对于种子生产期间的杂草控制，可以按照农业产品标签上所指示在营养阶段向转基因玉蜀黍植物施加草甘膦。
[0156]
杂交种子产生可以通过在雄穗发育前不久或期间(在范围为v7至v13的营养生长阶段处)将草甘膦施加至转基因玉米植物(雌性)来进行。草甘膦施加将通过转基因玉蜀黍植物中的组织选择性草甘膦耐受性产生诱导的雄性不育性表型。诱导的雄性不育性转基因玉蜀黍植物可以通过其他花粉供体植物(雄性)授粉，从而产生携带针对组织选择性草甘膦耐受性的重组dna构建体的有活力玉蜀黍种子。花粉供体植物可以或可以不存在于同一区域，并且可以是或可以不是转基因玉蜀黍植物。授粉可以通过本领域已知的任何手段完成，包括通过植物的临近放置或通过人工授粉。从转基因玉蜀黍植物收获杂交种子。
[0157]
已经示出和描述本发明的原则，本领域技术人员显而易知本发明可在安排和细节上改进而不背离这些原则。我们要求在所附权利要求书的精神和范围内的所有改进。